第二章各种工具酶.ppt
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06+常用工具酶
从普通大肠杆菌分离出来的质 粒DNA，由于甲基化，难酶切
可选择甲基化酶缺失的大肠 杆菌菌株制备质粒DNA
3.酶切消化反应的温度
大多数RE的最佳反应温度是37°C
实际操作中常采用水浴锅，但由于离心
管底部与顶部温度不同，反应体系会蒸 发，引起酶反应条件改变，可能会造成 酶产生星活力； 酶反应时间较短（2h左右)时可在水浴锅 内进行，如时间较长，最好在培养箱内 进行反应
酶切操作过程： 根据RE说明书，建立酶切反应体系
加样：依次加入水、缓冲液、DNA、酶 混匀 一定温度下保温一定时间 终止反应
电泳检测酶切结果
六、影响限制性酶切反应的因素
1. 2. 3. 4. 5. DNA样品纯度及分子结构 DNA甲基化程度 酶切反应温度 缓冲液 操作注意事项
1.DNA样品的纯度和分子结构：
如:Sam I(CCC GGG)和Xma I(C CCGGG)
同尾酶：不同RE识别不同序列,但切割后能 产生相同的粘性末端，可以连接起来; 如:Bcl I和BamH I
↓
↓
同尾酶：
Bcl I
TGATCA ACTAGT
BamH I
GGATCC CCTAGG
T ACTAG
GATCC G
五、限制性核酸内切酶的反应条件
1962年W.Arber提出细菌限制修饰的原理： 菌体中含有2种以上功能不同的酶； 一种（RE）能识别特定核酸序列，切断外来 DNA分子，限制其繁殖，是菌体的防御系统； 一种（修饰酶）也能识别RE所识别的序列， 其作用是通过使特定碱基甲基化而保护核酸， 避免被RE降解，是菌体的自身保护系统
属名 种名 株名
嗜血流感杆菌d株
Haemophilus influenzae d
可选择甲基化酶缺失的大肠 杆菌菌株制备质粒DNA
3.酶切消化反应的温度
大多数RE的最佳反应温度是37°C
实际操作中常采用水浴锅，但由于离心
管底部与顶部温度不同，反应体系会蒸 发，引起酶反应条件改变，可能会造成 酶产生星活力； 酶反应时间较短（2h左右)时可在水浴锅 内进行，如时间较长，最好在培养箱内 进行反应
酶切操作过程： 根据RE说明书，建立酶切反应体系
加样：依次加入水、缓冲液、DNA、酶 混匀 一定温度下保温一定时间 终止反应
电泳检测酶切结果
六、影响限制性酶切反应的因素
1. 2. 3. 4. 5. DNA样品纯度及分子结构 DNA甲基化程度 酶切反应温度 缓冲液 操作注意事项
1.DNA样品的纯度和分子结构：
如:Sam I(CCC GGG)和Xma I(C CCGGG)
同尾酶：不同RE识别不同序列,但切割后能 产生相同的粘性末端，可以连接起来; 如:Bcl I和BamH I
↓
↓
同尾酶：
Bcl I
TGATCA ACTAGT
BamH I
GGATCC CCTAGG
T ACTAG
GATCC G
五、限制性核酸内切酶的反应条件
1962年W.Arber提出细菌限制修饰的原理： 菌体中含有2种以上功能不同的酶； 一种（RE）能识别特定核酸序列，切断外来 DNA分子，限制其繁殖，是菌体的防御系统； 一种（修饰酶）也能识别RE所识别的序列， 其作用是通过使特定碱基甲基化而保护核酸， 避免被RE降解，是菌体的自身保护系统
属名 种名 株名
嗜血流感杆菌d株
Haemophilus influenzae d
第二章：分子克隆的工具酶
加几个和加哪几个的问题
/techinfo/re/restrdigpcrii.htm
比如设计引物5'端导入酶切位点的时候, 一般导入3–4 个;导入的碱基, 最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡 整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5'形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好). 别的就没什么了.
