芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定
筛选营养缺陷型菌株的方法
工业微生物菌种的选育——营养缺陷型菌株的筛选来源：青岛海博关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同。
关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
（一）、营养缺陷型菌株的分离和筛选一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。
1、营养缺陷型的诱发营养缺陷型的诱变方法和诱变因子与普通诱变育种基本相同。
2、淘汰野生型在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于检出。
淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
（1）抗生素法：细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。
处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。
将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。
酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。
芽孢杆菌的筛选和鉴定的一般流程
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营养缺陷型菌株的筛选
营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。
营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。
完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。
营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。
营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。
现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。
通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。
抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。
青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。
制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。
在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。
菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。
其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。
通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。
第三步，检出缺陷型：具体方法很多。
产广谱细菌素芽孢菌筛选与鉴定
产广谱细菌素芽孢菌筛选与鉴定一、引言细菌素是一种广谱抗生素，对多种细菌具有较好的抑制活性。
而芽孢菌是一类可以产生细菌素的微生物，因此对芽孢菌的筛选与鉴定具有重要意义。
本文将着重介绍产广谱细菌素的芽孢菌的筛选与鉴定方法。
二、芽孢菌的筛选1. 采集样品：首先需要采集不同环境中的微生物样品，如土壤、水体、植物表面等。
这些样品中含有丰富的微生物资源，有利于筛选到产广谱细菌素的芽孢菌。
2. 芽孢菌的分离与纯化：将采集到的样品进行稀释后涂布在富含养分的琼脂平板上，利用稀释平板法将芽孢菌进行分离和纯化，得到单菌落。
3. 筛选菌株：利用对目标细菌素的敏感性进行筛选，选择对目标细菌素具有抑制活性的芽孢菌进行扩大培养和鉴定。
三、芽孢菌的鉴定1. 形态学鉴定：通过光学显微镜观察芽孢菌的形态特征，包括菌体形状、颜色、孢子形态等。
2. 生理生化鉴定：包括对芽孢菌的生长速率、温度适应性、酶活性等进行测试，利用不同的生理生化试验进行鉴定，如碳水化合物利用、氧化酶活性、氨基酸代谢等。
3. 分子生物学鉴定：利用PCR技术对芽孢菌的16S rRNA序列进行扩增并测序，通过与数据库比对进行物种鉴定。
4. 抗生素活性鉴定：利用菌落扩散法、微量稀释法等对芽孢菌所产抗生素的活性进行测定，了解其对于靶菌的抑制效果。
四、芽孢菌的应用1. 生物农药生产：利用产广谱细菌素的芽孢菌制备生物农药，用于农作物的病虫害防治，发挥其抗菌功效。
2. 饲料添加剂：将产广谱细菌素的芽孢菌应用于畜禽饲料中，增强饲料的抗菌活性，提高畜禽的健康水平。
3. 生物环境修复：将产广谱细菌素的芽孢菌用于土壤修复、水体治理等领域，清除有害微生物，提高环境质量。
五、总结芽孢菌是一类重要的产广谱细菌素的微生物资源，其筛选与鉴定对于新抗生素的发现和利用具有重要意义。
通过对芽孢菌的筛选与鉴定，可以为生物农药生产、饲料添加剂及环境修复等领域提供新的资源和技术支撑。
希望本文介绍的方法和应用能为相关研究工作提供一定的参考和借鉴。
产有机酸芽孢杆菌的筛选、鉴定及产芽孢条件优化
Ｄ ｌ ｅ ｉａ ｆ ｔ ｂ ｅ ｃ ｏ ｍｅ ｙ ｅ ｌ ｌ ｏ ｗ ｗｅ ｒ ｅ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ２０ ０ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｆ Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｐ ｐ．ｓ ｔ ｏ ｒ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｈｅ ｌ ａ ｂ．Ｔｈｅ ｏ ｒ ｇ ａ ｎ ｉ ｃ
