基因工程常用工具酶及应用

DNA 连接酶
36
DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）， 不是氢键（梯子的踏板）。
37
三.RNA酶
主要功能 降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、 皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA 的实验中谨防RNA酶污染。
38
四.核酸酶SI
• 降解单链 DNA 或 RNA，形成5’-P的单核苷 酸或寡核苷酸片段
5'粘末端
PstI
3' sticky end
3'粘末端
HpaI
blunt end
平末端
14
四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如
EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核 苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
某些碱基被甲基化所保护。这种细菌
内部的限制与修饰作用分别由核酸内
切酶和甲基化酶完成，构成了类似免
疫的防御系统。
6
解释 何谓内切酶
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点
7
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可 分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；
15
• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的 出现概率大，识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。
5′CCGATAGCCT 3′ 3′GGCTATCGGA 5’→3’ DNA聚合酶活性
28
5′CCGATA-OH 3′ 3′GGC
DNA聚合酶Ⅰ 5′CCG 3′GGC ＋dA,dT
3’→5’ 外切酶活性
29
2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段
该酶是用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降
解大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ ，从全酶中切去
特点：识别切割位点比较专一，只有切割 作用。无甲基化修饰作用。 Ⅰ类和Ⅲ类限制性核酸内切酶同时具有内切 活性和甲基化修饰活性，且识别位点复杂， 特异性差，不适用于基因工程。 8
一.限制性内切酶的命名
• Hind Ⅲ H
细 菌 属 名 的 第 一 个 字 母
in
前细 两菌 个种 字名 母的
d
细 菌 菌 株 的 第 一 个 字 母
位点大大增加。
25
第二节 其他工具酶
一.DNA聚合酶
作用: 依据模版,连接游离的单核苷酸,形成与
模版互补的新链。
26
1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 该酶具有三种酶活性 5’→3’ DNA聚合活性 3’→5’ 外切酶活性 识别切除错配的核苷酸 5’→3’ DNA外切′GGCTATCGGA dNTP DNA聚合酶Ⅰ
• 对DNA的活性比对RNA的强
• 产生平末端
39
五 .碱性磷酸酶
• 切除DNA或RNA的5‘-P • 防止DNA自身环化
5’ p－ TTAGCTAGGCCC … TCAATCGGTACG －OH 3’ 3’ HO-AATCGATCCGGG … AGTTAGCCATGC－p 5’
40
Ⅲ
现同 的一 第菌 三株 种中 酶发
9
• EcoRI
E
细 菌 属 名 的 第 一 个 字 母
co
前细 两菌 个种 字名 母的
R
该 酶 的 基 因 位 于 R 质 粒 上
I
第该 一菌 种株 内发 切现 酶的
10
11
二. II型限制酶的识别特点
• 识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序的固 定位置切割，识别顺序为回文结构。 （Palindrome）
3
“分子剪刀”的发现者
4
第一节
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease，RE)
是由细菌自己产生的一种能识别双链
DNA中的特定序列，并以内切方式水解
核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。
5
在细菌体内，这种内切酶可以分 解外源性的DNA物质，例如病毒等； 而细菌本身的DNA同一识别序列中的
22
限制性核酸内切酶的反应条件
• 各种限制性核酸内切酶反应条件相似，主
要区别是对盐浓度的需求不同。据此可分
为三组
• 低盐组 0～50mmol/L NaCl
• 中盐组 50～100mmol/L NaCl
• 高盐组 100～150mmol/L NaCl
23
限制性核酸内切酶的星号活性
当酶切条件发生变化时，限制性
第四章
基因工程的工具酶 及其应用
1
TOOLS FOR GENE CLONING SCISSORS: RESTRICTION ENZYMES GLUE: DNA LIGASE VEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS
2
基因工程的工具酶
定义 用于DNA和RNA切割和连
接的各种酶叫做工具酶。
4.TaqDNA聚合酶
耐热的 DNA聚合酶。最适反应温度75
～80oC，主要用于聚合酶链反应。
32
5.逆转录酶（reverse transcriptase ）
作用：以RNA为模版，合成 cDNA (Complementary DNA) 该类酶有三种活性 ① RNA依赖的DNA聚合酶活性 ② DNA依赖的DNA聚合酶活性 ③ 外切RNA的活性
16
稀切酶：有些酶的识别位点在核苷酸序列中 出现的几率很小，可称为稀切酶。 为了获得大的DNA片段，需用稀切酶切割。 个别限制性内切酶可识别两种以上的核苷酸 序列，如Acc I既可识别GTATAC，又可识 别GTCGAC。
17
• 位点偏爱：限制性内切酶识别序列两侧的 核苷酸组成与酶切效率有关，比如Nae I在 pBR322质粒上有4个识别位点，其中两个 位点可迅速被Nae I切割。第三个位点稍慢。 而位于1285处的第四个识别序列，切割的 效率只有其他位点的1/15。
客 上 天 然 居 居 然 天 上 客
12
13
三. 限制性内切酶的切割方式
EcoRI
5' -G AATTC- 3' 3' -CTTAA G- 5' 5' -CTGCA G- 3' 3' -G ACGTC- 5' 5' -GTT AAC- 3' 3' -CAA TTG- 5'
5' sticky end
20
• 同位酶:识别相同的序列,但切割位点不同.
• 同裂酶: 又称异源同工酶，来源不同,但识
别位点和切割位点相同.
切割位点也可以不同，例如Sam I(CCC↓GGG)和
Xma I(C↓CCGGG)
21
五.限制性内切酶的反应条件
• • • • • • • • 反应温度 一般为37oC 反应体积20µl DNA含量 0.5－1µg 酶含量 1－2u DNA纯度：OD260/280nm>1.7 阳离子 Mg2+ 反应时间 1-1.5h pH7.5
5‘ → 3’ 外切活性的肽段后产生的一条多肽
链，保留了5’→3’聚合和3’→5’外切
活性。
该酶称为Klenow酶。也称为 Klenow 片
段（Klenow fragment）。
30
3.T4噬菌体DNA聚合酶
来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，具有
5’→3’ DNA聚合酶活性
3’→5’ 外切酶活性
31
核酸内切酶的专一性可能会降低，导
致同种酶识别多种序列，这种现象称
作限制性核酸内切酶的星号活性。
24
例如 EcoR I在正常条件下识别GAATTC,但 在低盐（小于50mmol/L)、高pH（大于8）、 甘油大量存在时，识别序列增加了AAATTC、 GAGTTC,导致EcoR I在DNA分子上的切割
18
同尾酶：两种酶识别不同的顺序，但切割 产生的粘末端相同，叫做同尾酶。 同尾酶产生的粘末端，可通过碱基互补连
接，形成的位点称为“杂种位点”，该位
点不能再被原来的两种酶切割。
19
例：AGATCT TCTAGA
Bgl Ⅱ
GGATCC CCTAGG
BamH Ⅰ GATCC G
连接酶
A TCTAG
AGATCC TCTAGG
33
常用的逆转录酶有两种：
AMV－来自于鸟类骨髓母细胞瘤病毒
M-MLV－来自于莫络尼鼠的白血病病毒
34
二 . T4DNA连接酶
• 催化两个DNA片段的3’-OH和5’-P末端
成磷酸二酯键 • 该酶是大肠杆菌T4噬菌体的DNA30编码的
形
产物，分子量68kd。现已由基因工程菌表
达。
35
“分子针线”