S_rDNA鉴定细菌的方法
16SrDNA对四种常见细菌中的鉴定与应用
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菌种鉴定方法及手段真菌细菌检测
菌种鉴定⽅法及⼿段真菌细菌检测菌种鉴定⽅法及⼿段真菌检测/细菌检测菌种鉴定⼀般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA⽚段，上GeneBank 或者Eztaxon对⽐即可。
⼀般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌。
常规鉴定常规鉴定内容有形态特征和理化特性。
形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利⽤能⼒、各种代谢反应、酶反应和⾎清学反应等。
⾃动鉴定BIOLOG鉴定系统以微⽣物对不同碳源的利⽤情况为基础，检测微⽣物的特征指纹图谱，建⽴与微⽣物种类相对应的数据库。
通过软件将待测微⽣物与数据库参⽐，得出鉴定结果。
该系统已获美国FDA认可，已逐步应⽤于⾷品和饮品企业、环保、海洋⽣物/⽔产品、制药、农业微⽣物、⽣物治理、化妆品、临床等领域的微⽣物鉴定试验中。
拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及⾰兰⽒阴性菌、⾰兰⽒阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微⽣物。
分⼦⽣物学鉴定应⽤分⼦⽣物学⽅法从遗传进化⾓度阐明微⽣物种群之间的分类学关系，是微⽣物分类学研究普遍采⽤的鉴定⽅法。
科标⽣物检测中⼼拥有微⽣物菌种分类鉴定的分⼦⽣物学实验室，配有PCR仪、⾼速冷冻离⼼机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。
可采⽤核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。
API细菌鉴定API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种⽣化反应，已可鉴定超过600种的细菌。
鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的⽣理⽣化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参⽐，得出鉴定结果。
可应⽤API50CH系列、API20E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进⾏鉴定。
16SrDNA鉴定菌株地实用标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well ThermalCycler ； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130 3.2 试剂DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra ；琼脂糖；PCR 试剂：Taq 酶，10×Taq Buffer(Mg 2+)，dNTPs ，ddH 2O 等； ExoSAP-IT ；测序试剂：BigDye Terminator ，5×Sequencing Buffer ；BigDye XTerminator Purification Kit ； 3.3 耗材移液器吸头：1000μL 、200μL 、10μL ；离心管：1.5mL 、200μL ；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate ；Micro Amp TM Optical Adhesive Film ； 3.4 引物16SrDNA 名称 序列扩增长度 第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 500 bp 左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 第2部分 正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分 正向引物926F 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 560 bp 左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'4. 操作流程5. 实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator ddH2Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well ReactionPlate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp左右反向引物519R5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4.操作流程5.实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16S rDNA序列分析鉴定一株芽孢杆菌
２ Ｅ ｐ ｒ ｅ ｔ ｅｔｒｏ ｃ ｎｉｃＲ ｓａｃ， ｈｎ ｄ ｄｃｌ ｏｌ ｅ Ｃ ｅｇ ｕ６ ０ ８） ． ｘｅｉ ｎ Ｃ ｒｅｆ ｒ ｉ ｔ ｅｅｒｈ Ｃ ｅｇ ｕＭｅ ｉ ｌｇ， ｈｎｄ １０ ３ ｍ ｉ Ｓｅ ｆ ａＣ ｅ
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（． １ 四川 省 食 品发 酵工 业 研 究 设 计 院 ， 都温 江 成 ６ １３ ； ． 都 医 学 院科 研 实 验 中心 ， 都 ６ ０ ８ ） １１ ０ ２ 成 成 １０ ３
利用16S rDNA建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌
（8::?） （&） 9? cB ‘%,P71" #) ’& T J :0)’ ;"0%2<"2&27"0’ 6"("0’ 鸭疫里默氏菌 ! " !# 型参考菌株 表%
204)5% 6<= AABC AABC AG=2 AG=2 6<= AG=2 AG=2 AG=2 !"#$% 8
构建种特异性引物所选细菌的 !+, -./0 基因的 1234536 登陆号
因此， 虽然从病死鸭中极易分离到 FJ， 采 很相似 ， 用某些表型指标也易与大肠杆菌、 沙门氏菌等感染
［"］ 鸭的常见菌相区分 ， 但仅依据表型却不足以对 FJ 做出准确鉴定。此外， 检测细菌的表型必需首先进
［#］
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材料和方法
材料
行细菌的分离培养， 若检测污染的样品、 研究 FJ 的 传播等流行病学问题时并不适用， 故建立鉴定 FJ 的分子方法十分必要。 由于 #"G ,HIJ 基因分子结构上的高度保守性、 分布的普遍性及其所含的大量信息， 使 #"G ,HIJ 基 因成为了一个较为理想的基因分类靶序列 。对其 序列进行分析、 根据序列分析结果设计种特异性引 物进行 DEF 扩增， 已被证明在细菌分类鉴定上具有 也已经用到 重要 价 值 。在 FJ 的 分 类 研 究 中，
