真菌分离以及培养
实验六 土壤中真菌纯化、分离和培养
土壤稀释液的制备和稀释液的取样
2、分离方法 采用稀释平板分离法。又可分为两种 方法。
混菌法和涂抹法。
混 菌 法
涂 抹 法
3、培养
将上述接种土壤悬液的平板 倒置于28℃培养3-5d。
4、挑菌纯化 5、计数
6、菌种保存
将分离到的真菌转接到PDA斜面上培 养，待长好后，置于冰籍中保存，必要时 进行深入研究。
?4挑菌纯化?5计数?6菌种保存将分离到的真菌转接到pda斜面上培养待长好后置于冰籍中保存必要时进行深入研究
实验六
土壤中真菌分离、纯化和培养
一、目的要求
掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法， 从而获得真菌纯培养技能；了解基本接 种技术。
二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发 现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。 不同土样中各类微生物数量不同，一般土 壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。 本次实验从土壤中分离真菌。
三、仪器和材料
样品：新鲜土壤 培养基：加有2ml链霉素的PDA培养基。 无菌水：装有9mL无菌水的试管4支。 其它：无菌培养皿4皿、无菌吸管、酒精 灯、培养箱等 。
四、真菌纯种分离的操作方法
1、土壤稀释液的制备
用“稀释平板计数法”中的方法 进行，将土样稀释至10－5。
将1瓶土壤菌液（称取土样10g放入盛90 mL无菌水）和4管9mL的无菌水排列好， 按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依次编号。 在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸 取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水 中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓 度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。 注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯 度的菌液需换用不同的吸管。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
实验五真菌的分离培养及形态观察
实验五真菌的分离培养及形态观察真菌分离培养应考虑所分离真菌的特性，配制合适的培养基，选择所需的气体环境。
同时, 由于真菌分离材料常污染有大量细菌，所以可在培养基中加入抗菌素并在分离培养过程中严格执行无菌操作。
目的要求1．掌握真菌分离培养方法。
2．认识真菌菌落的特征，比较与细菌菌落有何不同。
3．了解真菌载片培养法。
4．掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。
操作步骤—、真菌的分离培养方法（－）平板划线分离法1．取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。
2．取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。
3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。
4．划线完毕，置温箱中培养2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。
如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。
另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。
（二）稀释分离法1．取盛有无菌水的试管5支（每管9ml），分别标记1、2、3、4、5号。
取样品（如田土等）1g，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。
2．用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。
注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。
3．用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。
然后倒置温箱中培养，2～5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。
二．真菌培养性状观察（一）真菌在固体培养基上的生长表现1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。
菌类的分离和培养技术
菌类的分离和培养技术菌类（Fungi）是一类生物体，包括真菌（True Fungi）和微生物（Microfungi）两个大的类群。
