第二章 基因工程中常用的工具酶
第二章基因工程中常用的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割
DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化
核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接
核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割
核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰
其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶
定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）
一、限制修饰系统的种类（图）
二、限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI—Escherichia coli RI
Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ
Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点
a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是
随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割
b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点
切割
c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分
子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应
d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性，
又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性
四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点
(1)基本特点：
①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA
分子形成链的断裂；——识别序列
②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割
部位
③因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端
④此类型核酸内切限制酶比较简单，不需要能量分子A TP，但需加入Mg++离子，而且
是从其识别序列内部切割DNA分子
⑤在结构上是一种单一的成分，即与Ⅰ型Ⅲ型酶不同，不具有多种亚基成分；
(2)识别位点又称切割位点、识别序列或靶子序列。绝大多数Ⅱ型核酸内切限制酶都能够
识别由4、5、6或7个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。例如EcoRI识别的序列是GAA TTC，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。呈典型的旋转对称型回文结构
(3)平末端与粘性末端
由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用，通常有下列两种不同的方式：两条链上的断裂位置是处于一个对称结构的中心，结果形成——具平末端的DNA片段。
Blunt ends
两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对轴排列，结果形成——具粘性末端的DNA片段。Cohesive ends
粘性末端概念(定义)：（图）
*是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链末端的结构，它们能够通过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。
(4)限制酶的识别序列与切割频率
具4个核苷酸组成的识别序列的限制酶如Sau3A的切割频率为44=256
具由6个核苷酸组成的识别序列的限制酶如BanHI的切割频率为46=4096
以上假定条件是，在一条随机排列的DNA序列中，假定所有的4种核苷酸都有同等出现的频率，那么任何一种4核苷酸或6核苷酸的识别靶子都有上述的出现频率。
(5)同裂酶(isoschizomers)
识别同样核苷酸序列的一些来源不同的核酸内切限制酶称为同裂酶。例如HpaI和MspI 就是一对同裂酶。同裂酶形成同样的末端。有些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，可用来研究DNA甲基化作用。
(6)同尾酶(isocaudamers)
一些来源不同、识别的靶子序列也各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，特称为同尾酶。例如BamHI、BglⅡ、Sau3A等即是一组同尾酶。
BamHI GGA TCC
BglⅡAGATCT
Sau3A GATC
*同尾酶在基因克隆中有用处，举例说明：
但产生的重组体中原识别位点发生了变化。
(7)识别多核苷酸序列的酶
例如HindⅡ就是能够识别多种核苷酸序列的一种核酸内切限制酶：
5'-CTPyPuAC-3'
其Py=嘧啶碱基C或T；Pu=表示嘌呤碱基A或G
五、影响核酸内切酶活性的因素
(1)DNA的分子特性
a.限制酶识别位点周围的碱基成分
b.特定DNA分子中所具有的目标限制酶识别位点的密度。
c.完全消化超盘旋的DNA要比完全消化等量的线性DNA需消耗更多的限制酶。
d.DNA的甲基化程度
完全切割不同来源的DNA样品所需的限制酶单位（图）
(2)酶切消化反应温度
a.最适酶切消化温度
不同的核酸内切限制酶的最适的消化温度是不同的。酶切温度高于或低于最适温度，都会影响限制酶活性，甚至失活。
b.限制酶的星号活力
限制酶的星号活力是指在酶反应条件发生改变(变更)的情况下，该酶便失去了识别其固有的特异序列(识别位点)的能力，而会在新的识别位点上发生DNA分子的切割作用(即识别序列发生了改变)。
(3)DNA纯度
酶切反应体系中的一些试剂成分，会改变限制酶的切割特性。因此DNA制剂的纯度对酶的活性会有很大的影响
六、核酸内切限制酶对DNA的消化作用
应用X射线晶体学技术，测定限制酶－DNA复合物的分子结构的研究，指出Ⅱ型核酸内切酶，是以同型二聚体形式与靶DNA序列发生作用，以EcoR Ⅰ为例，它是以同型二聚体上的6个氨基酸（每个亚基各有一个Glu和2个Arg残基），同识别序列上的嘌呤残基形成12个氢键的形式，而结合到靶DNA识别序列并从此发生链的切割反应。