将基因组 6HI 从 &: a & W &: a @ 进行 &: 倍梯度稀释， 各取 & = 进行 FA< 扩增。从培养 &?’ 的 !2I 平板 ! 上挑取 ; W ? 个菌落加入到 D:: = 的 :X>;Y H"A$ 溶 ! 液中， 漩涡混匀， 用麦氏比浊法确定其菌落形成单位 数量， 用生理盐水从 &: a & W &: a ( 进行 &: 倍梯 （ A‘B） 度稀 释， 离 心 去 上 清， 加 同 等 体 积 双 蒸 水 或 ;Y 煮沸后离心取上清， 各取 & A’%$%[&:: 缓冲液， =进 ! 行 FA< 扩增。 !$* 临床病例的检测 随机选取 D 个鸭场的病死肉鸭 &8 只， 分别使用 以验证所建立 FA< 传统方法和 FA< 方法进行检测， 方法的可靠性与敏感性。传统方法包括用 !2I 分 离细菌、 麦康凯鉴别培养、 生化试验以及血清型鉴 定， 生化指标包括糖发酵 （葡萄糖、 麦芽糖、 果糖、 甘 露糖、 甘露醇、 乳糖、 蔗糖） 、 硫化氢、 尿素酶、 明胶液 化、 西蒙氏枸橼酸盐利用、 硝酸盐还原、 触酶， 结果判 。病料中 FA< 模板的制备方法 断参照文献 ［&，&:］ 如下： 取 病 死 鸭 的 脑 或 肝 组 织 约 &NND ， 捣 碎， 加 漩 涡 混 匀， ;:: = 灭 菌 生 理 盐 水， &:::: Z P 离 心 ! 弃上清， 重复一次。沉淀加 ;:: ;N.,， = &:Y A’%$%[ ! 混匀， 然后于 &::V 作 &:: 缓冲液， ;?V 作用 D:N.,， 用 &:N.,， 离心 ， 取上清 &8::: Z P ;N., 8 = 作为 FA< ! 反应模板。
16S—23SrDNA区间序列—一种分类及鉴别细菌的新方法
16S—23SrDNA区间序列—一种分类及鉴别细菌的新方法傅君芬
【期刊名称】《国外医学：流行病学．传染病学分册》
【年(卷),期】1998(025)006
【摘要】１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ区间序列是继１６ＳｒＲＮＡ后又一分类及鉴别细菌的新方法，它集保守性和可变性于一身，不但可用以菌种间鉴别。
【总页数】5页(P245-249)
【作者】傅君芬
【作者单位】浙江大学附属儿童医院
【正文语种】中文
【中图分类】R372
【相关文献】
1.16S rRNA基因序列分析技术在细菌分类中应用的研究进展 [J], 杨霞;陈陆;王川庆
2.基于16S rRNA和HSP60基因序列分析粘细菌孢囊杆菌亚目形态分类的种属之间的亲缘关系 [J], 蒋德明;周秀文;田晓翔;吴志红;李越中
3.16srRNA序列同源性分析与细菌系统分类鉴定 [J], 焦振泉
4.一种基于动态鉴别性序列的多变量时间序列分类方法及在阳极电流信号上的应用[J], 万晓雪; 陈晓方; 桂卫华; 岳伟超; 谢永芳
5.一种基于动态鉴别性序列的多变量时间序列分类方法及在阳极电流信号上的应用[J], 万晓雪; 陈晓方; 桂卫华; 岳伟超; 谢永芳
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16SrDNA和recA—gene对乳酸菌Ⅱ32的鉴定
产生试 验 ．
分子生物学方法是利用乳 酸菌 的遗传 物质 核酸 ， 结合 Ｐ Ｒ技术 、 Ｃ 电泳技术 等分 子生 物
学实验方法对乳酸菌进行分类和鉴定 ． ＦＰ ｒ ＡＬ，ｐ ｅ
—
１２３ 乳酸菌Ⅱ２ Ｄ Ａ的提取． ｌＬ培 ．． ３总 Ｎ 取 ｍ 养 ｌｈ ８ 的菌液， 加入 １ Ｌ ． ｍ 离心管， ３３ ｒ ｉ离 ５ 于 ００ ／ ｎ ｒ ａ
主要试剂 ：Ｎ Ｄ Ａ提取用试剂盒（ａ ａ ）Ｄ Ａ ＴＩ 、Ｎ （ 凝胶 回收纯 化试剂 盒 （ ｅ ． ， ａａ ａ 、 Ｖｒ ０ ＴＫ Ｒ ）琼脂糖 ２ （ 日本 ） Ｔｐｃ ｅ ｐｐ ｎ （ 国 ） Ｓｒｉ ｌ． 、 ｙｔａ ｅｔ ｅ 法 ｉｓ ｏ 、ｏ ｔ Ｉ ｂａ ｌ ｎ ｏ
离心 ｌｉ， ｍｎ去上清液． １ Ｌ 用 移液器加入 ２ － ｍ ０ ｕ Ｉ ０ Ｌｎ ｓＧｎ Ｍ ａｉ 摇匀后恒温水浴锅 ５℃保温２ ｉ， ｔ ｅｅ ｍ ｔ ， ａ Ｔ ｒ ｘ ６ ０ ｎ ｍ
取出离心管置于旋涡混合器高速振荡 １ ｓ加热 ０ ．
１ 材 料与方法
１１ 材料与 试剂 ．
且可用于生产其他发酵食品和食 品添加剂， 因此
对乳酸菌进行快速 、 可靠 的分类和鉴定在微生物 学和食品科学的研究 中是必需的ｌ． 内外有很 １国 】
多应用经典方法如细菌的菌落特征、 菌体形态 、 生
ｎｏ ａ （ ｏ ｅｔ 法国）Ｐ Ｒ各种试剂（ａａ ａ ； ｌｅ 、Ｃ ＴＫ Ｒ ）化学试剂 均为分析纯 ． 菌株 ： 乳酸菌 Ｉ３（ Ｉ２本实验室 自辣白菜中分离 保存 ） ．
・
５ － Ｏ
ｒ Ａ－ ｅ ｅ
值， 估计提取 物核酸 的纯度 ， 酸粗略浓 度 Ｃ 核 ＝ Ａ ６ ＊ ０ｕ ｍ ） ｎ稀释倍数） Ｊ ２０ ５ （￣ Ｌ ＊ （ ． １２ ５ Ｐ Ｒ扩增条件 的确 定 ． ．． Ｃ 将提取 的总
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16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1.1 培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高约下降0.03个单位。
(Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml 0.1mol/LTris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一)1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g N a2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
(配置方法1. 称取186.1g Na2EDTA•2H2O，置于1L烧杯中。
2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌。
3. 用NaOH调节pH值值8.0（约20g NaOH）。
注意：pH值至8.0时，EDTA才能溶解。
4. 加去离子水将溶液定容至1L。
5. 适量分成小份后，高温高压灭菌。
6. 室温保存。
）1.4 10×TE Buffer(缓冲液）(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
1.5 10%SDS（W/V）：称10gSDS，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl 平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。
浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。
11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。
12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。
13、EB：10 mg/ml。
称取1g溴化乙锭定容至100ml。
棕色瓶室温避光保存。
EB 的工作浓度为0.5ug/ml。