菌类在生物圈中具有广泛的分布和重要的生态功能。
为了研究和利用菌类，科学家们开发了一系列分离和培养技术，以便从自然环境中获取纯种菌株以及大规模培养和应用特定的菌株。
本文将介绍菌类的分离和培养技术的基本原理和常用方法。
一、菌类的分离技术菌类的分离是指从混合菌群中获得纯种菌株的过程。
分离技术的关键是保持菌种的纯度和活力。
下面介绍几种常用的菌类分离技术。
1. 表层分离法表层分离法是最常用的菌类分离技术之一。
它适用于土壤、水域等含大量微生物的环境。
具体操作步骤为：取样→稀释→接种→均匀涂布→培养。
通过稀释操作可以使菌落分布在培养基表面，然后进行培养。
最后通过单菌落转接到新的培养基中得到纯种菌株。
2. 筛选法筛选法适用于需要寻找特定菌株的情况，例如寻找产生特殊代谢产物、拥有特定生态功能的菌株等。
筛选方法一般包括抗生素筛选、生理代谢筛选或染色筛选等。
在培养基中添加适当浓度的抗生素或其他化合物，只有目标菌株具有耐受能力，才能生长并形成菌落。
3. 寄主种菌法寄主种菌法是一种利用特定寄主与菌株共生的技术。
例如，某些菌株只通过与某种植物的根系共生才能生长。
通过将寄主植物的根系或其他寄主组织接种到含有该菌株的培养基上，就可以分离出特定的菌株。
二、菌类的培养技术菌类的培养是指将分离得到的纯种菌株在合适的环境条件下进行大规模的培养和繁殖。
下面介绍几种常用的菌类培养技术。
1. 液体培养法液体培养法是最常用的菌类培养方法之一。
通过将纯种菌株接种到含有营养物质的液体培养基中，利用摇床或震荡培养箱等设备进行培养。
液体培养法适用于大量培养、产生菌体、代谢产物等应用。
2. 固体培养法固体培养法是将菌株接种到固体培养基上，培养出菌落后进行培养的方法，常用的固体培养基有琼脂培养基等。
固体培养法主要用于分离和筛选菌株。
一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011
4．常规分离方法 •植物病原真菌的分离方法主要有两种：
组织分离法和稀释分离法。
•组织分离法是最常用的方法. •稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子 的病原真菌的分离。
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4.1 组织分离法
植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。 就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水 洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。 切取组织的大小要适宜，一般可将较大的 组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭 菌水洗过以后培养。
4、灭菌
制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。 分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干 /烘干、包装好，进行干热灭菌。 灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。 高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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4.2.1 孢子分离法
产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)
、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属
(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属
(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或
划线法分离。
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许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以
2）向装有病组织的小碟中加入70%酒精
（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉 酒精。
注:先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，
减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间 较短(一般数秒至lmin)。
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3）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠
溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间 可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。
病原菌的分离培养和纯化
普通植物病理学实验十七、病原菌的分离培养和纯化一、目的要求1了解分离与纯化微生物的基本原理及方法;2掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术;3掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法;二、基本原理植物病原菌的分离培养,是植物病理实验室工作中的基本技能;为了获得某微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜的生活条件,即让病原菌生活在适宜的培养基上,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而得到纯菌株;植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种;最常用的方法是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离;病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用,在有些情况下也采用稀释分离法;为了获得分离菌的纯培养,必须要进行分离菌的纯化,纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法;三、材料、仪器与用具1．材料依当地情况进行选择,下列材料供参考1稻瘟病叶、病节、病穗颈pyricularia orycae;2玉米大斑病叶exserohilum turcicum;3玉米弯孢菌叶斑病叶curvularia lunata;4玉米小斑病叶bipolaris maydis;5番茄灰霉病果botrytis cinefca;6黄瓜菌核病果sclerotinia sclerotiorum;7黄瓜细菌性角斑病叶pseudomonas syringaepv．1achrymans;8水稻白叶枯病叶xanthomonas campestms pv.oryeue;9大豆细菌性斑点病叶pseudomonas syringaepv．glycinea;10白菜软腐病叶erudnia carotovora subsp．carotovora;2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等;3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲针、接种环铒、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等;0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml;先将升汞溶于盐酸中,待充分溶解后,再加水稀释;升汞是剧毒药物,在操作时应特别小心;四、实验操作一病原真菌的分离1．组织分离法按照以下步骤进行：1取灭菌培养皿一个,置于湿纱布上,在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名;提示：为了保证无菌操作,应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内,工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净,工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中,特别在使用无菌操作间时,呼吸要轻,不要说话;2用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴可减少细菌污染,然后将融化而冷至60c左右的pda培养基倒人培养皿中,每皿倒10--15ml,轻轻摇动使之成平面;凝固后即成平板培养基;提示：加入25％乳酸1～2滴,可基本保证平板上不出现污染细菌苗落;除乳酸外,在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长,也是常用的方法;加青霉素20μg／ml可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b5．