§2.2 DNA连接酶
定义：能催化两个DNA片段末端之间-P和-OH基团形成磷酸二酯键，使两个末端连接的酶称为DNA连接酶（DNA ligase）。
目前已经知道有四种方法可以在体外将DNA片段连接起来：
a.用DNA连接酶将具有互补粘性末端的片段连接起来
b.用T4 DNA连接酶将平末端的DNA片段连接起来
c.先在DNA片段两端加上poly(dA)-poly(dT)尾巴，然后用DNA连接酶将之连接起来。
d.先在DNA片段两端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端，然后再用DNA
连接酶将之连接起来。
一、连接条件：
a.DNA连接酶要求在一条DNA链的3 -末端具有一个游离的羟基(-OH)和另一条DNA链
的5 -末端具有一个磷酸基团(P)，才能发挥其连接作用；
b.由于在-OH和-P基团之间形成磷酸二酯键是一种需能的过程(反应)，因此需要能源分
子的存在才能实现连接反应。
在大肠杆菌细胞中连接酶催化的连接能源是：
NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]
在动物细胞和噬菌体中，连接酶催化的连接能源是：A TP[腺苷三磷酸]
二、最佳连接温度
理论上连接酶体外最佳连接温度是37℃，但在此温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此实际上的最佳连接温度应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般经验认为是4～15℃比较合适。
三、DNA连接酶的反应条件（图）
四、末端DNA片段的连接过程（图）
§2.3 DNA 聚合酶
常用聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段、T4 DNA 聚合酶、T7 DNA聚合酶、修饰的T7DNA聚合酶、反转录酶等。
共同特点：都能够把将脱氧核糖核苷酸连续地加到引物链的3`-OH末端，催化核苷酸聚合，而不发生从引物模板上解离的情况。
但大多数聚合能力差，参入不到10个核苷酸，就从引物模版解离下来：大肠杆菌DNA 聚合酶、Klenow酶、T4 DNA聚合酶。
参入数百个核苷酸：T7 DNA聚合酶
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ性质：
5`－3`聚合酶活性；5`－3`外切酶活性；3` －5`外切酶活性
聚合作用发生在引物链3`-OH末端同参入的核苷酸之间，当这个外源核苷酸参入之后，又提供一个新的3`－OH，因此，聚合酶催化的链的合成是按5`－3`方向生长
当反应物中缺乏dNTPs，表现出3` －5`外切酶活性，将从游离的3`-OH末端逐渐的降解单链及双链DNA。
2.DNA缺口转移与探针的制备
在分子克隆中的主要用途：通过缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA 探针。
原理：5`－3`外切酶活性从缺口的5`一侧移去一个5`核苷酸，聚合作用就在3`一侧补上一个新的核苷酸。但是聚合酶不能够在3`-OH和5`-P之间形成键，因此随着反应的进行，5`-侧核苷酸被不断的移去，3`一侧核苷酸又按序的补加，于是缺口沿着DNA分子合成的方向移动。——缺口转移
探针制备（图）
反应体系：特定的DNA；DNaseⅠ；PolⅠ；32P－dNTPs
二、Klenow酶
来源：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶，经枯草杆菌蛋白酶处理之后，产生出来分子量为76×103dal的大分子
功能：5`-3`聚合酶活性；3`-5`外切酶活性
用途：修补经限制酶消化形成的3`隐蔽末端
标记DNA片段的末端
cDNA克隆中的第二链cDNA的合成
DNA序列测定
缺点：不能够有效的标记带有3`突出的DNA末端。
同位素标记DNA片段的末端（图）
三、T4 DNA聚合酶
来源：T4噬菌体感染的大肠肝菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。它是由噬菌体基因43编码
T4 DNA聚合酶基本特征（图）
3`-5`外切酶活性（图）
取代合成法标记DNA片段（图）
在没有dNTPs的情况下，3`外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的独特功能，它作用于双链DNA，并按3` －5`的方向从3`－OH末端开始降解DNA。
如果反应物中只有一种dNTPs，那么这种降解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止，从而产生出具有一定长度的3`隐蔽末端DNA片段。当反应物中加入标记的32P-dNTPs，这种局部消化的DNA片段便起到一种引物－模板的作用，T4 DNA 聚合酶的聚合作用超过了外切作用，反应物中32P-dNTPs逐渐取代了被外切活性删除掉的DNA片段上的原有核苷酸——取代合成。
取代合成法制备探针的优点：
不会出现人为的发夹结构（用缺口转移法制备的探针则会出现这种结构）
应用适宜的核酸内切限制酶切割，他们便可以很容易地转变成特定序列的探针。
四、依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）
目前已经从许多种RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，但最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶。
它是由α和β两条多肽链组成的：
α多肽链具有转录酶活性5`-3`（聚合活性）和RNaseH活性。RNaseH活性是由α多肽链经蛋白酶水解切割后产生的一种多肽片段，它以5`-3`或3`-5`的方向特异的降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链；
β多肽链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5`-3`脱氧核酸外切酶活性
它的5`－3`方向的聚合活性，取决于有一段引物和一条模板分子的存在，它可以用mRNA 为模板。以用mRNA为模板合成cDNA，是反转录酶的最主要用途。
也可以用单链DNA或RNA作模板合成供实验用的分子探针。
图1：以RNA为模板聚合互补DNA
图2：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
五、T7 DNA聚合酶
它是从感染了T7噬菌体的大肠肝菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。
T7DNA聚合酶是按两种亚基形式纯化出来的:
其中基因5蛋白质本身是一种非加工的DNA聚合酶，具有单链的3`-5`核酸外切酶活性。
其二，硫氧还蛋白，作为一种辅助蛋白，增加基因5蛋白质同引物模板的亲和性，使DNA的加工合成达数千个核苷酸。
此外，T7DNA聚合酶还具有很高的单链及双链的3`-5`核酸外切酶活性。
T7 DNA聚合酶的用途
大分子量模板上引物开始的DNA延伸合成。合成中，不受DNA二级结构的影响。
同T4 DNA聚合酶一样，T7DNA聚合酶通过单纯的延伸或取代合成标记DNA的3`-末端。
T7DNA聚合酶和T4DNA聚合酶一样，将双链DNA的3`和5`突出末端，转变成平末端的结构。
§2.4 核酸酶
一、核酸外切酶：一类从多核苷酸链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。
分为单链核酸外切酶和双链核酸外切酶
单链核酸外切酶：
大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ（exoⅠ）
大肠杆菌核酸外切酶（exoⅦ）
双链核酸外切酶：
大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ（exo Ⅲ）
λ噬菌体核酸外切酶（λexo ）
大肠杆菌核酸外切酶（exoⅦ）
它能够从5′-末端或3′-末端降解DNA分子，产生出寡核苷酸短片段。是一种不需要Mg2+离子的核酸酶（图）
大肠杆菌核酸外切酶（exoⅢ
核酸外切酶Ⅲ的主要活性是，按3′→5′的方向催化双链DNA自3′-OH末端释放5′-单核苷酸（图）
λ噬菌体核酸外切酶（λexo ）（图）
λ核酸外切酶最初是从感染了λ噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子自5′-P末端进行逐步的加工和水解，释放出5′单核苷酸，但它不能降解5′-OH末端
λ核酸外切酶的用途有两个方面：第一，将双链DNA转变成单链的DNA，供按双脱氧法进行DNA序列分析使用；第二，从双链DNA中移去5′突出末端，以便用末端转移酶进行加尾。
二、核酸内切酶
1. S1核酸酶
来自从稻谷曲霉，是一种高度单链特异的核酸内切酶，它降解单链DNA的速率要比双链DNA快75000倍，酶活性的表现需要Zn2＋，最适PH为4.0-4.3。
（1）主要功能：
催化RNA和单链DNA分子降解成5`单核苷酸，
作用于双链DNA分子的单链区，而且这种单链区可以小到只有一个碱基对。
图1：内切单链DNA或RNA
图2：内切带切口的或缺口的双链DNA或RNA
（2）主要用途：
测定杂种核酸分子（DNA-DNA或RNA-DNA）的杂交程度。
给RNA分子定位。
测定真核基因中间隔子序列的位置，探测双螺旋的DNA区域。
从限制酶产生的黏性末端中移去单链突出序列。
打开在双链cDNA合成期间形成的发夹结构等实验操作。
RNA分子定位（图）
一个RNA分子是由其模板DNA中的400－1400之间的核苷酸序列编码的。这条RNA 分子同包含核苷酸400－1400的DNA编码链杂交，然后再用S1核酸酶处理，那么RNA －DNA杂种分子中的单链尾巴会被降解掉，形成一条长度为1000bp的平末端的RNA －DNA杂种分子，回收这种分子，便可以测定出这段抗S1核酸酶的DNA片段长度。
如果所用的这段DNA是放射性标记的，其长度可用凝胶放射自显影测定。
2. Bal31核酸酶
来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）
具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。
当底物是双链环形DNA，Bal31的单链特异的核酸内切酶活性，通过对单链缺口或瞬时单链区的降解，将超盘旋的DNA切割成开环DNA，进而成为线性双链DNA
当底物是线性双链DNA分子时Bal31双链特异的核酸外切酶活性，会从5`和3`两末端移去核苷酸。（图）
Bal31核酸酶的活性需要Ca2＋和Mg2+。
它是分子克隆中十分有价值的工具酶，其主要用途有：
诱发DNA发生缺失突变；
定位测定DNA片段中限制位点的分布；
研究超盘旋DNA分子的二级结构，并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构。诱发DNA发生缺失突变（图）
定位测定DNA片段中限制位点的分布
先用Bal31核酸酶处理待测的线性DNA片段，使之以渐进的速度从5`和3`两末端同时降解DNA，并在不同的时间间隔加入EGTA，终止Bal31核酸酶的消化作用，然后用苯酚抽提样品，再加入我们期望使用的核酸内切限制酶进行在消化。如此按不同时间取样的DNA消化样品，同只用核酸内切限制酶消化的对照组DNA样品，一道进行凝胶电泳分析。DNA片段从凝胶中消失的先后次序，代表这些片段在DNA分子中的前后排列位置。根据这些结果，便可以把这些DNA片段按正确的顺序排列出来，并确定出有关限制酶的识别位点。
§2.5 核酸修饰酶
一、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）
末端脱氧核苷酸转移酶能够催化5`-脱氧核苷三磷酸进行5`向3`方向的聚合作用，逐个的将脱氧核苷酸分子加到线性分子的3`-OH末端，但是它不需要模板，4种dNTPs都可以作为它的前体。
接受核苷酸聚合的受体DNA，可以是具有3`-OH末端的单链DNA，也可以是具有3`-OH 末端的双链DNA
平末端不是末端脱氧核苷酸转移酶的有效底物，但如果用Co2+取代Mg2+离子作为辅助因子，便可以成为它的有效底物。
（图）
末端脱氧核苷酸转移酶的主要用途
分别给外源DNA分子及载体片段加上互补的同聚物尾巴，以使他们可以重组起来。
例如：给载体的线性分子的3`-OH末端加上poly（dG）尾巴，同时给待克隆的外源DNA 片段的3`-OH末端加上poly（dC）尾巴，于是这两条DNA分子便可以通过互补尾巴的碱基配对而彼此连接起来，最后再用连接酶将单链缺口封闭起来。
二、碱性磷酸酶
来自小牛肠的碱性磷酸酶（CIP）
来自大来自大肠杆菌的碱性磷酸酶（BAP）
他们的共同作用是催化核酸分子脱掉5`磷酸基团，从而使DNA片段的5`-P末端转化为5`-OH末端，这就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。
分子克隆中的应用：经碱性磷酸酶处理的质粒线性DNA分子失去了自身环化能力，但仍能与具5'-P和3'-OH的外源DNA片段重组，并在转化到受体细胞后完成Nick的修复工作。
CIP具有明显的优点，它在SDS中加热至68℃就会完全失活；而BAP是热抗性，要终止其作用就很困难；
CIP活性要比BAP高出10～20倍，所以实验中一般使用CIP。
三、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）（图）
基本特性：
用途：
习题练习
1．某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因?
