出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
3、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌
↓36±1℃,48±2h
↓44.5±0.5℃,24±2h
————————
———————
↓
↓
↓
↓
浑浊，产气
不产气 浑浊，产气 不产气：粪大肠菌群阴性
查MPN表
大肠菌群阴性 查MPN表
报告大肠菌群
报告粪大肠菌群
的MPN值
的MPN值
大肠菌群计数检验的操作
MPN法
LST不产气（-） 小导管里无气泡
LST产气（+）
36℃±1 ℃ 培养24h
加入 Kovacs氏试剂
接触面红色，阳性
甲基红反应(MR)
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖 过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的 途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大 量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使 甲基红指示剂变红。
VRBA平板计数法
选择15~150平 板计数典型和
可疑菌落
36℃±1 ℃ 18h ~24h
典型菌落为紫红色 周围有红色胆盐沉
淀环，0.5mm
挑选10个菌落 接种到BGLB
结果报告
经最后证实大肠菌群阳性的BGLB试管比 例乘以VRBA菌落数再乘以稀释倍数，即为每 克（毫升）样品中大肠菌群数。 如：稀释倍数10-3 ,吸取样品稀释液1ml
大肠菌群和粪大肠菌群的检测流程图 MPN法
检样25g
↓
稀释（三个连续的稀释度，如10-1，10-2，10-3）
↓
接种（每个稀释度接种3管LST，每管1ml）
↓ 36±1℃,48±2h
——————————————
↓
↓
浑浊，产气
不产气
↓
报告大肠菌群阴性
出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法
出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法1.仪器和设备1. 1恒温培养箱：36 ± 1 C1. 2恒温水浴箱：44.5 ± 1C1. 3高压灭菌锅1. 4均质器1. 5 试管:18 x 150mm 18 x 180mm1. 6 锥形瓶:500ml 250ml1. 7平皿：直径为90mm1. 8灭菌均质杯1. 9灭菌吸管1. 10酒精棉1.11天平：感量0.1g1.12 冰箱：0-4 C 和-15 〜-20 C1.13显微镜2.培养基的制备2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤称35.6g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18 x 180mm试管中，每管10ml，于121 C高压灭菌15min。
2.2煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB称40g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18x 180mm 试管中，每管10ml, 121 C高压灭菌15min。
2.3EC肉汤称37g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18x 180mm 试管中，每管吸8ml, 121 C高压灭菌15min。
2.4伊红美蓝琼脂（EMB称37.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于三角烧瓶，121 C高压灭菌15min。
摇匀冷却至45 C倾注平皿。
2.5营养琼脂称33g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，121 C高压灭菌15min。
制成斜面备用。
2.6生理盐水称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，分装锥形瓶和18x 150mm试管内，121 C高压灭菌15min。
2.7成品生化管2.7.1 色氨酸肉汤2.7.2 MR-VP 2.7.3 Koser 氏枸橼酸盐琼脂2.7.4 革兰氏染色试剂盒2.7.5 Kovacs 氏靛基质试剂2.7.6甲基红指示剂2.7.7 V-P 试剂甲液和乙液3.操作步骤3.1样品的稀释和培养3.4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化实验。
食品卫生微生物学检验 大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌计数
大肠菌群计数：第一法 6 操作步骤
6.2 初发酵实验 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液，液体 样品可以包括未经稀释的原液，每个稀释度接种三管月桂基硫酸 盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL， 则用双料LST肉汤）。36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有气 泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细小气泡从管底逸出，如 未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管 数。未产气者为大肠菌群阴性；对产气者，则进行复发酵试验。
食品卫生微生物学检验 大肠杆菌计数
Microbiological examination of food hygiene -Enumeration of Escherichia coli
大肠菌群计数
大肠菌群
定义：一群在36℃条件下培养24~48小时能发酵乳糖、产酸 产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 卫生学概念，包括埃希氏菌属，克雷伯氏菌属、肠杆菌属 和柠檬酸杆菌属等的细菌 检验比较简单，所以被广泛用做水源的卫生指标和食品加 工卫生状况的通用指标
Microbiological examination of food hygiene -Enumeration of Coliforms
食品卫生微生物学检验 粪大肠菌群计数
Microbiological examination of food hygiene -Enumeration of faecal coliforms
℃± 1 ℃ 36 36℃
验
24h~ 48h
报告结果
大肠菌群计数
大肠菌群计数
大肠菌群计数
第一法
MPN法
第二法 平板计数法 第三法 Petrifilm测试片法
MMFSCNJ出口食品中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
MM_FS_CNJ_03出口食品大肠菌群粪大肠菌群大肠杆菌测定MM_FS_CNJ_0334出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法1. 适用范围本方法适用于出口食品的检验。
2. 主要试剂和仪器. 主要试剂（包括培养基）月桂基硫酸盐胰蛋白月示（LST肉汤；煌绿乳糖胆盐（BGLB肉汤；EC肉汤；伊红美蓝琼脂（EMB）；营养琼脂斜面；色氨酸肉汤；MR-VP培养基；Korser 氏枸椽酸盐肉汤；结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）；Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液；生理盐水；革兰氏染色液；Kovacs 氏靛基质试剂；甲基红指示剂；Voges— pros kauer （V-P）试剂。
. 仪器吸管：1mL具刻度；5mL和10mL具1mL刻度；水浴箱：±C；培养箱：36 ±1 °C, 土°C；冰箱：0〜5C和—15〜—20C；均质器；乳钵和研棒；平皿：直径90mm；天平：感量；显微镜；稀释瓶：100mL 200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶；玻璃珠：直径约5mm；菌落计数器。
3. 过程简述. 样品制备以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15C保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4C冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2〜5C 18h内解冻，或在45C以下15min内解冻。
不同食品样品匀液的制备. 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠），以30cm幅度、于7s内振摇25次（或以机械振荡器振摇），制成1 : 10的样品匀液。
. 固体和半固体食品以无菌操作取样25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r /min 均质1〜2min,制成1 : 10样品匀液（也可用灭菌乳体研磨的方法代替）。
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，女口10〈10 3> 10 4 ........................................... 。
大肠菌群检测
曹双：请综合看看各种方法，比较一下，有些内容是一致的，有些是每种方法不同于其他方法的，注意比较。
第一篇（蓝色部分为说明和附录，去掉这部分剩下的为连续文件）大肠杆菌检验方法SN 0169—92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法GB/T 4789.6—1994食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验（这两个检验方法另有完全的PDF文件，见文件夹）以SN标准方法为例，进行说明。