0μg／ml可以抑制g—细菌生长；加链霉素40μg／ml或氯霉素50μg／ml可以抑制大部分细菌的生长;除了氯霉素可在灭菌前加入外,其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右以手背触三角瓶感到烫,但尚可以忍耐为宜’时加入;倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领,不必在火焰上方,一般很少污染;3取真菌叶斑病的新鲜病叶或其他分离材料,选择典型的单个病斑,用剪刀或解剖刀从病斑边缘病健交界处切取小块海边长3--4mm病组织数块;提示：选择新患病的组织作为分离的材料,可以减少腐生菌混入的机会;腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生,因此,一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离;4将病组织放人70％酒精中浸3—5s后,按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5rain也可使用其他表面消毒剂,如植物组织柔嫩,则表面消毒时间宜短；反之则可长些;然后放入灭菌水中连续漂洗三次,除去残留的消毒剂;提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡,减少表面张力,70％的酒精亦用于表面消毒,处理的时间较短一般数秒至lmin;升汞溶液消毒的时间因材料而异,可自30s至30min不等,一般情况下,需时间3,5min;5用无菌操作法将病组织移至平板培养基上,每皿内放4--6块;提示：在将病组织小块移放到平板表面之前,应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水,以大大减少病组织附近出现细菌污染; 6将培养皿倒置放人2512左右恒温箱内培养;一般3—4d后观察待分离菌生长结果;7若病组织小块上均长出较为一致的菌落,则多半为要分离的病原菌;在无菌条件下,用接种针铲自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上,在25℃左右恒温箱内培养,数日后,观察菌落生长情况,如无杂菌生长,即得该分离病菌纯菌种,便可置于冰箱中保存;提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外,还要在显微镜下检查,进一步确定;如果是对未知病原菌的组织分离,则要将长出的蕾落分别转出,通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌;在组织分离工作中,如果植物材料体积较大且较软如患灰霉病的番茄果实,在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培养基上,完成分离工作;2．稀释分离法1取灭菌培养皿三个,平放在湿纱布上,编号,并注明日期、分离材料及分离人姓名;2用灭菌吸管吸取灭菌水,在每一皿中分别注入0．5～1．0ml;3用移植环蘸一滴孢子悬浮液,与第一个培养皿中的灭菌水混合,再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中,混合后再移三环到第三个培养皿中;4将熔化开冷却到45～50c的培养基,分别倒在三个培养皿中为防止细菌污染,也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸,摇匀,凝固,要使培养基与稀释的菌液充分混匀;提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好,过热易将病原菌烫死而使分离失败,过冷则倒入培养皿中后难以形成平板,而成为起伏不平的表面,不利于分离;为大体估计培养基温度,可将盛培养基的器皿靠在人手背上,如果手背感到烫但尚可以忍耐,则大体为45~50c;5将培养皿翻转后置恒温箱2513中培养,数日后观察菌落生长情况;6挑菌;将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取,接种到斜面培养基上,置25℃左右培养;待菌长出后,检查菌是否单纯,若有其他菌混杂,就要再一次进行分离纯化,直到获得纯株培养;二病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用;在进行分离之前,首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断,即经过镜检确认有喷菌现象以后,才对该病组织作分离工作;稀释分离法是最经典的标准分离法,方法同上述真菌分离;除去上述稀释分离法以外,较为方便的是划线分离法：1预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中,凝成平板后,翻转放在30c恒温箱中2—4h,使表面无水滴凝结;也可凝成平板后直接使用;2将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min,再用无菌水换洗3次后,放在灭菌培养皿中的灭菌水中,用灭菌玻棒研碎,并让组织碎块在水中浸泡20—60min,让细菌释放到灭菌水中; 