序 列分析 结果 对 菌株 进行 种属 鉴 定 。利 用单 因素试验 和 正 交试 验 结合 的方 法 ， 考 察 不 同的碳 源 、 氮 源、 无机 盐 、 ｐ Ｈ值 、 培养时间、 接 种 量对 菌株 芽孢 形成 的 影响 。结 果表 明 ， 菌株 Ｒ ４ ２ － １ ６ 发酵液 中乙 酸、 乳 酸 的含量 较 高 ， 分 别为 ２ ２ １ 、 １ ７ ４ Ｂ ｘ ｇ ／ ｍ ｌ 。 经鉴 定 菌株 Ｒ ４ ２ — １ ６ 为解 淀粉 芽孢 杆 菌 （ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ａ ｍ ｙ — ｌ ｏ ｌ ｉ ｑ Ⅱ ｅ ｒ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ） 。本试 验条件 下 ， 菌株 Ｒ ４ ２ — １ ６的 最 佳 培 养 基 组 成 为 ： 玉米粉 １ ％、 酵母 浸粉 ２ ％、 Ｍｎ Ｓ Ｏ ． Ｈ Ｏ ０ ． ０ １ ％、 Ｃ ａ Ｃ １ ・ Ｈ ０ ０ ． ０ １ ％， 培 养基 最佳初 始 条件 为 ： 发 酵时 间４ ８ ｈ 、 接种量４ ｍ ｌ 、 ｐ Ｈ值 ６ 、 装液量 ５ ０ ｍｌ ／ ２ ５ ０ ｍｌ 。在 此优 化 条件 下 ， 发 酵 液 中菌株 Ｒ ４ ２ — １ ６的 活菌数 达 到 ３ ． １ ９ ｘ １ ０ ｃ ｆ ｕ ／ ｍ ｌ ， 芽孢
产L-乳酸芽孢杆菌的筛选分离和鉴定
项目总结题目：产L-乳酸芽孢杆菌的筛选分离和鉴定研究背景：在畜禽养殖过程中使用亚剂量的抗生素可以提高畜禽的生产性能。
但大面积、长期使用抗生素，畜禽产品的药物残留增加面临食品安全问题，而且导致耐药性细菌增加、蔓延，动物和人类在使用这些药物时的安全性和疗效降低。
欧盟已经于2006年1月开始禁止抗生素用作畜禽饲料添加剂。
益生素为“一种可以通过改善肠道微生态平衡而对动物有有利影响的活的微生物饲料添加剂。
它是一种能有效补充畜禽肠道内的有益微生物，改善消化道菌群平衡。
与抗生素相比而言，益生素不存在毒性、残留、耐药性和环境污染等问题，因而益生素的研究和应用日益受到人们的重视。
芽孢杆菌中一些种类能够利用葡萄糖和木糖代谢产生L-乳酸，如已经发现的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans ）。
如果筛选产L-乳酸的芽孢杆菌能够应用为益生菌的话，它将具有芽孢杆菌和乳酸菌两者的优点，应用前景更为广阔。
因此，本研究拟从畜禽粪便筛选产L-乳酸的芽孢杆菌，并在在体外检测芽孢杆菌有利于在胃肠道生态系统生存的固有特性和竞争性排斥病原菌的效应，为将芽孢杆菌应用为畜禽益生菌打下基础。
研究内容：我们小组的成员从08年的6月份开始着手产L-乳酸芽孢杆菌的筛选。
早期，我们考虑从酸菜汁中筛选产酸的芽孢杆菌。
方法一：所选用的培养基为筛选培养基，其配比为：葡萄糖0.6%，酵母膏0.1%，蛋白胨0.1%，MgSO4 0.005%，CaCO3 0.1%，溴甲酚紫溶液3-4滴，琼脂1.5%-2.0%。
PH7.2-7.4。
利用溴甲酚紫遇酸会变黄的原理筛选产酸的芽孢杆菌。
过程：（1） 样品制备：酸菜叶+100ml 无菌水，在85°C 进行水浴25min ，再进行梯度稀释821010---于7支试管中。
（2） 涂布于筛选培养基（紫色）上，观察，挑选能发生变色反应的产酸芽孢杆菌，进行划线（牛肉膏蛋白胨培养基），初步分离纯化。
（3） 再次划线，进一步分离纯化以期分离出单菌落。
芽孢杆菌营养缺陷型的筛选检出与鉴定
实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定一、实验目的掌握各种培养基的配制方法；理解选育营养缺陷突变株的选育原理；掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。
二、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。
也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。
1.诱变处理基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。
亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。
在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。
它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。
NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。
一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。
NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。
2.淘汰野生型诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
枯草芽孢杆菌营养缺陷型突变株的筛选
题目：细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定一、实验原理：筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用亚硝酸钠为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
二、实验器材：离心机，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；接种针，三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，枪头三、菌种：大肠杆菌四、所有用到的培养基：（分别列出配方）1. LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min2. 基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110℃灭菌20 min。
配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂。
全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3 次。
