用16S rDNA方法鉴定细菌种属
用16S rDNA 方法鉴定细菌种属
一、实验目的
1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；
2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、实验原理
细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。
16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。
16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。
在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。
16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：
细菌基因组的提取：
PCR 的基本原理 ：
PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
二、操作步骤
1、细菌基因组DNA提取；
2、PCR扩增；
3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；
4、扩增片段回收；
5、DNA片段测序。
三、结果处理与分析
在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，，则凝胶为400mg，因此加入的Binding Buffer为1200μl。
我们小组选用B1 16S sequence，以下为制作进化树过程：
1、根据B1 16S 基因序列，到NCBI 上比对，确定其种属
（1）NCBI 主页（/）依次点击进入BLAST
（2）选择nucleotide BLAST
（3）将B1 序列复制到文本，框里Choose Search Set 处点复选按钮others，最后点BLAST （4）点击BLAST后，数据进行提交。
BLAST 结果如下：
图中“Evalue”指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totle score）都是数值越高相似度越高。
我组将数据按照Query cover从100%开始从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据。
（5）导出数据
数据导出格式选择FASTA：
（6）选择大肠杆菌作为外属，导出大肠杆菌
（7）下载MEG并安装，我组使用的是MEGA5.02，并将B1序列导入MEG
（8）通过Edit中的Copy及Paste将B1序列和大肠杆菌序列导入我们选中的14个序列中
（9）选择W 中Align DNA，然后点击OK
（10）选择Date中的MEGA Format，生成meg文件
（11）打开.meg文件
（12）生成进化树
（13）导出文件，我组导出PDF格式
2、进化树
B1应该属于Proteus（变形杆菌属）
电泳图谱：
从右数第四个
条带为本组电
泳条带，条带清
晰且明亮，无明
显拖尾以及弥
散，表明DNA
提取和PCR扩
增非常顺利，所
得目的片段完
整，数量较多。
四交流与讨论
1.细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。
16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。
而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此我们选择16S rRNA 进行提纯测序
2.用试剂盒提取RNA，一定要注意盒内药品名称，不要弄错
3.提取DNA过程中，加入GA缓冲液后，一定要小心吹打混匀，但要注意不要产生气泡。
4.制作PCR扩增产物的过程中，第一步要先加水，因为DNA液和其他药品太少，不事先加水，会是使其他样液加到离心管壁上或根本加不进来，造成样液损失。
5.我组的DNA电泳虽然亮度略低，但是PCR产物条带清晰明亮，同时并无拖尾现象，说明我组DNA扩增之后含量很高，而且质量也很好
6.PCR反应五要素：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+作为聚合激活剂）。
通过这次实验我学到了鉴定细菌种属的一种方法，16Sr DNA法，虽然按照试剂盒进行实验操作非常简单，但这次实验的目的并不在于完成一次实验得到实验结果，而在于通过这一次实验学会举一反三，切实地应用到以后的科研实验中去。
关于试剂盒的使用，我们不仅要明白如何使用，更要清楚其原理，明白用代称命名的一些试剂的用途以及可能成分，这非常有利于以后的科研工作。
同时，操作过程中严格按照步骤进行，注意试剂的使用不要出错。
电泳图谱中第一块胶是提完DNA之后、进行PCR之前的样品所跑的电泳条带，能看出条带的表明提取到了DNA，第二块胶是PCR胶，条带明亮而集中不弥散的表明PCR扩增顺利。
提取到DNA，但PCR胶无条带的可能是由于构建PCR体系时所加试剂有误。
制作进化树时需要用到英文网站以及一些软件，学会浏览英文网站，自学使用不熟悉的软件解决问题将成为将来科研工作道路中的重要技能。
16SrDNA对四种常见细菌中的鉴定与应用
Ａｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ Ｆ ｏ ｕ ｒ Ｋｉ ｎ ｄ ｓ ｏ ｆ Ｃｏ ｍｍｏ ｎ Ｂａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｂ ｙ １ ６ Ｓ ｒ ＤＮＡ
Ｐ Ｃ Ｒ ．ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｗ ａ ｓ ｌ ５ ０ ０ ｂ ｐ ｂ ｙ １ ６ Ｓ ｒ Ｄ ＮＡ ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｌ ａ ｐ ｉ ｒ ｍｅ ｓ． ｒ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｂ ｌ ａ ｓ ｔ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ Ｇｅ ｎ ｅ Ｂ ａ ｎ ｋ ．Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ：ｔ ｈ ｅ Ａ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉａ ｒ Ｗ ｓ ａ ｔ ｈ ｅ Ｅ ｎ ｔ ｅ ｏｂ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｓ ｐ，ｔ ｈ ｅ Ｂ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉａ ｒ ｗ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｐ ｕ ｍｉ ｌ ｕ ｓ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ，ｔ ｈ ｅ Ｃ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉａ ｒ Ｗ ｓ ａ ｔ ｈ ｅ Ｅｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｄ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉａ ｒ ｗ ａ ｓ ｔ ｈ ｅ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｕ ｓ ｖ ｕ ｌ ｇ ａ ｒ ｉ ｓ ，ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｍｉ ｌ ａ ｒ ｉ ｔ ｙ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｗａ ｓ ｒ ｅ ａ ｃ ｈ ｅ ｄ ９ ９ ％ ．ｉ ｎ ｉ ｔ ｉ ａ ｌ ｌ ｙ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ Ａ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉａ ｒ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ — ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｓ ｐ．ｔ ｈ ｅ Ｂ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉ ｒ ａ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｐ ｕ ｍｉ ｌ ｕ ｓ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ。ｔ ｈ ｅ Ｃ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉ ｒ ａ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｄ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉａ ｒ ｉ ｄ ｅ ｎ — ｔ ｉ ｆ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｕ ｓ ｖ ｕ ｌ ｇ ａ ｒ ｉ ｓ ．Ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｅ ｉｍｅ ｒ ｎ ｔ ａ ｉ ｍｅ ｄ ｔ ｏ ｐ ｏｖ ｒ ｉ ｄ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｔ ｈ ｅ ｏ ｒ ｅ ｔ ｉ ｃ ｌ ａ ｂ ａ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ｌ ａ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉａ ｒ ｂ ｙ １ ６ Ｓ ｒ ＤＮＡ．
16S鉴定细菌的种属
16S rDNA在原核生物中普遍存在。
16 S rDNA的相对分子量大小适中，约1500 bp，便于序列分析。 在16S rRNA分子中， 既含有高度保守的序列区域，又有中度保
守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类
生物亲缘关系的研究。 bp=base pair
图 16S rDNA基因组成（灰色为保守区，绿色为可变区）
16S rDNA基因全长1542 bp，由9个可变区和10个保守区组成。其中保守区反 映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则表明物种间的差异，且变异程度与细 菌的系统发育密切相关。
DNA的提取
挑取单菌落,然后置于装有100 μLPrepMan Ultra的离心管中, 涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机 最大转速离心 3min ，取 10μL 上清液与 490μL ddH2O （即稀 释50 倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。提取的DNA 于-20℃保存。
利用16S rDNA鉴定细菌 的种属
1.什么是 16S rDNA？ 16SrRNA 为原核生物核糖体 RNA 的一个亚基， 16SrDNA 就是编
码该亚基的基因。 原核生物的rRNA含有3种类型：23S、16S、5S rRNA，它们分别
含有2900、1540和120个核苷酸。
2.用16S rDNA进行细菌鉴定的原因
检测：核酸蛋白仪/琼脂糖凝胶电泳
525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3'
试剂使用量（ 20μL体系）
模板DNA （10ng~100ng） 2μL
PCR 反应条件
Taq 酶(5U/μL)
10×Taq Buffer(Mg2+) dNTPs(2.5mM) 引物F(10 μM) 引物R(10 μM) ddH2O
16SrDNA鉴定菌株地实用标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well ThermalCycler ； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130 3.2 试剂DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra ；琼脂糖；PCR 试剂：Taq 酶，10×Taq Buffer(Mg 2+)，dNTPs ，ddH 2O 等； ExoSAP-IT ；测序试剂：BigDye Terminator ，5×Sequencing Buffer ；BigDye XTerminator Purification Kit ； 3.3 耗材移液器吸头：1000μL 、200μL 、10μL ；离心管：1.5mL 、200μL ；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate ；Micro Amp TM Optical Adhesive Film ； 3.4 引物16SrDNA 名称 序列扩增长度 第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 500 bp 左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 第2部分 正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分 正向引物926F 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 560 bp 左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'4. 