2．在序列5'-CGAACA TA TGGAGT-3'中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?
3．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列：
GAATCG，AAATTT，GATATC，ACGGCA? 为什么?
4．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么?
5.DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用？
6..DNA连接酶在什么情况下使用？如何将不同DNA分子末端进行连接？
7..碱性磷酸酶有什么作用？
8. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。 2．类型：来自原核生物，有三种类型。 Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。 Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。 Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。 三种限制酶的区别如下表所示： Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型 DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA 辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP 识别序列特异特异特异 切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处） 与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用 3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D 株第三种限制酶）。 4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则44（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均46（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多数限制酶错位
第二章 基因工程工具酶
第二章基因工程工具酶 第—节限制性核酸内切酶 第二节DNA连接酶 第三节DNA聚合酶 第四节末端脱氧核苷酸转移酶 第五节核酸酶 第六节核酸外切酶 第七节碱性磷酸酶 第八节T4噬菌体多核苷酸激酶 第—节限制性核酸内切酶 1、宿主的限制和修饰现象 2、限制性核酸内切酶的类型 3、限制性核酸内切酶的命名 4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 4.1识别位点的长度识别靶序列长度4、5、6 bp居多，也有识别7、 8bp的 4.2 识别序列结构：回文对称 4.3 切割位置：（1）内部（大多数）；（2）两端（3）同裂酶与同尾酶 4.4 Ⅱ型限制性核酸内切酶不具有甲基化功能 4.5 Ⅱ型内切酶可以对单链DNA的切割 4.6 星号活性(star activity) （1）星活性产生的原因 （2）抑制星星活性的条件(措施) 5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应 5.1 标准酶解体系的建立 5.2 酶切反应的基本步骤 5.3 终止反应常用方法：
（1）加EDTA：（2）加SDS（3）加热：（4）其它 5.4 多酶联合酶解策略： （1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切 （2）对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法 5.5 DNA分子酶切常用缓冲液 5.6 内切酶对DNA分子的不完全酶解 5.7 内切酶酶解反应中的注意事项 6、影响限制性核酸内切酶活性的因素 6.1. DNA的纯度 6.2 DNA的甲基化程度 6.3 酶切消化反应温度 6.4 缓冲液(Buffer) 6.5 DNA分子的构型 6.6 反应时间 6.7 酶量使用 第二节DNA连接酶 1、DNA连接酶的发现 2、概念及其特点 3、DNA连接酶的种类 ?大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端。 ?T4噬菌体的连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平末端。 ?T4噬菌体RNA连接酶：催化单链DNA或RNA的5’磷酸与相邻的3’羟基共价连接。 4、DNA连接酶的反应体系
基因工程的工具——酶与载体
1.2基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是人教版选修3专题1基因工程中第2节内容，本节是《基因工程》专题的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》一节，下接《基因工程的应用》。 对于基因工程，学生接触得很少，文字描述中会感到抽象，为此，教材中采用形象化得呈现方式简述了基因工程基本操作程序的四个步骤。例如，基因文库中把基因组文库比作国家图书馆，而把cDNA文库比作某市图书馆，这样便于学生理解和掌握。此外，在教材处理中还呈现主干，割舍枝杈，将非主干内容以《生物技术资料卡》、《拓展视野》等方式呈现，做到有主有次。 二、学情分析 学生经过上一节的学习已经掌握DNA重组技术所需三种基本工具的作用及基因工程载体所需条件等知识，具备学习基因工程的基本操作程序一节的基础；而且经过一年必修教材的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，应在教师引导下适时加强学生解决问题和运用概念图等生物学语言归纳结论等方面的能力。 三、教学目标 3.1 知识目标 ⑴简述基础理论研究和技术进步催化了基因工程 ⑵简述基因工程的原理和基本步骤 3.2 能力目标 ⑴学会运用概念图总结基因工程的基本步骤及方法 ⑵尝试运用基因工程原理，提出解决某一实际问题的方案 3.3 情感态度与价值观 ⑴关注基因工程的发展 ⑵认同基因工程的应用促进生产力的提高 四、教学重点与难点 4.1 教学重点基因工程基本操作程序的四个步骤 4.2 教学难点 ⑴从基因文库中获取目的基因 ⑵利用PCR技术扩增目的基因 五、教学整体思路 采用从“整体-部分-整体”的教学思路，首先引用基因工程案例使学生从整体上了解基因工程的四个步骤，其次采用分步探究的形式帮助学生理解各个步骤的原理、方法和过程，最后教师引导学生用概念图将所学的知识从整体上再次整合。
(完整版)高中生物选修3第一章基因工程习题及答案
高中生物选修3第一章基因工程习题 1. SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于 治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图 所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因 为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也 可以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获 得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种 或多种 提供科学依据。 2. 聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术， 反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。 反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要 过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则 经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的 数量至少是 个。 （2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 。 ② 。 ③ 。 3. 逆转录病毒的遗传物质RNA 能逆转录生成DNA ，并进一步整合到宿主细胞的某条染色 体中。用逆转录病毒作为运载体可用于基因治疗和培育转基因动物等。 （1）病毒在无生命培养基上不能生长，必须依靠活细胞提供 循环重复 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、