3用灭菌的接种铒接种环蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线,尽量不要把平板表面划破;划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线;灭菌后再划第三次线;提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要,这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大;4用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后,翻转培养皿,放在26～28c恒温箱中培养;1—3d后观察有无细菌生长,在哪些地方有单菌落生长出来其中的优势单菌落应为待分离菌形成的;5仔细挑取病原菌的单菌落,并移植到斜面培养基上;同时,再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离,经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致,并与典型描述的特征相一致时,即表明已获得纯培养;最好要经过连续三次单菌落的分离,才能确保纯化;三真菌、细菌培养性状观察1．真菌培养性状观察取已分离、纯化的某种真菌菌种,按前述稀释分离法中1--5步骤进行,待某培养皿中形成单个菌落后观察;记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等;同时要记载培养基种类成分及ph 和培养温度、光照条件;2．细菌培养性状观察1仿照上述真菌菌落形成步骤,观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中,菌落生长速度快慢,是否有特殊气味形成等;同时要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;2用接种铒环蘸细菌菌种后,通过无菌操作在肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线,过2～3d后长出的细菌群体称为菌苔,可仿照观察记载细菌菌落的记载内容,记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中,是否有特殊气味生成,生长速度快慢等;也要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;3用接种铒环蘸取细菌菌种后,通过无菌操作,将其接种在某种液体培养基中,数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成,培养液表面是否可生成菌膜等;也要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;五、所需时间流程1．病原真菌分离组织分离：切取病组织,表面消毒,无菌水洗移人平板：1h;稀释分离：配孢子悬液,倒平板il培养7--10d分离菌移人斜面30min培养7--10d检查斜面上分离菌产孢30min 保存菌种2．病原细菌分离划线分离：倒平板沾菌悬液划线,1h;稀释分离3．病原真菌、细菌菌落培养性状观察平板上形成单菌落1--3d观察迦些写报告4．病原细菌菌苔培养性状观察斜面上形成菌苔i-3d观察30min写报告5．病原细菌液体培养性状观察接菌于液体培养基30min培养2--3d观察30min写报告六、实验作业l.上交分离的病原真菌、细菌菌种;2．写出病原真菌、细菌培养性状观察的实验报告;七、思考题1．如果要分离的病原真菌是鞭毛菌中的腐霉菌、疫霉菌等应当如何进行才会获得更好的效果2．在分离病原真菌时,向平板培养基中加人乳酸为什么会大大减少细菌的污染3．如果要从土壤中分离某种病原菌,应当采取什么样的分离方法会更有效4．观察记载真菌及细菌的培养性状有何意义5．怎样才能知道你获得的病原真菌、细菌的菌种是否是纯培养附1 常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离;从病斑部分切取每边3—5mm的小块组织,在70％酒精中浸数秒钟后,移人0．1％的升汞水溶液中处理3—5rain,以灭菌水冲洗3次,移置培养皿的培养基中,然后培养;2．维管束组织内病原菌的分离;从根茎维管束组织分离病菌,可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒,将表皮组织用灭菌的解剖刀削去,然后切取其中小块变色的维管束组织,用升汞或漂白粉液消毒后,用灭菌水冲洗几次,移置培养基面上;3．根腐病病原菌的分离;根腐或基腐病的分离,由材料的大小决定;材料小的可仿照斑点病的分离法,材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法;4．肉质组织中病原菌的分离;多肉的根、茎及果实等,可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织,切取小块病组织分离;如有杂菌感染可采用“直接接种”法,待出现症状后,用此法再行分离;5．种子内病原菌分离;将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒升汞或漂白粉,用灭菌水洗涤后,移置培养基上;6．孢子分离法;能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等,则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之;7．土壤带菌分离法;为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形,从有病的土壤中分离它们是必要的;分离方法是将土壤取出少许,配制成悬浮液,然后用稀释法或划线法分离;。
真菌实验报告
一、实验目的1. 观察和描述真菌的形态特征。
2. 学习真菌的培养和分离方法。
3. 了解真菌在自然界中的作用及其与人类生活的关系。
二、实验材料与试剂1. 实验材料：土壤、水果（如苹果、香蕉）、面包等富含真菌的食物。
2. 试剂：无菌水、无菌棉签、无菌培养皿、牛肉膏蛋白胨培养基、乳酸酚棉蓝染色液等。
三、实验方法1. 真菌的采集与分离（1）采集土壤样品，用无菌水将土壤样品稀释至一定浓度。
（2）用无菌棉签蘸取稀释后的土壤样品，均匀涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上。
（3）将培养皿倒置，放入恒温箱中培养。
（4）观察菌落生长情况，挑取典型菌落进行纯化。
2. 真菌的形态观察（1）将纯化后的真菌菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，培养至适宜时期。
（2）用无菌水轻轻洗去菌落表面的培养基，制成临时玻片。
（3）用乳酸酚棉蓝染色液染色，镜检观察真菌的形态。
3. 真菌的培养与繁殖（1）将分离得到的真菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，培养至菌落丰满。
（2）用无菌水稀释菌液，制成一定浓度的孢子悬液。
（3）将孢子悬液接种于新的牛肉膏蛋白胨培养基上，观察菌落生长情况。
四、实验结果1. 真菌的形态特征观察到的真菌菌落呈现出不同的形态，如绒毛状、蜘蛛网状、絮状等，有的菌落呈现出红色、褐色、绿色等不同的颜色。
2. 真菌的培养与繁殖在牛肉膏蛋白胨培养基上，真菌菌落生长迅速，繁殖能力强。
通过稀释孢子悬液，可以观察到真菌的繁殖过程。
五、讨论与分析1. 真菌在自然界中广泛分布，与人类生活密切相关。
本次实验观察到的真菌菌落形态各异，体现了真菌的多样性。
2. 通过培养真菌，可以了解真菌的生长条件和繁殖方式。
真菌的繁殖能力强，可以通过孢子进行繁殖，这也是真菌在自然界中广泛分布的原因之一。
3. 真菌在食品、医药、生物工程等领域具有广泛的应用价值。
例如，真菌可以用于生产抗生素、酶等生物制品。
六、实验总结本次实验成功观察到了真菌的形态特征，并学习了真菌的培养和分离方法。
通过实验，我们对真菌有了更深入的了解，认识到真菌在自然界和人类生活中的重要作用。
真菌培养的使用教程及注意事项
真菌培养的使用教程及注意事项随着人们对真菌的研究和利用逐渐增多，培养真菌也成为了科研和应用的一项重要工作。
本文将向大家介绍真菌培养的使用教程及注意事项，希望能对有兴趣进行真菌培养的读者有所帮助。
一、实验前的准备工作在开始真菌培养之前，我们首先需要准备一些实验用具和培养基。
实验用具包括培养皿、移液管和镊子等，培养基可以根据不同的真菌种类选择合适的配方。
在准备实验用具和培养基的过程中，需要保持实验室环境的清洁，并确保所有的工具和材料都经过灭菌处理，以避免外部细菌和真菌的污染。
二、真菌的分离和培养1. 分离：选择一个要分离的真菌样本，例如从土壤或腐败植物中采集。
取一小部分样本放入培养皿中，加入适当的培养基，覆盖好培养皿盖，然后放入恒温培养箱中进行培养。
待真菌菌丝生长到一定程度后，可以用镊子将菌丝分离出来，然后传至新的培养环境中。
2. 培养：将分离得到的真菌菌丝移至新的培养皿中，加入适当的培养基，并进行适当的调整，使菌丝能够继续生长和繁殖。
同时，为了提供足够的氧气和水分，培养皿的盖子上应该开孔，并保持一定的湿度。
三、真菌培养的注意事项1. 温度控制：不同种类的真菌对温度要求不同，一般来说，适宜的温度范围为20-30摄氏度。
因此，在进行真菌培养时，应根据不同的真菌种类选择合适的温度条件，并使用恒温箱来保持稳定的温度。
2. 光照控制：有些真菌对光照的需求较高，例如光合菌，而其他一些真菌则对光照较为敏感。
因此，在进行真菌培养时，应根据不同菌种的需求，合理控制光照条件。
如果需要暗培养，可以将培养皿放在黑暗的培养箱中。
3. pH值控制：真菌对pH值也有一定的要求，一般偏酸性或中性环境更适合真菌的生长。
因此，在进行真菌培养时，应根据不同的真菌种类选择合适的培养基配方，并在培养过程中定期检测和调整pH值。
4. 湿度控制：真菌的生长需要适宜的湿度，过高或过低的湿度都会对其生长产生不利影响。
因此，在进行真菌培养时，应尽量保持培养皿内的湿度稳定，并及时补充水分。
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一、（越南进境人参果炭疽病病原菌的分离鉴定2009年第3期植物检疫胡佳王卫芳¨）1.病原菌分离采用组织分离法，取病果病健交界果皮组织分离培养(马铃薯葡萄糖琼脂培养基[ PDA]，25℃，1 2 h荧光与1 2 h黑暗循环交替)，病菌纯化后保存备用。