操作流程5. 实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator ddH2Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well ReactionPlate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp左右反向引物519R5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4.操作流程5.实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
用16S rRNA基因序列鉴定细菌
Ezbiocloud比对，下载同源序列
培养细菌 提取基因组DNA PCR扩增16S rRNA基因 产物电泳检测，测序 Ezbiocloud比对，下载同源序列 MEGA比对和分析
1. 测序结果的分析和处理 一个测序反应结果包括两个文件，序列文件用记事本
打开，图形文件用Chromas软件打开观察。打开图形文件， 确认测序结果良好，并去除序列文件中两端不准确的部分， 得到最终的测序结果。 2. 同源序列下载
CVV
C
VC V C V
C VC V C V C V C
Prmier 1492R
细胞生物共有，功能重要，多拷贝，保守区和多变区组成，适合扩增和序列相似性分析。 ➢ 研究物种间进化和分类。 ➢ 根据16S rRNA基因序列鉴定待测菌株。 ① 同种细菌序列相似性≥98.7%，但序列相似性≥98.7%≠同种； ② 用待测菌株及相似性较高的菌株16S rRNA基因序列构建系统发育树（Phylogenetic
1. 构建系统发育树 系统发育分析后的结果文件，用mega 6软件中的邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。 2. 整理系统发育树，确定待测菌株属名
产物电泳检测，测序
Ezbiocloud比对，下载同源序列 MEGA分析
构建系统发育树，确定种属
用Neighbor-Joining法构建系统发育树
用16S rRNA鉴定细菌流程
培养细菌 提取基因组DNA PCR扩增16S rRNA基因 产物电泳检测，测序 Ezbiocloud比对，下载同源序列 MEGA比对和分析 构建系统发育树，确定种属
PCR扩增16S rRNA基因
1. PCR体系（50 μL）
引物27F （20 mmol/L） 引物1492R（20 mmol/L） 基因组DNA 双蒸水 2×PCR SuperMax（+dye）
16SrDNA鉴定细菌的方法
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组 DNA,2.设计/选择引物进行 PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA 勺提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
)。
1.21M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0) (1L): 121.1g Tris，加浓盐酸约(70ml,60ml, 42ml ),高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH,每升高1C, pH大约下降0.03 个单位。
(Tris-HCl 缓冲液(0.05mol/L , 25C) 50ml 0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至 100ml。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一 )1.30.5M EDTA (pH8.0) (1L): 186.1g Na2EDTA?2H2O 用NaOH调pH 至8.0约20g ),高温高压灭菌，室温保存。
(配置方法1.称取186.1g Na2EDT?2H2O置于1L烧杯中。
2.加入约800mL的去离子水，充分搅拌。
3.用NaOH调节pH值值8.0 (约20g NaOH。
注意：pH值至8.0 时，EDTA才能溶解。
4.加去离子水将溶液定容至1L。
5.适量分成小份后，高温高压灭菌。
6.室温保存。
)1.410X TE Buffer (缓冲液)(pH7.4，7.6，8.0) (1L):组分：100 mMTris-HCl ，10 mM EDTA 1M Tris-HCl ( pH7.4，7.6，8.0 ) 取100ml，0.5M EDTA(pH8.0) 取20ml。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；页脚内容2Micro Amp TM Optical Adhesive Film ；3.4 引物16SrDNA 名称 序列 扩增长度第1部分 正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp 左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp 左右反向引物1492R 5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:14. 操作流程5.实验方法5.1核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min后，以离心机最大转速离心3min，取10μL上清液与490μL ddH2O（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。
16S rDNA
２ Ｏ１ ５， ３１ （ １ １ ）
Ｃｈｉ ｎｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｚｏ ｏｎｏ ｓ ｅ ｓ １ Ｏ １ ７
ＤＯＩ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ， ｉ ｓ ｓ ｎ １ ０ ０ ２ —２ ６ ９ ４． ２ ０ １ ５． １ １ ０ ０ ６