3. 无N基本液体培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min4. 2N基本培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min5. 完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加2%的琼脂。
6. 补充培养基(简称SM)：为满足某特定营养缺陷型菌株的营养要求而在基本培养基中加入某—种或几种营养成分的培养基称补充培养基。
7.醋酸缓冲液(pH4.5)（取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml）、0.1 mol/L亚硝酸钠溶液(68.995×0.1=6.8995g/L)、0.07 mol/L酸氢二钠溶液(pH8.6)(141.96×0.07=9.9372g/L)五、实验步骤1th day: 各种所需培养基、试剂的配制及所需器材灭菌2th day：菌体活化与培养：取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中，37℃培养过夜，14~16h.3th day：早上添加5mlLB液，充分混匀后，分装到两只三角瓶，继续培养5小时。
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实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定一、实验目的掌握各种培养基的配制方法；理解选育营养缺陷突变株的选育原理；掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法；获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。
二、实验原理营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。
也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、鉴定缺陷型[1]。
1.诱变处理基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。
亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。
在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突变：pH5-5.5 时，NTG 形成HNO2，本身也是诱变剂；pH 6.0 时，NTG 本身不变化，可作用于核蛋白而引起诱变效应。
它的主要作用是引起DNA链中GA向AT转变。
NTG 是—种超诱变剂，杀菌力较弱，诱变作用较强，其作用部位又往往在 DNA的复制叉处，易造成双突变。
一般选用NTG 处理时，诱变频率较高，可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变。
NTG也是一种致癌因子，在操作时要特别注意，切勿直接与皮肤接触，凡有亚硝基胍的器皿都的要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残存的亚硝基胍分解破坏，然后清洗[2]。
2.淘汰野生型诱变处理后的个体，营养缺陷型的比例较低，可采用菌丝过滤法、抗生素法、高温杀菌法除去野生菌，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
菌丝过滤法：该方法只适用于真菌，在基本培养基中野生型孢子可以发育成菌丝体，而突变型的不可以，这样经诱变后的孢子在基本培养基中培养一段时间后过滤，重复几次后就可达到浓缩突变型菌体的作用。
抗生素法：是利用野生型菌株能在基本培养基中生长，而缺陷型不能生长，将诱变处理液在基本培养基中培养让野生型生长一周，而缺陷型无法生长，加入一定量的抗生素，使活化的野生型杀死，保存了缺陷型。
在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。
高温杀菌法：本实验利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，诱变后的细菌形成芽孢后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。
此时将培养物加热到80℃，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留。
3.营养缺陷型的检出营养缺陷性的检出方法包括影印法、夹层法、限量补充法、逐个检出法。
影印法：先将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。
在完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压，使之成为印模，标记方位。
将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。
然后将CM和MM在恒温箱中培养。
在两平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板上的。
MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。
此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。
本法适用于细菌、酵母菌，其次对小型菌落的放线菌和霉菌也适用。
夹层法：先在培养皿上倒一层基本固体培养基，凝固后涂上一层含菌的基本固体培养基，凝固后再倒一薄层基本固体培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层完全固体培养基，再培养。
这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。
此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。
限量补充法：方法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01%蛋白胨的MM上培养，野生型迅速长成大菌落，而生长缓慢的小菌落可能是营养缺陷型。
逐个检出法：诱变后的孢子或菌体，经富集培养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长情况。
如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。
