动物内生真菌的分离
蛇足石杉内生真菌的分离纯化与鉴定研究
蛇足石杉内生真菌的分离纯化与鉴定研究俞 超,罗胡科,齐 娜,胡 彦,王忠华(浙江万里学院生物技术研究所,浙江宁波315100) 摘要:从药用植物蛇足石杉中分离内生真菌,并对其进行初步鉴定。
先在M S 培养基上对蛇足石杉的茎、叶和孢子进行离体组织培养;然后在P DA 平板培养基上,分别对茎、叶和孢子离体培养中产生的内生真菌进行分离;最后对照真菌鉴定手册,根据菌株的菌落形态、大小、颜色、生长速率、质地、生长培养基颜色变化,以及菌丝体和孢子的形态特征进行鉴定。
结果从蛇足石杉的茎中分离出4株内生真菌菌株,分别属于顶孢霉属、头孢霉属、酵母属和束梗孢霉属;从叶中分离出2株内生真菌菌株,分别属于头孢霉属和青霉属。
关键词:蛇足石杉;内生真菌;分离;纯化;鉴定 中图分类号:S567.1+90.353 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2009)03-0381-04收稿日期:2008-12-22基金项目:浙江省创新创业计划;浙江省宁波市农业攻关项目(编号:2006C100068)。
作者简介:俞 超(1979—),男,浙江奉化人,实验师,主要从事药用植物生物技术研究。
通讯作者:王忠华。
E -mail:wang1972@z wu .edu .cn 。
蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb .)Trev .],又名千层塔,为石杉科石杉属蕨类植物[1]。
民间用其全草治疗跌打损伤、毒蛇咬伤、淤血肿痛和精神分裂等疾病。
蛇足石杉主要分布于我国中亚热带和南亚热带所在的地理区域,性喜阴湿,适应于中亚热带常绿阔叶林和南亚热带季风常绿阔叶林的气候条件中生长。
现代医学研究表明,蛇足石杉所含有的石杉碱甲具有高选择性的抑制乙酰胆碱酯酶活性,对提高学习记忆力和改善老年人记忆功能及治疗重症肌无力和早期老年痴呆有显著疗效[2-3]。
由于石杉碱甲在全草中含量甚微,结构复杂,人工合成十分困难,目前药品生产完全依赖野生资源,价格昂贵。
银杏内生真菌的分离纯化及抑菌性的鉴定
银杏内生真菌的分离纯化及抑菌性的鉴定裴冬丽;张红岩;韩汝豪;李成伟【摘要】采用组织分离法从银杏(Ginkgo biloba)健康组织中分离得到25株内生真菌,根据菌株在PDA培养基上的培养特征,5株被鉴定为链孢霉菌属、4株为酵母属、4株为曲霉属,3株为毛霉属、3株为青霉属,2株为根霉属,1株为简梗孢霉属,3株分离菌株不产孢子.测定25株内生真菌对3种受试指示菌的抑制作用,共筛选得到11株至少对一种指示菌的生长有抑制作用的菌株,对抑菌活性较强的菌株进行形态学和显微分析鉴定.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】4页(P2116-2119)【关键词】分离;鉴定;银杏(Ginkgo biloba);内生真菌;抑菌性【作者】裴冬丽;张红岩;韩汝豪;李成伟【作者单位】商丘师范学院生命科学学院/植物与微生物互作河南省高校重点实验室,河南商丘476000;商丘师范学院体育学院,河南商丘476000;商丘师范学院生命科学学院/植物与微生物互作河南省高校重点实验室,河南商丘476000;商丘师范学院体育学院,河南商丘476000;周口师范学院生命科学学院/植物遗传与分子育种重点实验室,河南周口 466001;商丘师范学院生命科学学院/植物与微生物互作河南省高校重点实验室,河南商丘476000;商丘师范学院体育学院,河南商丘476000;【正文语种】中文【中图分类】S664.3自第一株内生真菌1898年从黑麦草种子中分离出来以后，植物内生真菌才被广泛地关注。