２ ．Ｓｔ ａ ｔ Ｋｅ ｙ Ｌａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｆ ｏ ｒ Ｊ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｕ ｓ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ Ｃｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ａ ｎ ｄ Ｐｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｏ ｎ．
Ｎａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｆ ｏ ｒ Ｃｏ ｍｍｕ ｎ ｉ ｃ ａ ｂ ｌ ｅ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ Ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ａ ｎ ｄ Ｐｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｏ ｎ，Ｂｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ １ ０ ２ ２ ０ ６ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ３ ．Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ Ｃｈ ｉ ｎ ａ，Ｈｅ ｎ ｇ ｙ ａ ｎ ｇ ４ ２ １ ０ ０ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ）
Ｉ ｎ ｔ ｈ ｉ ｓ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ，ｗｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｅ ｄ ４ ９ Ｎｏ ｃ ａ ｒ ｄ ｉ ａ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｂ ｙ ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｅ ｒ ａ ｓ ｅ ｃ ｈ ａ ｉ ｎ ｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ（ Ｐ ＣＲ）ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ Ｄ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｗｅ ｒ ｅ
１ ６ Ｓ ｒ Ｄ ＮＡ 序 列 中 ， １ ６ Ｓ ｒ ＤＮ Ａ 能将 诺 卡 菌 大 致 可 分 为 １ １群 ， 除 了不 能将 亚 种 分 离 外 ， 诺 卡菌其他 种属均 能得 到很好 的分离。 诺卡菌 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ ＮＡ 种 内及 亚 种 内相 似 性 为 ９ ９ ． １ ～ １ ０ ０ ； 种 间相 似 性 在 ９ ５ ． ７ ～ ９ ８ ． ８ 之 间 。结 论 １ ６ Ｓ ｒ ＤＮ Ａ 序 列分
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator ddH2Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well ReactionPlate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp左右反向引物519R5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4.操作流程5.实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16S鉴定细菌的种属精品PPT课件
特异引物扩增１６ＳｒDNA序列：这个过程一般先用Primer Premier 来设计引物，接下来在利用PCR进行特征序列的扩增。如果是乳酸菌 可以用通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1495r： 5′- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。以下是我已Enterococcus KLDS 6.0610的16SrDNA为例设计的引物
验证ＰＣＲ产物 扩增是否成功
选取近似菌种序列 构建系统发育树
与数据库中已知 细菌比较获得样品
种属信息
ＤＮＡ测序获得 １６ＳｒＤＮＡ序列
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1.弃尽培养液，向培养皿中加入650 μl的Solution A，室温静置1分钟。 2. 用移液枪的取650 μl的细胞悬浮液转移至Collection Tube中。 3.加入0.8 μl的RNase A1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟。 4. 弃去上层有机相，再加入1 ml的4℃预冷的Solution C充分混匀后12,000 rpm离心2分钟 5. 弃去上层有机相，然后将水相溶液转移至置于Collection Tube上的Filter Cup中 6. 弃Filter Cup，在滤液中加入400 μl的DB Buffer，混合均匀。 7. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。将上述操作6混合溶液转移至 Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 8. 将500 μl的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 9. 将700 μl的Rinse B加入至Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 10. 重复操作步骤9。 11. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入 50～200 μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 12. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA。