质粒的瞬时表达与稳定表达
细胞转染经验
转染注意因素有血清时的转染血清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。
转染过程在两步中需要使用培养基做为稀释液：在DNA-阳离子脂质体复合物准备过程以及复合物同细胞接触过程。
在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。
但在复合物形成后，在加入细胞中前可以加入血清。
阳离子脂质体和DNA 的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。
对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEMⅠ培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。
对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。
培养基中的抗生素抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。
这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。
这降低了细胞的活性，导致转染效率低。
所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
这样，在转染前也不必润洗细胞。
对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。
另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。
细胞维护和培养的演变可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。
每周传代一到两次，稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。
不要使细胞保持融合超过24小时。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。
细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。
这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。
瞬时转染和稳定转染是什么？
瞬时转染和稳定转染是什么？
瞬时转染：外源⽚段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导⼊的裸露的载体整合⼊基因组的⼏率⾮常低，所以以染⾊体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂⽽⼀同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
⽽且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极⾼。
这就导致瞬时转染呈现⼀个⾼拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且⽆法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染⽽⾔，进⼊细胞的质粒整合⼊细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是⼀种与瞬时转染不同的⽅法，只是对瞬时转染的细胞进⾏筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的⼏率因基因传递的⽅法⽽异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染⽅法，⽐如化学试剂介导的转染，其整合⼏乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递⽅法，呈现不同的靶向倾向性，所以是⼀种半随机整合。
玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化
玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化玉米是全世界最重要的粮食作物之一，也是许多国家的重要原料供应者，尤其是用于生产生物燃料和化工原料。
玉米叶肉细胞是进行基因表达和生物合成的重要细胞类型之一。
由于其高效的生物合成能力和丰富的蛋白质含量，玉米叶肉细胞已成为研究和生产的理想模型。
然而，传统的转染方法对基因的转导效率和表达量有一定局限性，限制了基因表达的研究和应用。
因此，发展一种高效、简便的玉米叶肉原生质体瞬时表达系统具有重要意义。
原生质体瞬时表达系统是在细胞质中直接转导外源基因并进行表达的一种方法。
相比于传统的转染技术，原生质体瞬时表达系统具有以下优势：(1) 相对较高的转导效率和表达量；(2) 无需耗时的细胞培养和稳定转化；(3) 更适用于高通量筛选和表达优化。
因此，建立一个高效的原生质体瞬时表达系统对于基因的功能研究和工业应用具有重要的意义。
在玉米叶肉细胞中，瞬时表达系统的关键步骤主要包括DNA导入、转导、表达和鉴定。
首先，合适的质粒载体和表达载体需要进行构建和优化。
质粒载体应包含适当的启动子、启动子增强子和终止子序列，以确保基因在转导后的高效表达。
此外，选择合适的选择标记基因，如绿色荧光蛋白（GFP）等，以便对转导效率和表达量进行评估。
其次，选择合适的转导方法。
在玉米叶肉细胞中，常用的转导方法包括基因枪转导、电转导和化学转导等。
不同的方法适用于不同的目的和实验条件，因此需要根据具体实验目的进行选择。
例如，基因枪转导适用于高通量筛选，电转导适用于较小规模的实验室研究。
为了提高转导效率，可以优化转导条件，包括DNA浓度、转导时间和转导介质等。
第三，对转导后的基因表达进行鉴定和分析。
通过荧光显微镜观察转导后的细胞在表达载体中是否产生荧光信号，以评估转导的效果。
此外，可以利用Western blotting、RT-PCR等技术对蛋白质和RNA进行定量分析。
然而，在建立和优化玉米叶肉原生质体瞬时表达系统时，仍然存在一些挑战和难题。
lipo转染操作步骤
L i p o2000瞬时转染细胞步骤Stealth?RNAiorsiRNATransfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
PlasmidDNATransfectionDNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1中板。
贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。
2转染。
A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cmdish细胞质粒转染量4-6ug足以。
Opti-MEM?I减血清培养基是EMEM的改良型,其中使用了HEPES和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子.常用其作为无血清培养基与质粒和lip2000分别混合。
稳定转染VS瞬时转染
稳定转染VS瞬时转染展开全文生物通报道：转染是将外源遗传物质导入真核细胞的过程，是细胞和分子生物学研究的重要工具，可用于研究基因表达对细胞生理水平的影响。
不论是质粒、DNA还是各种RNA（mRNA、siRNA或microRNA），要将这些外源核酸转入细胞并不容易，它们必须穿过细胞膜这层屏障才能进入细胞质。
转染方法可分为物理转染和化学转染，物理转染方法包括电穿孔、显微注射和基因枪等，化学转染可使用磷酸钙共沉淀、DEAE-Dx或基于阳离子脂质的转染试剂。
上述方法都可以解决转染面临的主要挑战，即让带负电荷的核酸分子穿过带负电的细胞膜。
物理转染方法一般是在细胞膜上打洞来克服静电排斥，使核酸插入。
而化学转染中，一般是利用带正电的转染试剂将带负电的核酸包裹起来。
这些方法都可以实现转染，可谓条条大路通罗马，那么究竟是选瞬时转染好还是选稳定转染好呢？瞬时转染的细胞中，外源基因得以表达但它们并不会整合到细胞的基因组中，也就不会被复制。
细胞中瞬时转染的外源基因表达时间有限，通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止我们如何区分细胞是否转染成功了呢？在转染质粒中往往都含有一个报告基因，来指示细胞中目标基因是否存在，这样的报告基因一般可以在转染后一两天内检测到。
稳定转染可以在瞬时转染的基础上建立，只不过需要一个重要的偶发过程：在少数转染细胞中，外源基因能够整合到细胞的基因组中。
外源基因成为细胞基因组的一部分从而得以复制，这就是稳定转染细胞的标志。
稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。
在建立上述稳定转染细胞系时，我们需要使用选择性标记来区分瞬时转染与稳定转染。
将这些选择性标记与基因共表达，我们就可以筛选出外源基因已成功整合到基因组的细胞，同时剔除瞬时转染的细胞。
将外源基因与抗生素抗性基因共转染（如新霉素抗性基因neo）是一种常用方法，随后可用相应抗生素（如geneticin或G418）对转染后的细胞进行筛选。
Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
细胞瞬时转染 稳定转染
细胞转染摘要：真核蛋白表达细胞转染方式有两种：瞬时转染和稳定转染，本文的主要介绍了两者的定义和适用性及细胞转染一般步骤，影响转染效率的因素，帮助我们提高实验的成功率。
在哺乳动物细胞蛋白表达实验，根据不同的实验目的，将质粒导入细胞有两种方法：瞬时转染和稳定转染。
细胞转染是将外源基因导入真核细胞的过程。
质粒、DNA、RNA将这些外源基因导入到真核细胞内并不容易，要跨越细胞膜的屏障进入细胞质。
瞬时转染瞬时转染是指外源基因导入到细胞后得以表达，但是基因不整合到细胞的基因组上，因此不会随着细胞的生长复制。
因此，瞬时转染的时间有限，通常只持续几天，直到外源基因在细胞生长分裂过程中因各种因素消失为止。
判断细胞是否转染成功，在构建质粒上含有报告基团，以指示目标基因是否存在，一般在转染两天后即能被检测到。
稳定转染稳定转染是在瞬时转染的基础上，瞬时转染时有一小部分的基因会整合到细胞基因组上，并随着细胞的生长分裂，质粒会随机分配到子细胞中从而稀释直至最终丢失，所以稳定转染要进行稳定细胞系的筛选，经过筛选出来的细胞株，此时的质粒已经完全整合到细胞基因组中，随着细胞的生长复制并稳定的遗传给后代。
瞬转稳转适用性瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。
瞬时转染在转染后四天即能收获细胞，瞬时转染一般用于基因产物的短期表达、基因敲除、蛋白质的小规模合成。
相对于瞬时转染，稳定转染表达适用于长期的药理学研究遗传调控机制研究及大规模的蛋白质合成，需要大量的周期，因此更费力成本投入高。
目前，在进行哺乳动物细胞蛋白表达蛋白时，因为细胞培养技术的进步和人们对瞬时转染的不断探索，人们已经可以对一些常用细胞进行悬浮培养，实现了瞬时转染对重组蛋白的大规模合成，节省了时间和成本。
细胞转染一般步骤以24孔板进行细胞瞬时转染表达为例，全程操作均为无菌状态，以免造成细胞污染转染前准备，细胞株或者直接培养后的细胞用胰蛋白酶消化后计数，铺板，培养基为含有1ml血清，不含抗性的正常培养基。
瞬时表达和稳定表达的定义和区别
瞬时表达和稳定表达的定义和区别
瞬时转染：转染的核酸不整合到染⾊体上，结果是短暂的⾼⽔平的表达，可以在24-96⼩时内检测表达效果，表达⽔平与位置⽆关，不会受到周围染⾊体元件的影响。
瞬时表达分析所需要的⼈⼒和时间⽐稳定表达都少，但由于DNA的摄⼊效率和和表达⽔平在不同试验中差异较⼤，不长久也不稳定。
超螺旋质粒转染时更倾向于瞬时转染。
瞬时表达为基因-蛋⽩质研究提供了⼀重快速，⽅便的⽅法。
瞬时表达得到的蛋⽩质保存时间⽐较短。
稳定转染：转染的核酸和染⾊体整合到⼀起，但整合并不⼀定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，⽽且整合到不同的染⾊体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是⼩概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
可以通过G418来筛选。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
导入真核的质粒表达方式有两种，一种是瞬时表达。
这种瞬时表达是由一些强启动子控制，使目的基因在真核细胞内瞬时强行表达，表达的过程无非还是转录翻译。
不过这种以环形质粒导入细胞的瞬时转染质粒很容易在复制时丢失，所以叫瞬时转染。
另一种叫稳定表达，这种一般是腺病毒载体或其他稳定转染载体，他们是以线性方式整合到真核细胞基因当中，和真核基因一样的表达，并拥有自己的启动子，这种表达方式比较温和，也会随真核细胞的分裂而遗传，所以叫稳定转染。