内生菌最早是指在植物组织内生长的微生物，用来区分那些在植物表面上生长的表生菌。
现内生真菌定义为在其生活史的一定阶段或全部阶段，在健康植物组织和器官内部中生长的，且不会使其被感染的宿主（至少是暂时）表现出外在病症的一类真菌。
内生真菌多样性丰富，生物活性强，生长在植物体内的内生真菌可以和相对应的宿主相互协同、共同进化，并且还可以生成与宿主相同或相似的具有生物活性的代谢产物［1］，它们不仅能促进宿主植物快速生长，而且还可有效地增强宿主对生物胁迫和非生物胁迫的抗逆能力。
木蝴蝶内生真菌分离鉴定及促生功能初步研究
引文格式：许娟娟, 房佳茹, 周士家, 等. 木蝴蝶内生真菌分离鉴定及促生功能初步研究[J]. 云南农业大学学报(自然科学),2023, 38(5): 878−885. DOI: 10.12101/j.issn.1004-390X(n).202206072木蝴蝶内生真菌分离鉴定及促生功能初步研究*许娟娟1， 房佳茹1， 周士家1， 李 伟2，孙正海1 **(1. 西南林业大学 园林园艺学院，云南省面向南亚东南亚经济林全产业链联合研发中心，云南省观赏草集成利用国际联合研发中心，云南省高效经济林培育示范型国际科技合作基地，云南 昆明 650224；2. 云南吉成园林科技股份有限公司，云南 弥勒 652339)摘要: 【目的】解析木蝴蝶[Oroxylum indicum (L.) Vent.]内生真菌的种类及其促生功能。
【方法】以木蝴蝶树皮、种子、果皮和叶片为材料分离鉴定内生真菌，依据生理指标对分离的内生真菌促生活性进行分析；选取部分代表性内生真菌转接到黄豆植株进行培养，以黄豆产量指标验证其实际促生效果。
【结果】从木蝴蝶树皮、种子、果皮和叶片中分离得到50株内生真菌，隶属于13属23种，其中果皮部位分离菌株最多，炭疽属(Colletotrichum )为优势菌属；9株代表性真菌均具有产吲哚乙酸和固氮的能力，其中6株真菌还具有溶磷和解钾特性。
转接栽培试验结果表明：9株菌处理后黄豆果荚数增加5%~75%，产量提高37%~231%；其中壳青霉(Penicillium crustosum )促生效果最好。
【结论】本研究首次开展了木蝴蝶内生真菌的分离研究，并对其功能进行了验证，其中壳青霉促生效果最好，转接黄豆后可提高其果荚数和产量，具有开发为微生物菌肥的潜力。
关键词: 木蝴蝶；内生真菌；纯培养分离；促生功能中图分类号: S718.81 文献标志码: A 文章编号: 1004–390X (2023) 05−0878−08Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Oroxylumindicum (L.) Vent. and Preliminary Study onIts Growth Promoting FunctionXU Juanjuan 1，FANG Jiaru 1，ZHOU Shijia 1，LI Wei 2，SUN Zhenghai 1(1. College of Landscape and Horticulture of Southwest Forestry