当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。
（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等）14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。
无需预处理。
15、RNase A：10 mg/ml。
25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。
）1.1细菌基因组DNA提取基本步骤：材料准备核算分离、纯化沉淀或吸附核酸，并去除杂质基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。
不同的方法所选择的试剂会有所不同。
1 快速微量提取法取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。
加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37o C水浴1hr。
然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。
取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次。
将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h-5h。
用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次。
（取上清液。
乙醇沉淀DNA。
用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。
3细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。
细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。
菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。
再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。
（此时菌液应为透明粘稠液体）。
抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。
12000rpm离心10min。
抽提两次。
（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）。
沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。
1 2000rpm离心10。
洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。
抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。
作PCR模板用。
5 CTAB/NaCl裂解法接两环菌（0.75ml甘油管菌液）于25ml LB培养基中，37℃、200r/min培养24h。
取1.5ml菌液于1.5ml Eppendorf 离心管中，8000r/min离心5分钟,弃去上清。
加入1.5ml TE离心洗涤后,用567 ul TE溶解菌体,混匀。
加入30μl 10%SDS和3 ul 20 mg/ml的蛋白酶K（100 ug/ml），混匀，于37℃温育1h。
加入100μl 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。
加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)（0.8ml）,混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。
上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)(0.8ml),混匀,12000r/min 离心5分钟,保留上清。
加入0.6倍的异丙醇（0.48ml）,轻轻混合直到DNA沉淀下来（0.5h）,12000r/min离心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min 离心5分钟洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5h。
用50 ul双蒸水溶解DNA, 加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃保存。
用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA , 每孔点样6μl (4μl样品+ 2μl loading buffer) , 80 V , 电泳1.5小时。
2.设计选择引物进行16S rDNA的PCR扩增一般细菌鉴定选择通用引物，最常用的通用引物为27F/1492R。
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'2.1 实验原理2.1.1 PCR多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。
此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。
ＰＣＲ技术实际上是模拟体内DNA合成过程，是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。
反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。
PCR（Polymerase Chain Reaction) 的原理2.1.2 16SrDNA的核酸序列分析16SrDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrRNA）的基因，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。
16SrRNA的序列高度保守，可精确指示细菌之间的亲缘关系，16SrRNA的大小为1500bp左右，所含信息能反映生物界进化关系，易操作，适用于各级分类单元。
目前常用的是建立在PCR技术基础上的16SrRNA基因的直接测序法，方便快捷。
较之23SrDNA等看家基因而异，它具有分子大小适中，突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。
其序列包含10个可变区（variable region）和与之相同的11个恒定区（constant region），可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。
2.1.3 PCR法的操作过程Step 1: DNA热变性；Step 2: 引物退火；Step 3: 引物延伸2.2 PCR反应标准体系DNA模板引物反应缓冲液dNTPddH2O耐热聚合酶2.2.1 PCR反应体系各组分的作用和使用量及反应条件ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。