样品制备：以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。
从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
附：这是一种9管MPN法测定方法，什么是MPN法（最近似法）？MPN法简介发布日期：2010-05-13 浏览次数：212The Most Probable Number Method In the following example, a set of 3 tubes of an all purpose broth medium is inocuThe Most Probable Number MethodIn the following example, a set of 3 tubes of an all purpose broth medium is inoculated from each of the ten-fold dilutions, with each tube being inoculated with one ml.After incubation, the number of tubes showing growth is recorded. As the succeeding dilutions were made, the organisms were diluted to such an extent that none were in the inocula of seven of the tubes (marked negative). In order to estimate the number of organisms per ml of the sample which would cause this kind of growth response, we locate the three sets of tubes which show dilution of the organisms "to extinction" –i.e., those tubes which were inoculated from the 10–2, 10–3 and 10–4 dilutions.附录1g检样中最近似值(MPN)表 (补充件)以0.1、0.01、0.001g各用3管。
MM_FS_CNJ_0349出口食品中大肠杆菌检验方法
出口食品中大肠杆菌（葡萄糖苷酶荧光）检验方法. 适用范围本方法适用于出口食品（不包括贝类）卫生质量地监视和出口前地筛选检验. 主要试剂和仪器. 主要试剂（包括培养基）肉汤：见；琼脂培养基：见；生理盐水：见.. 仪器吸管：和，带刻度；试管：X;稀释瓶：三角瓶或广口瓶；玻璃珠;均质器;水浴箱或培养箱：±c；长波紫外光灯：，功率V •. 样品制备按照第章进行.. 过程简述. 每个样品选三个连续稀释倍数地稀释液，每个稀释倍数地稀释液接种三管肉汤，每管.•将接种管于内放入±0水浴或培养箱内，培养土•. 将各管培养物拿至暗室，在长波紫外光灯照射下观察. 凡显蓝色荧光地为大肠杆菌阳性. 在阳性管上做好标记并记录..从产气而不显荧光地各管取培养物.划线接种琼脂平板，土c培养土.. 将培养后地平板拿至暗室，打开皿盖，在长波紫外光灯照射下观察有无蓝色荧光. 凡显蓝色荧光地，无论其面积大小，均记为原管培养物为大肠杆菌阳性.. 结果计算按管和琼脂平板地大肠杆菌阳性数，查表，报告每克（毫升）样品中大肠杆菌地值.. 来源：附录培养基和试剂（补充件）肉汤胰蛋白月示.或胰酪胨氯化钠乳糖磷酸氢二钾磷酸二氢钾月桂基硫酸钠蒸馏水将各成分溶于蒸馏水中，分装试管（内装倒立小发酵管）.每管.°C高压灭菌. 最终± .琼脂培养基胰酪胨水解蛋白酵母浸膏牛肉浸膏可溶性淀粉氯化钠琼脂蒸馏水将各成分溶于水中，无须调值.C高压灭菌.冷却至〜C,倾注平板.. 生理盐水氯化钠蒸馏水分装于三角瓶或广口瓶，每瓶.C高压灭菌.。
大肠菌群检验方法及操作方法
大肠菌群检验方法及操作方法1、什么是大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。
2、大肠菌群的组成：大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。
3、大肠菌群的测定意义◆粪便污染的指标菌：大肠菌群或粪大肠菌群◆以大肠菌群作为粪便指标菌原因：1)在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。
◆大肠菌群的测定意义：1)判断食品中否受到粪便污染。
2)有利于控制肠道传染病的发生和流行。
3)有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。
4、大肠菌群的生物学特性1 形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。
2 发酵乳糖产酸产气3 培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；4 在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。
5、大肠菌群检验方法及操作方法◆国家标准：◆三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)◆行业标准：◆两步法：推测试验→证实试验表1 大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征MPN法简介Most Probable Number Method最大可能数•对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
•MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
6、粪大肠菌群的检验•粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
•于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌；在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h 内产生吲哚的耐热大肠菌群。
检验方法：7、检验注意事项1）从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
进出口SN标准微生物检测方法之大肠杆菌和大肠菌群计数方法
大肠杆菌和大肠菌群计数方法Enumeration of Escherichia coli and the coliform章节内容：·传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法·LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌（除双壳类软体动物制品外）·瓶装水检测方法·贝类和贝类肉制品检测方法·柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法·大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法·参考文件大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。
大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。
虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。
某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。
1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。
由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。
再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。
与已知的非产气致病菌容易区别开来。
因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。
肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂 。
于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。
1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。
虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。
于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法食品商务网 2005-12-14 12:00:00.0中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0169-92 代替 ZB X09 002一88Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichia coli in food for export1 主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料2.1 吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。
2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：36±1℃,44.5±0.5℃。
2.4 冰箱: 0~5℃和-15~-20℃。
2.5 均质器。