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第Ⅱ卷非选择题 三．非选择题： 29．（7分）SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也可以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种或多种 提供科学依据。 30．（8分）聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。 （1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。 （2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 。 ② 。 循环重复 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、
第二章_基因工程中常用的工具酶
第二章基因工程中常用的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。 §2-1 核酸内切限制酶 定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图） 一、限制修饰系统的种类（图） 二、限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列，但它们的切割作用却是 随机的，在距特异性位点至少1000bp的地方可以随机地切割DNA分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b. Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分子。——远距离定点 切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶，在切割反应过程中，都会沿着DNA分 子移动，因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶，一般都是大型的多亚基的复合物，既具有内切酶活性， 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点： ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列，即所谓的识别序列，并由此切割DNA 分子形成链的断裂；——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；——单链切割
基因工程知识点全
第一章基因工程概述 1?什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering ）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多 种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大 要素。 1. 分离目的基因 2?限制酶切目的基因与载体 3. 目的基因和载体DNA在体外连接 4?将重组DNA分子转入合适的宿主细胞，进行扩增培养 5. 选择、筛选含目的基因的克隆 6. 培养、观察目的基因的表达 第二章基因工程的载体和工具酶 1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ 具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 分子量小，拷贝数多。具有安全性。 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒 3. 质粒的构建 （1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩 散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数 （3 ）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多 克隆接头（Polylinker ），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5 ）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 4. 什么是人工染色体载体？ 将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体 5. 什么是穿梭载体？ 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和 复制的载体。 6. 入-噬菌体载体及构建 hDNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。 1缩短长度提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点 引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 灭活某些与裂解周期有关基因。 使入-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现 象的发生。加装选择标记，便于重组体的检测 7. M13单链噬菌体DNA载体
基因工程基因操作过程中的工具酶
基因工程基因操作过程中的工具酶 09生物工程（2）班0902012010 摘要：基因工程涉及众多的工具酶可粗略的分为限制酶，连接酶，聚合酶和修饰酶四大类。其中，以限制性核酸内切酶和DNA连接酶在分子克隆中的作用最为突出。 关键词：基因工程工具酶聚合酶连接酶内切酶 正文：一、基因工程工具酶 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。 所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。 在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。 二、限制性核酸内切酶及其应用 （一）限制性核酸内切酶的发现 当λ(k)噬菌体侵染E.coli B时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB 甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。Eco B核酸酶不能识别已甲基化的序列。 最早分离出的限制内切酶是在1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K 菌株，Eco B和Eco K，是I型的，没有实用价值。 首个II型限制内切酶是在1970年，由H.O.Smith等从Heamophilus influenzae 的Rd菌株中Hin d II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。 从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5－磷酸二酯键。 （二）限制性核酸内切酶的分类 分为I型、II型和III型。
基因工程载体和工具酶