University, Yunnan Province Joint R & D Center for the Whole Industry Chain of Economic Forests in South Asia and Southeast Asia, Yunnan Ornamental Grass Integ-rated Utilization International Joint R & D Center, International Science and Technology Cooperation Base of HighEffective Economic Forestry Cultivation Demonstration of Yunnan Province, Kunming 650224, China;2. Yunnan Jicheng Landscape Technology Co., Ltd., Mile 652339, China)Abstract: ［Purpose ］To analyze the species and growth promoting functions of endophytic fungi in Oroxylum indicum (L.) Vent. ［Methods ］Endophytic fungi were isolated from the bark, seeds,pericarps and leaves of O. indicum , and the growth promoting activity of the isolated endophytic fungi was analyzed according to physiological indexes. Some representative endophytic fungi were selec-云南农业大学学报（自然科学），2023，38(5)：878−885Journal of Yunnan Agricultural University (Natural Science)E-mail: ********************收稿日期：2022-06-29 修回日期：2023-08-20 网络首发日期：2023-10-09*基金项目：云南省重点研发计划 (2019IB011)。
泽漆内生真菌的分离(一)
组织块培养法（针对根和茎）：表面消毒后的根和 茎，剪成小的组织块，无菌转接到制备好的分离培 养基，各接种三个培养基，28度培养
匀浆涂布法（叶子）：表面消毒后的叶子加２ｍｌ 的无菌水，无菌条件研磨后，取200ul的匀浆转接到 制备好的分离培养基，28度培养
观察纯化
表面消毒效果检查
漂洗液检查法：将用漂洗植物样品的最后一次的漂 洗液，无菌条件，吸走200ul涂布于制备好的固体平 板，观察培养是否有真菌生长，
培养基的制备
SDA培养基：葡萄糖，培养基：马铃薯，葡萄糖，琼脂，酵母膏，蒸 馏水
内生真菌的分离（SDA）
泽漆内生真菌的分离
别
称：五朵云、猫眼草、五凤草
大戟目 大戟科 大戟属
表面处理
预处理：用自来水冲洗掉样品的表面残留的泥土， 减掉质量差的组织， 表面消毒步骤：无菌条件，75%乙醇消毒两分钟，接 着用无菌水漂洗两到三次，然后用2%NaClO溶液消 毒两分钟，75%乙醇浸泡1分钟（去掉样品表面残留 的NaClO溶液），最后用无菌水漂洗两到三次，无 菌滤纸吸走多余水分，阴干备用