2、病原菌培养特征和形态观测取病果病部组织进行徒手切片，显微观察分生孢子盘和分生孢子的形态特征；观察病菌的培养特性( P D A，2 5 o C，1 2 h荧l 2 h黑暗循环交替)；观测分离物分生孢子的形态和大小；从培养7 d的菌落中挑取分生孢子团，配制成孢子悬浮液，采用载片悬滴法，观测附着孢的形态及大小。
3、病原菌1 8 S r D N A序列扩增与测定将纯化菌株置于P D A、2 5 o C、1 2 h荧~／1 2 h 黑暗循环交替条件下培养5 d ，挑取菌落边缘新鲜菌丝，采用常规C T A B法提取病原菌基因组D N A作扩增模板，进行P C R扩增。
所用引物为真菌1 8 S r D N A通用引物G e o A 2和G e o l 1 【9 J 。
反应体系为2 5 总体积，d d H 2 O 1 6 ．3 7 5，1 0倍P C R缓冲液( 含Mg C 1 2 ) 2 ．5 I x L，d N T P( 2 ．5 mm o l ／L) 2 L ，G e M1 ( 1 0 I ~ mo l ／L ) 1 L ，G e o A 2 ( 1 0 l x m o L ／L ) 1 LT a q ( 5 u ／l x L ) 0 ．1 2 5 L，模板 D N A 2 L 。
反应程序为9 4 ℃预变性2 m i n ，9 4 o C 4 5 s ，5 5 o C 4 5 s ，7 2 o C2 mi n ，3 0个循环，7 2 ~ C延伸1 0 mi n ，4 ℃保存。
P C R产物送上海英骏生物有限公司纯化测序。
测序结果与G e n B a n k数据库中的已知序列进行B L A S T比较。
4、致病性测定选取健康柑橘( C i t r u s r e t i c u l a t a) 、苹果( Ma l u s p u mi l a ) 果实，经7 0 ％酒精表面消毒后晾干备用。
从在P D A、2 5 o C、 1 2 h荧光／1 2 h黑暗循环交替条件下培养7 d的菌落上挑取分生孢子团，用无菌水配成分生孢子悬浮液( 1 0 0倍镜下5 0—6 0个孢子) 。
用灭菌针刺伤果皮，用无菌滤纸片沾取孢子悬浮液覆盖在针刺部位接种，以无菌水作对照。
用保鲜膜分别包裹接种果和对照果，封口，放置经7 0 ％酒精消毒过的塑料箱中，于2 5 o C、1 2 h荧光／1 2 h黑暗条件下保湿培养，定期观察症状发展过程。
发病的果实按照2的方法重新分离病原菌，做K o h n法则确认是否同种致病菌。
二、（苹果炭疽菌低毒性菌株的筛选及控病效果的研究）炭疽菌培养参照方中达等的方法在含有PDA培养基的试管斜面上接种炭疽菌，7d后用10mL 无菌水冲洗抱子再倒入25OmL内有玻璃珠、灭菌的三角烧瓶中(约1又1了个抱子/mL)，置摇床上20min，使抱子团充分分散，涂平板12个待用。
涂平板仍参照方中达的方法苹果炭疽病菌在pH3~10范围的PDA培养基上均能生长和产抱，最适菌丝生长的PH值为4，分生抱子产生的最适pH值为4~5，三、（东北农业大学农学硕士学位论文南瓜疫病菌(尸彻toPhthor。
aP:iciLeon.)毒素致病机理及抗源筛选研究）生物测定法包括幼苗浸渍法、离体叶片浸渍法、叶片针刺、涂抹和喷雾测定、植物愈伤组织测定法、离体根冠细胞测定法、线粒体测定法、叶绿体测定法、细胞膜测定法等。
酶水平的生物测定有ATP酶法、PAL酶法、核糖核酸和脱氧核糖核酸酶法、SOD酶法、POD 酶法、MOD酶法。
代谢水平的生物测定有种苗偶联能量的测定、苯丙烷类代谢途径的测定、离子吸收测定和C02暗固定测定法等。
与抗性有关的重要的酶类有细胞壁水解酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等，植保素为一些酚类和黄酮类化合物。
2.2.1液体培养基制备Plich’S培养液:I000ml培养液中含KH2PO4 5g，MgSO4;·7H2O 2.0g，天门冬酰胺1.0g，VB1 0.1g，酵母浸膏5g，蔗糖25g;灭菌前PH调至6.5。
胡萝卜汁培养液:用200g胡萝卜切碎后，煮沸30分钟，经2层纱布过滤后用蒸馏水定容至100Oml)。
灭菌前州调至6.5。
2:2粗毒素的提取2.2.2.1产毒培养菌株移接于CA平板上，于24℃条件下培养7d后，沿菌落边缘打出直径为smm菌块，接入分别装100mlphch’s培养液及胡萝卜汁培养液的250m!的三角瓶中，每瓶接5块，置于25℃条件下振荡培养巧d，培养液经定性滤纸过滤，滤液经细菌滤膜真空抽滤得无菌培养液。
2.2.2.2粗毒素的提取在无菌培养液中加入(NH4)SO4;置饱和度达85%(0oC)沉淀过夜，再经11000 r/min离心15min，沉淀溶于去离子水中，4℃下对去离子水透析24小时即可得到粗毒素一20℃下保存备用。
2.2.3培养基对P.C月pSl’cj产毒能力的影响2.2.3.1根长生长抑制法用在两种培养基培养得到的无菌滤液分别接种，接种方法是将感病品种(DX一l)的种子用清水漂洗汰除病、劣和杂粒，加水浸泡8小时后，倒掉水并用水冲洗几遍再放到25一26℃恒温条件下培养。
待主根长为Znun时，胚向下摆在事先已铺有用无菌滤液浸湿的纱布的白瓷盘内，每白瓷盘放50粒种子，再在种子上面覆盖一层用滤液浸湿的滤纸，于温度为26℃的温箱中培养48小时后测量主根长并计算根生长抑制率。