1. 现象
* 1975 EcoRI切割 phage (Lambda)中的5个 位点，并不是随机的，靠近右端的位点， 比分子中间的位点切割快10倍。
* 有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus）
at 40,386 中央三个快50倍
NEB检测了许多限制酶，有许多酶 的差异在10倍的范围上，但有许多 酶有较大的差异, 如
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
双酶切 PCR产物
AccI HindIII
EcoRI
CCGGTCGACCGG
2hr 20hr 00
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
00 00 10% 75%
GGAATTCC
>90 >90
PstI
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14 CTGCAG(N) 20
第二章 分子克隆工具酶(共73张PPT)
噬菌体T4DNA连接酶
噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为 60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。 此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接 DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性 末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌 DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶那么无 效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶 都不能催化两条游离的DNA链相连接。
2) 反响系统因素
缓冲液〔无菌、无污染〕 buffer 〔pH=8.0〕 ：
50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2
1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml
〔DDT：二硫苏糖醇 BSA： 牛血清蛋白)
NaCL〔0, 500, 1000mM〕
金属离子如：Ⅱ型酶需Mg2+，假设以Mn2+代 替Mg2+〔如HindⅢ，ECORI〕那么特异性改
④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质 粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ 位点〔识别切割位点为 G↓TCGAC〕，该位点也可被 AccⅠ〔识别切割位点为 GT↓MKAC〕和 HincⅡ〔识别切割位点为 GTY↓RAC〕切割。
(3) 同尾酶
有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些 酶称为同尾酶〔isocaudamer)
2.2 种类及作用机理
T4 DNA连接酶(ATP提供能量〕和大肠 杆菌DNA连接酶〔NAD+提供能量〕两 种。
大肠杆菌的DNA连接酶
大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。 对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍 具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反响形 成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促 进磷酸二酯键的形成。
常用工具酶
1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象，就是细菌的 限制（限制酶）-修饰（甲基化酶）系统。
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异 识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在 这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷 甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基 ，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。
CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCG AT AGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT T GGCTA
4.识别位点在DNA分子上出现的频率
推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有 用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶 序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶 切位点就有一次出现机会。据此推算，一条49000bp长的 DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096） 。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现 频率并不均等。
二、连接酶的类型
大肠杆菌DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码Байду номын сангаас，以NAD+作为能源辅助因子； T4 DNA连接酶：由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以 ATP作为能源辅助因子，是基因工程中常用的连 接酶。
三、DNA连接反应的条件
连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合 不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性 末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开，所以通常在 4-15℃连接。
基因工程的工具酶
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
衔接物：指用化学方法 合成的一段由若干个核 苷酸组成的、具有一个 或数个限制酶识别位点 的寡核苷酸片段
四、重组DNA实验的一般程序
a. 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶
（如EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性 末端的线性DNA分子 b. 再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。 c. 混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I） 粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油 作为保护剂，一般在-20℃保存。酶切反应时， 加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘 油浓度过高，影响酶切反应
⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反 应时一般让酶解过夜
⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、
4. Taq DNA聚合酶
5. 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
6. RNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶I
以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到 双链DNA分子的 3’-OH 端而合成新的 DNA.