华山松叶栖内生真菌的分离鉴定及筛选
华山松叶栖内生真菌的分离鉴定及筛选张雪;刘应高;张翅;黄晓丽;骆军;徐明庆【期刊名称】《中国森林病虫》【年(卷),期】2009(28)1【摘要】用常规内生真菌分离方法从健康华山松Pinus armandii Franch.针叶上分离到17种内生真菌,其中子囊菌1种、酵母菌1种、半知菌l5种.通过对峙培养初步筛选出抗真菌活性的内生真菌优势种:绿木霉Trichoderma viride Pers.:Fr.、拟康宁木霉T. pseudokoningii Rifai,并对这2种木霉培养滤液的抑菌作用进行初步研究.结果表明,这2种木霉培养滤液对来自于针叶的拟盘多毛孢Pestalotiopsis Stey.和针叶树散斑壳Lophodermium conigenum(Brunaud)Hilitz菌落生长只有较弱抑制作用,对来自于枝干的拟茎点霉Phomopsis(Sacc.)Bubak有很强的抑制作用,对拟盘多毛孢孢子萌发有不同程度抑制作用.【总页数】4页(P1-3,6)【作者】张雪;刘应高;张翅;黄晓丽;骆军;徐明庆【作者单位】四川农业大学林学园艺学院,四川,雅安,625014;四川农业大学林学园艺学院,四川,雅安,625014;四川农业大学林学园艺学院,四川,雅安,625014;四川农业大学林学园艺学院,四川,雅安,625014;四川农业大学林学园艺学院,四川,雅安,625014;四川农业大学林学园艺学院,四川,雅安,625014【正文语种】中文【中图分类】S763.15【相关文献】1.雷公藤属内生真菌研究(Ⅱ)昆明山海棠内生真菌的分离鉴定及抗肿瘤活性菌株筛选 [J], 王家明;张喜庆;田晓敏;王彩骄;杜万富;孙华;王永禄;李敬华2.广西柳树桑寄生内生真菌的分离鉴定与抗肿瘤活性菌株筛选 [J], 龚斌;巫鑫;韦婷;廖日权;苏本伟;宋静静;江国焕;朱开昕3.海南广藿香内生真菌分离鉴定及拮抗菌株筛选 [J], 易天凤;吴友根;于靖;张军锋;杨东梅4.肿节风内生真菌的分离鉴定及拮抗真菌筛选 [J], 宋利沙;蒋妮;蓝祖栽;张占江5.盐角草内生真菌分离鉴定及抑制水产腐败细菌菌株的筛选 [J], 张艳秋;方怀义;曹宏明;龚斌;邓宗剑;陈美花;宋静静;张虹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一株飞龙斩血内生真菌的分离鉴定及其活性研究
菌２ ４种病原微生物有 不 同程 度 的抑 制作 用。形 态特征 表 明， 该菌株 与木 霉属 Ｔｉ ｏｅ ａ中的康 氏木 霉 疗 ｒ ｈｄｒ ｃ ｍ —
ｃｏｅ ａｋｎｎ ｉ ｓ ｈｄｒ ｏ ｉ ｏ ｉ ｍ ｇ ｐ ｓ的特 征 基 本 一 致 。ＩＳ序 列分 析 显 示 ， 菌株 与康 氏木 霉 Ｔｉ ｏｅ ａｋｎｎ ｉ ｓ Ｔ 本 ｒｈｄｒ ｏｉ ｏ ｉ ｃ ｍ ｇ ｐ ｓ同源性 高达
自 １９ ８ ８年 Ｖ ｇ 从 黑麦草 （ｏｉｍ ｔ ｕｅｔｍ Ｉ ） ｏｌ Ｌｌ ｍ ｌ ｕ ． 种子 内分 离到第一 株 内生 真菌 ， ２ 纪 ３ ｕ ｅ ｎ 到 ０世 ０年代
杨本寿 韩秀林 ，
（． １ 曲靖 医学 高等专 科学校 微生 物研究 所 ， 云南 曲靖 ２ ．云南 大学 云南 省微生物 研究所 ， 云南 昆明 ６５０ ； ５００
６０９ ） ５０ １
摘
要 ： 飞龙 斩 血 内分 离得 到 一株 广谱 、 从 高活 性抑 菌 内 生真 菌 Ｆ一 ６ ２ 其 对 细 菌 、 物 病 原真 菌和 皮肤 致 病 真 ４／ ， 植