基因工程的载体和工具酶 第一节 载体 引言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达， 制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于 来实现。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS ）,便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 一、质粒载体 （一） 质粒的生物学特性 （1） 质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状 （少数为线形和 RNA ） DNA 分 子。 广泛从在于细菌细胞中， 比病毒更简单。 在霉菌、 蓝藻、 酵母和一些动植物细胞中也发现了 质粒， 目前对细菌的质粒研究得比较深入， 特别是大肠杆菌的质粒。 大肠杆菌的质粒主要有 F 质粒（F 因子）、R 质粒（抗药性因子）和 Col 质粒（大肠杆菌素因子）三种。 （2） 质粒的大小差异很大，最小的只有 1kb,只能编码中等大小的 2-3种蛋白质分子，最大 的达到 200kb 。 （ 3 ）质粒的生存在寄主细胞中 “友好 ”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往 往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。 （4） 质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将 质粒分为两种复制型： 严紧型"质粒（stigent plasmid ），拷贝数为1-3 ；松弛型"质粒（relaxed plasmid ） ,拷贝数为 10-60。不过即使是同一质粒， 其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生 长环境也可能有很大的变化。 （5） 质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。 载体 质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。 ⑹ 质粒的转移 转移性质粒，含有 tra 基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。 非转移性质粒，不含 tra 基因；可以为转移性质粒所带动转移。 （ 7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种， （二） 质粒 DNA 的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒 DNA 。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解 细胞，将质粒 DNA 与染色体 DNA 分开及除去蛋白质和 RNA 。 1. 碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 片断之间，在拓扑学上的差异而发展 出来的。 在pH 值12.0?12.5范围内时，线性的 DNA 会被变性而共价闭合环状质粒 DNA 却不 会被变 性。 通过冷却或恢复中性 pH 值使之复性，线性染色体形成网状结构，而 cccDNA 可以准确 迅速复性， 通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA 的上清液，最后用乙醇沉淀，获得 质粒 DNA 。 2. 碱变性法提取质粒的步骤： 而目的基因本身无法进行复 “载体 ”及其“寄主细 胞
基因工程的工具酶
基因工程的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶 限制性核酸内切酶 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 防御机制: 任何物种都有排除异物、保护自身的防御机制 人：免疫系统 细菌：限制与修饰系统 寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段, 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 限制酶(restriction enzyme) 修饰酶(modifying enzyme) 核酸酶切位点： 既可以在3ˊ,5ˊ-磷酸二酯键的3ˊ酯键处（A）， 也可以在5ˊ酯键处（B）切断磷酸二酯键
1）核酸限制性内切酶的类型 2）核酸限制性内切酶的基本特性 3）同裂酶和同尾酶 4）核酸限制性内切酶的命名法 5）影响核酸限制性内切酶活性的因素 限制性核酸内切酶的类型及特性 按照限制酶的组成、与修饰酶活性的关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型 第一类（I型）限制性内切酶： 能识别专一的核苷酸顺序 并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链 但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的 这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因 如：Eco B、Eco K等 第二类(II型)限制性内切酶： 能识别专一的核苷酸顺序（回文对称顺序） 并在该顺序内的固定位置上切割双链 是DNA重组技术中最常用的工具酶之一 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的 回文对称顺序：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同 切割后形成具有粘性末端（cohesive end）的DNA片段 切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段 限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链
基因工程知识点全
第一章 第二章 第三章基因工程概述 1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。 1.分离目的基因 2.限制酶切目的基因与载体 3.目的基因和载体DNA在体外连接 4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养 5.选择、筛选含目的基因的克隆 6.培养、观察目的基因的表达 第四章基因工程的载体和工具酶 1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ 具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 分子量小，拷贝数多。 具有安全性。 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒
3. 质粒的构建 （1）删除不必要的DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA 片段的装载量。一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数 （3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。 （4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆接头（Polylinker），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 4. 什么是人工染色体载体？ 将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体 5. 什么是穿梭载体？ 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。 6.入-噬菌体载体及构建 -DNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。 1缩短长度提高外源DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点 引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 灭活某些与裂解周期有关基因。 使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现象的发生。 加装选择标记，便于重组体的检测 7.M13单链噬菌体DNA载体