2.6 乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm。
2.8 天平：感量0.1g。
2.9 显微镜。
2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11 玻璃珠：直径约5mm。
2.12 菌落计数器。
3 培养基及试剂3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3 EC 肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5 营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7 MR-VP培养基。
3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11 生理盐水。
3.12 革兰氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基质试剂。
3.14 甲基红指示剂。
3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。
4 样品制备4.1 以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2~5℃ 18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠), 以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。
4.2.2 固体和半固体食品以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1~2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。
从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
5 大肠菌群的测定5.1 大肠菌群MPN值的测定5.1.1 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。
每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。
5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。
如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一步作证实试验。
5.2 大肠菌群的证实试验5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B (补充件)]报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。
6 粪大肠菌群测定6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。
水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。
应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3 记录EC肉汤管的产气情况。
产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4 结果报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。
7 大肠杆菌测定7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。
7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3 如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。
用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18~24h。
7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2~0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。
以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm 试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。
如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。
大肠杆菌为革兰氏阴性。
7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：靛基质 MR VP 枸椽酸盐鉴定(型别)＋＋－－典型大肠杆菌－＋－－非典型大肠杆菌＋＋－＋典型中间型－＋－＋非典型中间型－－＋＋典型产气肠杆菌＋－＋＋非典型产气肠杆菌如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。
7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN 值。
8 大肠菌群固体培养基测定法8.1 样品制备同第4章。
8.2 计数8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。
另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。
8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10~15mL倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。
8.2.3 待琼脂凝固后,再加3~4mL VRBA覆盖平板表层。
8.2.4 翻转平板,置于36±1℃培养18~24h。
8.2.5 选用有30~150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。
菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6 证实8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 36±1℃培养24h和48h,观察产气情况。
8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。
对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
例：10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10**-4/g(mL)＝6.0×10**5/g(mL)附录 A培养基和试剂 (补充件)A1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase) 20g氯化钠 5.0g乳糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g月桂基硫酸钠 0.1g蒸馏水 1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中。
分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH6.8±0.2。
A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200.0mL0.1％煌绿水溶液 13.3mL蒸馏水将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,pH7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。
再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中,每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH7.2±0.1。
A3 EC肉汤胰蛋白(月示)或胰酪(月示) 20.0g3号胆盐或混合胆盐 1.5g乳糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g氯化钠 5.0g蒸馏水 1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。
121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1。
A4 伊红美蓝琼脂(EMB)蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.0g琼脂 15.0g伊红γ(水溶性) 0.4g或2％水溶液20mL美蓝 0.065g或0.5％水溶液13mL蒸馏水 1000.0mL在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。
分装于三角烧瓶中。
每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min。
最终pH7.1±0.2。
使用前将琼脂融化,于每100mL 琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液,摇匀,冷至45~50℃倾注平皿。
A5 营养琼脂斜面牛肉膏 3.0g蛋白胨 5.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000.0mL将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。