Ｔｏ ｄ ｌ ｓａｆ ｄ ａ ｉ ａ ｉ 口 Ｌ． ａ
Ｙ Ｎ ｅ— ｏ Ａ ｉ ｌ （ ．ｎｔｕ ｆ Ｍｉｏｉｏｙ ｕｎ ｄ ａ Ｃｌｇ ，Ｑｊ ｇ Ｙｎａ Ａ Ｇ Ｂ ｎｓ ｕ ，Ｈ Ｎ Ｘｕ ｉ １Ｉ ｉ ｔ ｏ ｃ ｂ ｌ ，Ｑｊ ｇ Ｍｅｉ ｌ ｏ ｅｅ ｕ ｎ ｕｎ ｎ ｈ —ｎ ｓｔ ｅ ｒ ｏｇ ｉ ｃ ｌ ｉ ６ ５０ ， ｈｎ ；． ｕ ｎ ｎＩ ｔｕｅｆＭｉｏｉｏｙ ｕ ｎ ｎＵ ｉ ｒｔ， ｕ ｍｎ ｕ ｎｎ６ ０９ ， ｈ ａ ５０ ０ Ｃ ｉ ２ Ｙｎａ ｉ ｔ ｏ ｃ ｂ ｌ ，Ｙｎａ ｎ ｅ ｉ Ｋ ｎ ｉ Ｙ ｎａ ５ ０ Ｃ ｉ ） ａ ｓ ｎ ｔ ｒ ｏｇ ｖ ｓｙ ｇ １ ｎ
内生真菌JSM 10的分离及鉴定
１ ２ ７Ｉ Ｓ序列 系统 发 育分 析 真 菌 Ｉ ． ． Ｔ ＴＳ基 因序 列 ， 用 Ｎａｉｎ ｌ ｅ ｔｒｆｒＢｏ ｅｈ ｏｏ ｙＩｆｒ ｔ ｎ 先 ｔ ａ Ｃ ｎｅ ｏ ｉｔｃ ｎ ｌｇ ｎｏｍａｉ ｏ ｏ 网站 （ Ｃ Ｉ ｔｐ ／ ｗｗｗ． ｃ ｉｎｍ． ｉ． ｏ ／ 提 供 的 Ｂ ａｔＢ ｓ ｏ ａ Ａｌ ｎ ｎ ｅ ｒｈＴｏ １搜 索程 Ｎ Ｂ ；ｈｔ ：／ ｎ ｂ． ｌ ｎｈ ｇ ｖ ） ｌｓ（ ａｉ Ｌ ｃｌ ｉ ｍｅ ｔ ａｃ ｏ） ｃ ｇ Ｓ 序 在 Ｇｅ Ｂ ｎ ／ ＭＢ ／ ＤＢ 等公 共 数据 库 中在线 搜索 高度 相似 序列 ， ｎ ａｋＥ Ｌ Ｄ Ｊ 调取 同源性 高 的相关 序列 组成 序列 集 ． 后用 Ｃ ＵＳ 然 Ｌ ＴＡＬ Ｘ １ 软 件包 中的 Ａｌ ｎ ｎ 程 序进 行多 重序 列 比对 ． Ｔ ｅｓ ｌ。 。 ｉ ｍｅ ｔ ｇ 用 ｒｅ 程序 计算 序列 间的相 似 性 （ｅ ｕ ｎ ｅｓｍｉ ｒ ｙ ， Ｂ ｏ ｄｔ 件进 行序 列 剪辑 ． 统进 化 距 离矩 阵根 据 Ｋｉ ｒ 模 型估 算口 ｓｑ ｅ ｃ ｉ ｌ ｉ ） 用 ｉＥ ｉ软 ａｔ 系 ｍｕ ａ ． ＭＥ ＧＡ ． （ ｌｃ ｌｒ ｖ ｌｔ ｎ ｒ ｎ ｔ ｓ ａｙ ｉ 软 件包 采用 邻接 法 （ ｉｈ ｏ－ｏｎｎ ） 行 聚类分 ４ ０ Ｍｏｅｕａ ｏｕｉ ａｙＧｅ ｅｉ ｌｓｓ Ｅ ｏ ｃ Ａｎ ） Ｎｅｇ ｂ ｒ ｉｉｇ 进 Ｊ 析 和构 建系统 进 化树 ． 复取 样 １ ０ 重 ０ ０次进行 自展 值 （ ｏ ｔｔａ ａｕ ） 析 以评估 系统进 化 树 的拓 扑结 ｂ ｏｓｒｐｖ ｌｅ 分
２ １ 年 ５月 ０１
文 章编 号 ：０ ７ ９ ５ ２ １ ） ３ ０ ８ ４ １ ０ —２ ８ （０ １ ０ —０ ７ —０
油菜内生真菌的分离鉴定及抑菌作用
（ ｕａｉｍ） １ Ｆ ｓｒ ｕ ， 株属于炭角菌 目（ ｙ ｒ ｌｓ 。从鉴定 出 的油菜 内生真 菌 中， Ｘ ｌ ｉ ｅ） ａａ 筛选 出 １ 有抑 菌活性 的生 防真 株
环 境 的变化 而变 化 ， 因此 ， 传统 的真菌 分类 时常会 引 １ 潜在 生 防 菌球 毛 壳 菌 （ ｈ ｅｏ ｕ ｇ ｏｏｕ 株 Ｃ ａｔｍｉｍ ｌｂ ｓｍ）
菌 的发 现 至今 已有 １ ０多 年 的历史 ［ ， 是 对其 开 等Ｌ通过 小亚基 ｒ ０ ３但 ］ ６ ］ ＤＮＡ（ Ｓ ｒ ＮＡ） Ｓ Ｕ Ｄ 全序 列 的分 子
将 株 展真 正 系统 的研究 始 于 ２ Ｏ世 纪 ８ Ｏ年 代 ， 在 已经 系统学分 析 ， １ 从 水稻 茎 秆 上分 离 的 酵母 菌 鉴 现
本研究将 传统 的形态 学鉴定 和现代 分子 生物学
微 特征对 菌 种 进 行 鉴 定 。然 而真 菌 的形 态 特征 复 鉴定方 法相结 合 ， 从 油菜 中分 离 出 的 ９株 内生真 对
杂， 且有少 数种类 形 态 特征 和 生理 生 化指 标 会 随着 菌进行 菌种 鉴定 ， 构建 系统发 育树 。同时 ， 并 对其 中
Ｂｅｓｎ ｔｎａｙ ｍａｏ ｎ ） 从对 内生真 菌种群 资源多样 性 的调查扩 展到与 宿主 定 为 大 和本 森 顿 酵母 （ ｎｉｇ ｏ ｉ ａ ｔａ ａ 。 ｈ ｍｂ ｒ 等 ７ ］ 种 ｏｌ ａｐ ｎ ｅｓ上 分 离 ｓ 植物共 生关 系 的研究 中 ， 同时 ， 内生真 菌 自身 功能 Ｃ ａ ｅｓ Ｌ 对 １ 从 Ｗｏ ｌ ｉ ｕ ｇ ｎ 对
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动物内生真菌的分离
背景介绍
动物体内存在着丰富的微生物群落，包括细菌、病毒和真菌等。
其中，真菌是一类具有很高多样性的微生物。
在过去的研究中，我
们发现了一些动物体内的内生真菌，它们存在于动物的肠道、皮肤、毛发等部位。
这些内生真菌与我们的身体健康密切相关，可能对宿
主的免疫、代谢和生理功能起着重要的调控作用。
因此，分离和研
究这些内生真菌对于揭示其在动物体内的功能和潜在应用具有重要
意义。
实验设计
样本采集
首先，我们需要选择合适的动物作为实验对象。
常见的实验动
物可以包括小鼠、大鼠、猪等。
在选择动物之前，我们需要考虑动
物对于我们研究的真菌的宿主潜力、繁殖能力和实验操作的可行性
等因素。
为了保证实验的准确性和可重复性，采集样本时需要严格按照操作流程进行。
在采集样本时，应选择动物体内的特定部位，如肠道、皮肤等，避免对外界环境的干扰。
样本处理
样本采集后，需要进行样本处理。
首先，将样本放入无菌离心管中，并加入适量的缓冲液，如PBS。
然后，使用无菌的刀具将样本切碎，以增加真菌与培养基的接触面积。
接下来，将样本搅拌均匀，并使用离心机离心，将真菌与细胞碎片分离。
真菌分离
样本处理后，我们需要将真菌分离出来。
可以使用不同的培养基来进行真菌的分离。
常用的培养基有马铃薯葡萄糖琼脂、大豆琼脂等。
将样品取一定量涂抹在培养基上，然后在恒温培养箱中进行孵育。
在培养过程中，需要进行定期观察，记录并观察真菌的生长情况。
可以根据真菌的形态、颜色、生长速度等特征来初步判断真菌的种类。
鉴定和保存
对于分离出来的真菌，我们可以进行鉴定和保存。
鉴定可以使用传统的形态学鉴定、生物化学鉴定和分子生物学鉴定等方法。
形态学鉴定包括观察真菌的菌丝、孢子和菌落等形态特征。
生物化学鉴定则通过检测真菌的代谢产物和生理特征来进行鉴定。
分子生物学鉴定可以通过扩增和测序真菌特定的基因或基因片段来确定真菌的种属。
对于已鉴定的真菌，我们可以将其保存在冷冻保存液中，并储存在低温冷冻箱中，以便后续研究的开展。
结论
动物内生真菌的分离是研究动物微生物群落以及真菌在宿主中的功能和应用的重要一步。
通过合理的实验设计和方法操作，可以
成功地分离出动物内生真菌，并对其进行鉴定和保存，为后续的研究提供了基础和便利。
通过深入研究动物内生真菌，我们可以更好地理解动物与微生物之间的相互关系，为动物健康和生态系统的稳定性提供科学的依据。