每个处理3次重复，并设置无菌水、空白培养液作对照。
生长抑制率(%)二对照处理根长X1002.2.3.2幼苗浸渍法用两种培养基提取的无菌滤液分别处理幼苗，鉴别无菌滤液的活性。
接种时期为第一片真叶完全展开，第二片真叶1/2展开的幼苗，经无菌水处理后，移入分别盛有两种无菌滤液的三角瓶中，设p。
caPsl’ci无菌水、空白培养液做对照，24一26℃刻牛下，光照处理下，每个处理5次重复，两天后观察其发病症状。
四、（辣椒疫霉菌产毒培养方式和提取方法的研究李海燕。
赵伟全第16卷第1期黑龙江八一农垦大学学报16（1）：10～13 2004年3月）采用Plich’s培养液在振荡培养的方式下，辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）产毒量最高。
大量快速提出Phytophthora capsici毒素的最佳方法为硫酸铵沉淀法1.2试培养基Plich’s培养液：KH2PO 4 0.5 g，MgSO4·7 H2O 2.0 g，天门冬酰胺1.0 g，酵母浸膏5.0g，VB1 0.01 g，蔗糖25 g，蒸馏水1 000 mL。
胡萝卜汁培养液：称取胡萝卜200 g，去皮切成小块放入组织捣碎机内捣碎裂分钟，三层纱布过滤，滤液加蒸馏水定容至1 000 mL。
辣椒叶煎汁培养液：取新鲜辣椒叶200g，加水煮沸30min，过滤，滤液加蒸馏水定容至1000mL。
1.3产毒培养条件采用胡萝卜（CA）固体培养基上，培养5d的辣椒疫霉菌，沿菌落边缘打出直径为8mm的菌块，接入装有150 mL培养液的250 mL三角瓶中，每瓶8块，每种培养液接种10瓶，5瓶于25℃下静止培养，另外5瓶置于25℃恒温振荡培养箱（HZQ－X100型）中振荡培养（120 r/min）15 d。
取出培养液经三层定性滤纸抽滤，再经微孔滤膜（0.45μm）真空抽滤，得无菌培养滤液，调pH值至6.5，置4℃冰箱中待用。
1.4毒素提取方法的选择取上述Plich's无菌培养滤液（每份100 mL），按以下五种方法进行提取。
1.4.1直接透析浓缩法：将100 mL无菌培养滤液装入透析袋（MW 8 000～10 000，预先经10 mmol/L NaHCO3～1 mmol/L EDTA溶液煮沸30 min，用双蒸水充分洗涤）中，直接放入经4℃预冷的20%聚乙二醇（PEGs,MW 20000）溶液中浓缩（于4℃冰箱中）。
1.4.2硫酸铵沉淀法：将盛有100 mL无菌培养滤液的烧杯放在一装有冰水混合液的大烧杯内，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，边搅拌边徐徐加入硫酸铵固体（每100 mL培养滤液加硫酸铵55.9 g）至85%饱合度，继续搅拌10 min,使溶液充分混合，4℃过夜。
1.4.3丙酮沉淀法：将丙酮提前预冷至-20℃，将样品滤液置冰浴中用磁力搅拌器缓慢搅拌，边搅拌边缓缓加入预冷丙酮（每100 mL样品加丙酮100 mL），加完后继续搅拌10～15 min，使溶液充分混合，4℃过夜。
1.4.4乙醇沉淀法：方法同丙酮法，只须将丙酮换为无水乙醇即可。
1.4.5聚乙二醇沉淀法：在冰浴条件下向100 mL无菌毒素培养滤液中加入预冷至4℃的50%聚乙二醇溶液（每100 mL滤液加50%PEG 150 mL），边加边用磁力搅拌器缓慢搅拌，持续搅拌40 min,使溶液充分混合，4℃过夜。
将各处理样品用himac CR21高速低温离心机离心15 min（4℃，10 000×g）,弃去上清液，将沉淀用少量无菌双蒸水复溶，再离心除去变性蛋白。
将各蛋白样品分别装入透析袋中，于4℃下无菌双蒸水透析24 h，其间每隔6 h透析液一次。
最后将各提取样分别定容至3 mL，分装于1.5 mLEppendorf管中，-20℃保存。
1.5毒素浓度的测定采用Bradford法，即考马斯亮蓝G-250染色法。
1.6毒素生物活性的检测参照谢丙炎（1997）的叶片注射毒性检测法。
取在人工气候培养箱中生长至6叶期茄门甜椒幼苗的第3、第4片叶，待测样品经透析去盐后，用无菌的一次性注射器在叶背面沿叶脉注入25μL样品，分别以蒸馏水、未接菌的培养液为对照，每处理注射10片叶，24 h后测定叶片坏死的严重程度，以叶片的病情指数作为毒素的相对活性。
病情指数＝（各叶片坏死严重率之和／调查总叶片数）×100%五、胶孢炭疽菌菟丝子专化型毒素的初步研究刘慧,袁世斌第20卷第3期2002年9月四川农业大学学报胶孢炭疽菌菟丝子专化型可产生有致病力的外毒素,毒素引起菟丝子产生类似于接种分生孢子所引起的症状。
菟丝子蔗糖培养液、改良的Czapek-Dox培养液和摇瓶液体发酵培养基均可产毒。
毒素经100℃水浴30 min后仍保持较高的致病率,而5 mol/L盐酸水解处理4 h后致病率明显下降。
初提纯毒素液的pH值对毒素影响较小。
毒素易溶于水,难溶于多种有机溶剂,透析实验结果表明毒素为大分子物质,推测毒素的主要成分是蛋白聚糖类物质1.2培养条件菌种接种于PDA培养基平板中央,在28℃恒温培养箱中培养7 d后,在菌落边缘取直径为10 mm的菌块接入盛有30 mL培养液的250 mL三角瓶,置28℃旋转摇床振荡培养10 d。