挑取孢子或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上，进一步复证[3]。
4.鉴定营养缺陷型菌株鉴定营养缺陷型一般采用生长谱法。
生长谱法：指在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况。
其原理是：在缺乏某种营养物质的，含有指示剂的培养基上接入某种微生物，再在接菌平板上置入这种营养物质，经一定条件培养后，即可通过指示剂变化情况来判断对不同营养物质的利用情况。
该法可以定性，定量地测定微生物对各种营养物质的要求，在微生物育种，营养缺陷型鉴定以及饮食制品质量检测等诸多方面具有重要用途。
三、实验材料及仪器3.1菌种：枯草芽孢杆菌。
3.2 培养基3.2.1 细菌完全培养基葡萄糖 0.5 g牛肉膏 0.3 g酵母膏 0.3 g蛋白胨 1 gMgSO4·7H2O 0.2 g蒸馏水 100 mLpH 7.2 100 Pa 灭菌20min。
3.2.2 细菌基本培养基葡萄糖 0.5 g(NH4)2SO4 0.2 g柠檬酸钠 0.1 gMgSO4·7H2O 0.02 gK2HPO4 0.4 gKH2PO4 0.6 g重蒸水 100 mLpH 7.2 100 Pa 灭菌20 min。
配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂，全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3 次。
3.2.3 无氮基本培养基在基本培养基中不加(NH4)2SO4 和琼脂。
3.2.4. 二倍氮源基本培养基在基本培养基中，加入2 倍(NH4)2SO4，不加琼脂。
3.2.5. 补充培养基(限制培养基)向配制好的液体基本培养基中加入0.1-0.5%的完全培养基，加入2%的琼脂。
注：配制基本培养基的药品均用分析纯，使用的器皿应洁净，需用蒸馏水冲洗2~3 次，必要时用重蒸水冲洗。
3.3溶液3.3.1. 部分氨基酸组合液另取20 种氨基酸按表1 组合成9 组氨基酸混合液。
1~5 组每组含4 种氨基酸，6~9 组每组含5 种氨基酸，添加至基本培养基后，使每种氨基酸同时在两组中出现，供营养缺陷型标记确认用。
表 1 氨基酸不同组合表3.3.2. 青霉素溶液10 000 u/mL。
3.3.3. 其他溶液磷酸缓冲液(pH 6.0，0.2 mol/L)、生理盐水、硫代硫酸钠溶液（0.5 mol/L)、亚硝基胍溶液（0.5mg/mL)。
（1）0.5 mol/L 硫代硫酸钠溶液(浸泡沾染过NTG 的破璃器皿)称取124 g 硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)，溶于蒸馏水中，定容至1000 mL，贮于棕色瓶中，保存备用。
（2） 0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 5.8、pH 6.0、pH 7.4)Na2HPO4·2H2O 相对分子质量为178.05，0.2 mol/L 溶液含35.61 g/L，称取35.61 g Na2HPO4·2H2O ，溶解于蒸馏水中，定容至1000 mL。
NaH2PO4·H2O 相对分子质量为138.01，0.2 mol/L 溶液含27.6 g/L，称取27.6 g NaH2PO4·H2O ，溶解于蒸馏水中，定容至1000 mL。
3.4 仪器台式离心机、旋涡混合器、恒温培养箱、电炉等。
无菌移液管、无菌试管、无菌离心管、无菌锥形瓶、无菌培养皿、无菌玻璃涂棒、无菌牙签或插有大头针的无菌软木塞、稀释分离、平皿菌落计数所需的无菌生理盐水和无菌器皿等。
四、实验步骤(一) 诱变处理1. 前培养取新活化的棒杆菌T6-13 斜面菌种—环，接入盛有20 mL 完全培养基的250 mL 锥形瓶中，30℃振荡培养14~16 h，再取1mL 培养液转接于另一盛有20 mL 完全培养基的250 mL 锥形瓶中，30℃振荡培养4~6h，使细胞处于对数生长期。
2. 菌悬液制备取10 mL 培养液于无菌离心管中，3500 r/min 离心10 min，弃上清液，打匀管底菌团，加入5mL 0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液，摇匀后倒入盛有45 mL 0.2mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液并带玻璃珠的100 mL 锥形瓶中，振荡10 min，调整细胞浓度为5×108 个/mL，用完全培养基平板菌落计数法测定总菌数。
3. 诱变处理(1) 称取0.5 mg NTG 于无菌离心管中，再加0.05mL 甲酰胺助溶，然后加入0.2 mol/LpH 6.0 磷酸缓冲液1mL，使完全溶解，用黑纸包好在30℃水浴中保温(临用时配制)。
NTG 是一种超诱变剂，需小心操作。
称量药品时，戴好塑料手套和口罩，称量纸用完后立即烧毁；取样需用橡皮头的移液管，绝不能直接用嘴吸，接触沾染有NTG 的称液管、离心管、锥形瓶等玻璃器皿，需浸泡于0. 5 mol/L 硫代硫酸钠溶液中，置通风处过夜，然后再用水充分冲洗；溶液外溢时，用沾浸硫代硫酸钠溶液抹布擦洗；诱变处理后含NTG 的磷酸缓冲液及稀释液，立即倒入浓NaOH 溶液中，若手接触NTG，应立即用水冲洗。
NTG 在可见光下会放出NO，使溶液颜色由土黄色变为黄绿色，故应放在棕色瓶中保存。
(2) 取4 mL 细胞悬浮液(5×108 个/mL 左右)加入上述离心管中，充分混匀，立即置30℃水浴振荡处理30 min(NTG 处理终浓度为100 ug/mL)后，离心收集菌体，将含NTG 的上清液倒入浓NaoH 溶液中弃去，用无菌水洗涤菌体3 次，以大量稀释法终止NTG 的诱变作用。
最后向离心管中加5 mL 无菌生理盐水，摇匀后从中取出0.5 mL NTG 处理后的菌悬液，用4.5 mL 生理盐水稀释至10-3 稀释度。
用倾注分离法在完全培养基平板上进行存活菌计数，每个稀释度做三个平皿，计算杀菌率。
4. 中间培养将1 mL 诱变处理洗涤过的菌液，加入装有20 mL 完全培养基的250 ml 锥形瓶中，30℃振荡培养过夜(时间不宜太长，否则同一种突变株增殖过多)。
(二) 淘汰野生型(青霉素法)1. 饥饿培养取10 mL 中间培养液，3500 r/min 离心10 min，弃上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体3 次，加到无氮源的基本培养基中，30℃振荡培养4~6 h。