用途：DNA缺口平移中标记DNA探针
基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
2010-11-8 苏州科技学院生物系 叶亚新
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
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苏州科技学院生物系
叶亚新
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叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
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苏州科技学院生物系
叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
03 工具酶
transformation
S3 DNA聚合酶
SAGE（基因表达系列分析）
影响RE活性的因素
1、DNA的纯度 ——DNA制备时的残余物质抑制RE酶活
如：蛋白质、苯酚、氯仿、 乙醇、EDTA、SDS、NaCl等
1）进一步纯化DNA
2）增加酶量 3）延长酶切时间
4）扩大反应体积——稀释抑制因子
影响RE活性的因素
2、DNA的结构
影响用酶量：超螺旋质粒DNA（或病毒DNA）>线 性DNA 有些酶的切割效率受邻近核苷酸成分影响 保护性碱基
03 工具酶
S1 S2 S3 S4 S5 S6 限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸修饰酶 核酸外切酶 单链核酸内切酶
S1 限制性内切酶
工具酶概述 限制与修饰 RE的命名 限制性内切酶（RE）的类型 II型RE的特性 双酶切、完全酶切、部分酶切 RE的影响因素
工具酶概述
同聚物加尾法
衔接物法
双衔接物法
避免DNA分子自我环化 实现定向克隆 便于从载体上切除
接头法
接头法
热稳定的DNA连接酶
DNA连接酶最适温度：37℃
实际操作温度：4-16℃ 热稳定的DNA连接酶（thermostable DNA ligase）：85℃ ，94℃
连接酶链式反应（LCR） ——指数级扩增靶序列 寡核苷酸连接测定（OLA） ——检测靶序列中的单碱基取代、插入、缺失
识别序列：非回文序列
切割位点：下游5-20bp
应用：SAGE（基因表达系列分析）
（Series Analysis of Gene Expression）
第二章 分子克隆工具酶
2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。
所以把这些酶称之为“工具酶”。
o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。
o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。
o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。
常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。
表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。
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（1）识别序列与特点 双链DNA。未甲基化修饰的靶序列。 识别序列长度4 ~ 8 bp。 多数是回文结构。II s型除外。 （2）酶切位点 在识别位点处，切开双链DNA，形成粘
性末端或平齐末端。
图 Ⅱ类酶识别序列特点：回文序列
(3) 平齐末端 blunt end
EcoR V ：产生平齐末端。 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
限制酶的命名
图 几种重要的限制酶
图 几种限制酶的识别位点
三、限制性内切酶的分类
分为I 型、II型和III型。
1. I 型限制性内切酶
1968年，首先由M. Meselson和R. Yuan 在大肠杆菌 B株和 K株分离。如 EcoB和 EcoK。
（1）识别序列 未甲基化修饰的特异序列：
EcoR I ：5’端凸出
5’-
GAATTC
3’-
CTTAAG
5’-
G AATTC
3’-
CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
Pst I ：3’端凸出
5’-
CTGCAG
-3’
3’-
GACGTC
-5’
5’-
CTGCA
G
-3’
3’-
G
ACGTC
-5’
③粘性末端的意义
连接方便 不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互
2. III 型限制性内切酶
与I型酶有甲基化功能。 能在DNA链上的特异位点切割。 其切割位点在识别位点以外。 反应需要ATP、 Mg2+和S-腺苷蛋氨酸。 基因工程中用途不大。 如EcoP15: CAGCAG------
3. II型限制性内切酶
1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox首先 从流感嗜血菌中分离出HindⅡ 。
(4) 粘性末端 sticky end
含有几个核苷酸的单链末端。 ① 5´端突出 EcoR I ：形成5’-粘性末端。 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ ② 3´端突出 Pst I ：形成3’-粘性末端。 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
二、限制性内切酶的命名
1973年Smith等提出酶的命名原则。
用属名的第一个字母和种名的头两个字 母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌 （Escherichia coli）用Eco表示。用一个 大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一 宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马 字母表示。如EcoR I。
补就可以连接。这比连接两个平齐末端 容易的多。 同一个DNA分子内连接：通过两个相同 的粘性末端可以连接成环形分子。
图 粘性末端连接
5’末端标记
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进 行32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几 个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等） 造成人工粘性末端。
② 不完全同裂酶 识别序列相同，但切点不同。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
五、同尾酶 Isocaudamers
1. 定义 识别序列不同，但能切出相同的粘性末
端。 如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I等为同尾酶。 2. 特点 同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的
新位点，不能再被原来的酶所识别。
5’-GGATCC-3’ BamH I 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别
BamH I 5’-G 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
Bgl Ⅱ
六、限制酶的活性
限制性内切酶的识别和酶切活性，只有 在最适条件下，才表现出最大酶切能力 和位点专一性。
1. 活性的定义 在适当反应条件下，1小时内完全酶解
1g特定DNA底物，所需要的限制性内 切酶的量，为一个活性单位。
第二章各种工具酶
内容提要
第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA 连接酶 第三节 DNA聚合酶 (聚合酶 I /Taq聚合酶 /反转录酶)
第一节 限制性核酸内切酶
Restriction endonuclease （RE）
一、限制性核酸内切酶的概念 二、限制性内切酶的命名 三、限制性内切酶的类型 四、影响限制性酶活性的因素 五、限制性内切酶对DNA的消化
EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
（2）切割位点
切点距离识别位点约400~7000 bp。不在 识别位点。随机切开一条单链。
如一条DNA链甲基化，就行使甲基化酶 功能，使另一条链甲基化。
如两条链已甲基化，酶从DNA链解离。 需ATP、Mg2+ 和S-腺苷甲硫氨酸。
一、概念
1. 定义 是一类能够识别双链DNA中的特定核苷
酸序列，并在特定位点切割双链DNA的 内切酶。 2. 来源 细菌的限制性内切酶。
3. 功能
(1) 限制 Restriction 侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），
能被限制性内切酶识别和降解，从而保 护自身的DNA不被降解。
图 细菌的限制系统
补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐 末端。
四、同裂酶 Isoschizomers
识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶 识别序列相同和切点相同。
Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
(2) 修饰 Modification
细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从 而防止限制性内切酶的识别和水解。
① Dam甲基化酶 在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。 ② Dcm甲基化酶 在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入
甲基。
图 细菌的修饰Biblioteka 统图 甲基化位点：DNA上的 A/C
性末端或平齐末端。
图 Ⅱ类酶识别序列特点：回文序列
(3) 平齐末端 blunt end
EcoR V ：产生平齐末端。 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
限制酶的命名
图 几种重要的限制酶
图 几种限制酶的识别位点
三、限制性内切酶的分类
分为I 型、II型和III型。
1. I 型限制性内切酶
1968年，首先由M. Meselson和R. Yuan 在大肠杆菌 B株和 K株分离。如 EcoB和 EcoK。
（1）识别序列 未甲基化修饰的特异序列：
EcoR I ：5’端凸出
5’-
GAATTC
3’-
CTTAAG
5’-
G AATTC
3’-
CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
Pst I ：3’端凸出
5’-
CTGCAG
-3’
3’-
GACGTC
-5’
5’-
CTGCA
G
-3’
3’-
G
ACGTC
-5’
③粘性末端的意义
连接方便 不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互
2. III 型限制性内切酶
与I型酶有甲基化功能。 能在DNA链上的特异位点切割。 其切割位点在识别位点以外。 反应需要ATP、 Mg2+和S-腺苷蛋氨酸。 基因工程中用途不大。 如EcoP15: CAGCAG------
3. II型限制性内切酶
1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox首先 从流感嗜血菌中分离出HindⅡ 。
(4) 粘性末端 sticky end
含有几个核苷酸的单链末端。 ① 5´端突出 EcoR I ：形成5’-粘性末端。 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ ② 3´端突出 Pst I ：形成3’-粘性末端。 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
二、限制性内切酶的命名
1973年Smith等提出酶的命名原则。
用属名的第一个字母和种名的头两个字 母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌 （Escherichia coli）用Eco表示。用一个 大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一 宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马 字母表示。如EcoR I。
补就可以连接。这比连接两个平齐末端 容易的多。 同一个DNA分子内连接：通过两个相同 的粘性末端可以连接成环形分子。
图 粘性末端连接
5’末端标记
凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进 行32P标记。
凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几 个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等） 造成人工粘性末端。
② 不完全同裂酶 识别序列相同，但切点不同。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
五、同尾酶 Isocaudamers
1. 定义 识别序列不同，但能切出相同的粘性末
端。 如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I等为同尾酶。 2. 特点 同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的
新位点，不能再被原来的酶所识别。
5’-GGATCC-3’ BamH I 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别
BamH I 5’-G 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
Bgl Ⅱ
六、限制酶的活性
限制性内切酶的识别和酶切活性，只有 在最适条件下，才表现出最大酶切能力 和位点专一性。
1. 活性的定义 在适当反应条件下，1小时内完全酶解
1g特定DNA底物，所需要的限制性内 切酶的量，为一个活性单位。
第二章各种工具酶
内容提要
第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA 连接酶 第三节 DNA聚合酶 (聚合酶 I /Taq聚合酶 /反转录酶)
第一节 限制性核酸内切酶
Restriction endonuclease （RE）
一、限制性核酸内切酶的概念 二、限制性内切酶的命名 三、限制性内切酶的类型 四、影响限制性酶活性的因素 五、限制性内切酶对DNA的消化
EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
（2）切割位点
切点距离识别位点约400~7000 bp。不在 识别位点。随机切开一条单链。
如一条DNA链甲基化，就行使甲基化酶 功能，使另一条链甲基化。
如两条链已甲基化，酶从DNA链解离。 需ATP、Mg2+ 和S-腺苷甲硫氨酸。
一、概念
1. 定义 是一类能够识别双链DNA中的特定核苷
酸序列，并在特定位点切割双链DNA的 内切酶。 2. 来源 细菌的限制性内切酶。
3. 功能
(1) 限制 Restriction 侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），
能被限制性内切酶识别和降解，从而保 护自身的DNA不被降解。
图 细菌的限制系统
补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐 末端。
四、同裂酶 Isoschizomers
识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶 识别序列相同和切点相同。
Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
(2) 修饰 Modification
细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从 而防止限制性内切酶的识别和水解。
① Dam甲基化酶 在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。 ② Dcm甲基化酶 在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入
甲基。
图 细菌的修饰Biblioteka 统图 甲基化位点：DNA上的 A/C