基因工程中常用的工具酶模板
第二章基因工程中常见的工具酶 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。§2-1核酸内切限制酶 定义: 核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列, 并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 到当前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。 核酸内切限制酶的发现及其生物功能( 图) 一、限制修饰系统的种类( 图) 二、限制性内切酶的定义、命名 1.定义: 广义指上述三个系统中的限制酶; 狭义指II型限制酶。 2.命名: 限制酶由三部分构成, 即菌种名、菌系编号、分离顺 序。 例如: Hin dⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae, ”ｄ” 表示菌系为ｄ型血清型; ”Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichiacoli RI
Hin dⅢ—Haemophilusinfluensae dⅢ Sac I(II)—Streptomycesachromagenes I(Ⅱ) 三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点 a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA分子中的特定序列, 但它们的切割作用却是随机的, 在距特异性位点至少1000bp的地方能够随机地切割DNA分子, 因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。——远距离随机切割 b.Ⅲ型核酸内切限制酶大约从距离识别序列25bp处切割DNA分 子。——远距离定点切割 c.Ⅰ型核酸内切限制酶和Ⅲ型核酸内切限制酶, 在切割反应过程 中, 都会沿着DNA分子移动, 因此是一种需要能量的过程。——需要能量的反应 d.Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶, 一般都是大型的多亚基的复合 物, 既具有内切酶活性, 又具有甲基化酶活性。——内切酶活性和甲基化酶活性 四、Ⅱ型核酸内切限制酶的特点 (1)基本特点: ①在双链DNA分子上有一个特殊的靶子序列, 即所谓的识别序 列, 并由此切割DNA分子形成链的断裂; ——识别序列 ②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布, 一般不是彼此直接 相正确; ——单链切割部位 ③因此, 断裂的结果形成的DNA片段, 也往往具有互补的单链
高中生物选修3第一章基因工程习题及
第Ⅱ卷非选择题 三．非选择题： 29．（7分） SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈 后，其血 清可用于治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了 研究，其研究的方向 如下图所示。请根据下图回答： 减毒处理 接种 动物实验 健康人 C 健康人 C 健康人 C 治愈 的病人 D （ 1）从免疫学的角度看， SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人 A 的血 清中因为含有 ，所以可用来治疗“非典”病人 B 。 （ 2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质 X 是 ，它可以通过化学的方法 合成，也可以通过生物学方法—— 技术生产。 （ 3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康 人 C 获得抵抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （ 4）图中丙主要研究不同国家和地区 SARS 病毒的异同， 再按照免疫学原理， 为研 究一种或多种 提供科学依据。 30（． 8分）聚合酶链式反应 （PCR 技术）是在实验室中以少量样品 DNA 制备大量 DNA 的生 化技术，反应系统中包括微量样品 DNA 、 DNA 聚合酶、引物、足量的 4 种脱 氧核苷酸及 ATP 等。反应中新合成的 DNA 又可以作为下一轮反应的模板， 故 DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。 灭活或 培养 非典病人 B 治愈的病人 B 非 典病人 D
- 2 - （ 1） 某个 DNA 样品有 1000 个脱氧核苷酸，已 知它的 一条单链 上碱基 A:G:T:C=1:2:3:4 ，则经过 PCR 仪五次循环后， 将产生 个 DNA 分子， 其中需要 提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。 （ 2）分别以不同生物的 DNA 样品为模板合成的各个新 DNA 之间存在差异，这些 差异是 3）请指出 PCR 技术与转录过程的三个不同之处： ① 31．（ 10 分）逆转录病毒的遗传物质 RNA 能逆转录生成 DNA ，并进一步整合到宿 主细胞的 某条染色体中。用逆转录病毒作为运载体可用于基因治疗和培育转基因动 物等。 （ 1）病毒在无生命培养基上不能生长，必须依靠活细胞提供 等物质基础，才能繁殖。逆转录病毒较 T 2 噬菌体更容易变异，从分子水平看，是由 于。 （2）基因治疗时，将目的基因与逆转录病毒运载体结合的“针线 将带有目的基因的受体细胞转入患者体内，患者症状会有明显缓解，这表明 。 （ 3）若将目的基因转入胚胎干细胞， 再经过一系列过程可获得目的基因稳定遗传 的转基因动物。 ①将带有目的基因的胚胎干细胞注射到普通动物的 胚中，胚胎发育成嵌 合型个体。如果转化的胚胎干细胞正好发育成 细胞，则嵌合型个体生下的 幼体就极有可能带有目的基因。 ②从胚胎干细胞转化到获得目的基因纯合子，配合基因检测，最少需要 代。试简述育种的基本过 程： 。 32．（8分）下图 a 示基因工程中经常选用的运载体—— pBR322 质粒， Amp r 表示氨 苄青霉素抗性基因， Tet r 表示四环素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中， 将使该基因失活， 而不再具有相应的抗性。 为了检查运载体是否导入原本没有 Amp r 和 Tet r 的大肠杆菌（受体细胞） ，将大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素的培养基上培养， 得到如图 b 的结果（黑点表示菌落） 。再将灭菌绒布按到培养基上， 使绒布面沾上菌 落，然后将绒布按到含四环素的
高中生物选修3第一章基因工程习题及答案
高中生物选修3第一章基因工程习题 1. SARS 病毒能引起非典型肺炎，医生在治疗实践中发现，非典病人治愈后，其血清可用于 治疗其他非典病人。有三位科学家分别从三个不同的方面进行了研究，其研究的方向如下图 所示。请根据下图回答： SARS 病毒 [丙的研究] 抽取血清 蛋白质X [乙的研究] 注射 注射 灭活或 培养 非典病人B 治愈的病人B 非典病人D 减毒处理 动物实验 健康人C 健康人C 健康人C 治愈的病人D （1）从免疫学的角度看，SARS 病毒对于人来讲属于 ，治愈的病人A 的血清中因为 含有 ，所以可用来治疗“非典”病人B 。 （2）甲的研究中，所合成或生产的蛋白质X 是 ，它可以通过化学的方法合成，也可 以通过生物学方法—— 技术生产。 （3）乙的研究目的主要是制造出 以保护易感人群。图中使健康人C 获得抵 抗“非典”病毒能力的过程，属于免疫学应用中的 免疫。 （4）图中丙主要研究不同国家和地区SARS 病毒的异同，再按照免疫学原理，为研究一种 或多种 提供科学依据。 2. 聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术，反 应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。反 应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过 程如右图所示。 [甲的研究] 用激素等治疗 非典病人A 治愈的病人A 健康人合成或生产 其他辅助治疗 接种 提纯、
（1）某个DNA样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR仪五次循环后，将产生个DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是个。 （2）分别以不同生物的DNA样品为模板合成的各个新DNA之间存在差异，这些差异是 。 （3）请指出PCR技术与转录过程的三个不同之处： ①。 ②。 ③。 3. 逆转录病毒的遗传物质RNA能逆转录生成DNA，并进一步整合到宿主细胞的某条染色体中。用逆转录病毒作为运载体可用于基因治疗和培育转基因动物等。 （1）病毒在无生命培养基上不能生长，必须依靠活细胞提供 等物质基础，才能繁殖。逆转录病毒较T2噬菌体更容易变异，从分子水平看，是由于。 （2）基因治疗时，将目的基因与逆转录病毒运载体结合的“针线”是。 将带有目的基因的受体细胞转入患者体内，患者症状会有明显缓解，这表明 。 （3）若将目的基因转入胚胎干细胞，再经过一系列过程可获得目的基因稳定遗传的转基因动物。 ①将带有目的基因的胚胎干细胞注射到普通动物的胚中，胚胎发育成嵌合型个体。如果转化的胚胎干细胞正好发育成细胞，则嵌合型个体生下的幼体就极有可能带有目的基因。 ②从胚胎干细胞转化到获得目的基因纯合子，配合基因检测，最少需要代。试
基因工程的载体和工具酶
第二章基因工程的载体和工具酶 【教学时数】9小时 【教学目录与学时分配】 2.1 载体（6） 2.1.1 质粒载体 2.1.2 噬菌体载体 2.1.3 其他载体 2.1.4 穿梭载体与表达载体 2.2 工具酶（3） 2.2.1 限制性内切核酸酶 2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段 2.2.3 DNA连接酶 2.2.4 碱性磷酸酶 2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶 【教学目的】 让学生掌握什么是基因工程的载体，有哪些典型的基因工程载体，哪些常用的基因工程工具酶，什么情况下使用工具酶等基本常识。 【教学重点】 常用基因工程载体的结构、工具酶的用途。 【教学难点】 基因工程载体的结构和使用 【教学方式】 多媒体讲解结合启发讨论式教学 第一节载体 一、质粒载体（3） 【教学重点】 质粒载体的构建与标记基因；克隆质粒载体的克隆过程 【教学难点】 质粒的结构 【教学过程与内容】 载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。 作为载体必须满足的条件：①有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；②外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；③有便于选择的标记基因；④具有促进外源DNA表达的调控区。 2.1.1 质粒载体 质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。它是闭合环状双链DNA分子，大小1kb到200kb不等。能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的。 质粒的复制分松弛型和严谨型两种。松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200 拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10 拷贝。 一、质粒的基本特性 1．质粒的复制 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制
第一章 基因工程
第一章基因工程 一、工具酶的发现和基因工程的诞生 1、基因工程的概念： （1）广义的遗传工程：泛指把一种生物的遗传物质（细胞核、染色体脱氧核糖核酸等）移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。 （2）基因工程： 就是把一种生物的基因转入另一种生物体中，使其产生我们需要的基因产物，或者让它获得新的遗传性状。基因工程的核心是构建重组DNA分子。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 （3）基因工程诞生的理论基础： DNA是遗传物质的发现过程、DNA双螺旋结构的确立、遗传信息传递方式的认定。 2、基因工程的基本工具 （1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） ①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能切割（使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开），因此具有专一性。 例如：某种限制性核酸内切酶能识别的序列是GAATTC,能在G和A之间切割DNA，如下图所示。黏性末端 黏性末端 ③结果：能将DNA分子切割成许多不同的片段。 备注：不同DNA分子用同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端都相同；同一个 DNA分子用不同限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 （2）“分子缝合针”——DNA连接酶 ①作用：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起（缝合磷酸二酯键）形成的DNA分子称为重组DNA分子。 因此，DNA连接酶具有缝合DNA片段的作用，可以将外源基因和载体DNA连接在一起。 （3）“分子运输车”——载体——质粒 ①载体具备的条件： 1）能在受体细胞中复制并稳定保存。
基因工程常用的工具酶
基因工程常用的工具酶 常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系 生物制药0911 刁亚军学号:2009423134 引言:在基因工程的研究和发展过程当中，有许多必不可少的因素影响和制约着基因工程的进展。本篇综述主要讲述的是基因工程常用的一些工具酶，他们包括限制性内切酶，DNA聚合酶，T4噬菌体DNA连接酶，T4多聚核苷酸激酶，碱性磷酸酶，核酸酶。这些酶在基因工程中发挥着非常重要的作用。 限制性内切酶 限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。 限制性内切酶的由来 一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组
限制性核酸内切酶 成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。别名Endodeoxyribonuclease简称限制酶酶反应限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。单位定义在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。性状制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μg λDNA，保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示),这类酶主要是从原核生物中分离出来的，迄今已经从近300多种不同的微生物中分离出约4000种限制酶。 类型 根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。 第一型限制酶