(整理)限制性内切核酸酶
限制性核酸内切酶(双语)
EcoK: AACN6GTGC EcoB: TGAN8TGCT
Palindromic(回文序列）
EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG
Cutting sites
At least 1000bp away
At or close to recog. seq
24-26 bp away
Type II Recognition sequence characteristics （识别序列特点）——
Restriction endonuclease (origination)
• One component of the bacterial restriction-modification system, a natural defense mechanism of bacteria to against the introduction of foreign DNA into the cell • Restriction endonuclease: recognize a short, symmetrical DNA sequence, and cut DNA backbone in each strand at a specific site within that sequence (kill foreign DNA) • Methylase: methylates C or A of the cellular DNA
blunt ends（平末端）
Enzyme and connection
Commo n enzyme
nomenclature（命名）
EcoRⅠ
属 种 株 序
Escherichia coli RY13株
限制性内切酶
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。
它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。
另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。
限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。
实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。
在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。
该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。
因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。
从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。
但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。
虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。
经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。
突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
限制性核酸内切酶与核酸内切酶、外切酶
限制性核酸内切酶百科名片其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA 再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。
核酸内切酶核酸内切酶（endonuclease）在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。
从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase、RNaseT1等仅分解RNA的酶。
如链孢霉（Neurospora）的核酸酶就是既分解DNA又分解RNA的酶。
一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如脾脏RNase、RNaseT1等或限制性内切酶那种能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。
[1]寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。
RNA聚合酶科技名词定义中文名称：RNA聚合酶英文名称：RNA polymerase定义1：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科）定义2：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科）定义3：以DNA或RNA为模板合成RNA的酶。
所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。
因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
限制性内切酶酶切及电泳
生物化学与分子生物学教研室
生物化学与分子生物学教研室一、实验目的
生物化学与分子生物学教研室二、实验原理
），并在这个顺序
GAATTC
CTTAAG
EcoRⅠ
NNNNNN5’
pTA2载体后获得的重组载体pTA2-p53进行酶切分析，外源p53基因
( p53基因是人体抑癌基因,失活对肿瘤形成起重要作用。
)
带电质点在电场中向与其相反的电极进行泳动的现象。
的磷酸根残基，在
：在电泳前向凝胶预加核酸染料，电泳过程中染料同DNA结合，电泳后在紫外光照射下，可观察到荧光，从
Eppendorf管封上封口膜于３７℃水浴（金属浴）中酶切(酶切时间需小于2小时，以免产生星号活性）。
DNAmarker；泳道2：
电泳检测示例
反应时间：一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，
一般要求在最后加酶，且。
限制性内切酶 (1)解析
定义和命名
DNA限制性内切酶： 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸 酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这 样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母 和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例 如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性 内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基 顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、 HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。
2.限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制 与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。 Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。Ⅱ 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近 切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 46bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或 简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。 Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似 的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ， 切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。 Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相 反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两 个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成， 分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。 在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的 一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme）， 如 N.Bst NBI 。
限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶（RestrictionNucleases,RNases）是一类重要的核酸分子分析工具，是由胞壁杆菌和放线菌等微生物中编码的特定核酸酶类别。
它可以特异性的切割DNA和RNA的特定序列，对研究DNA和RNA的结构和功能有着重要的作用。
限制性核酸内切酶的分子结构基本上是由多聚腺苷酸（polypeptide）和双聚腺苷酸（dipeptide）组成的。
此外，它们还包含辅酶（cofactor），例如Mg2+或Ca2+、K+等，并且需要这些辅酶才能激活其具有酶活性。
一个限制性核酸内切酶在一次反应中可以检测出多个DNA序列，而且能够辨识具有同系特征特异性碱基对，尽量减少大量的氧化废物产生。
与其他核酸分子分析工具不同的是，限制性核酸内切酶具有单端可切或双端可切的特性，可以选择性地切割DNA分子的特定序列，其切割后的片段可以进一步用于分子生物学技术，如DNA测序、PCR及DNA杂交等。
例如，细菌DNA内切酶BamHI以TGT^AAT为切割位点，能有效地将DNA分子切断，切割后可以得到二条内切片段，分别以TGT和AAT为3端，以及一条5末端非切片段；而HpaII以C^CGG为切割位点，切割后可以得到二条内切片段，分别以C和CGG为5端，以及一条3末端的非切片段。
此外，限制性核酸内切酶还可用于检测DNA片段的克隆和定位，以及调控基因表达，控制蛋白质翻译等用途，因此，它们在遗传学、分子生物学研究中起着重要的作用。
它们能够解析特定DNA序列，同时保留它们的原始特征，有助于研究者对其进行详细的调查。
在生物技术的应用中，使用限制性核酸内切酶可以改变DNA序列，实现重组DNA的目的，创造各种抗性等目的。
因此，限制性核酸内切酶的重要性不言而喻。
它们是研究 DNARNA 构和功能的重要工具，同时也是实现技术转化的重要基础。
它们可以用于检测DNA片段，改变序列，以及调控基因表达等多种用途，同时也可以做出有意义的蛋白质和重要生物体系。
限制性核酸内切酶的命名和类型3
② Dcm甲基化酶(DNA 引入甲基
CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上 修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自 身遗传物质和外来遗传物质的目的。
（3）限制与修饰系统相关的三个基因
① hsd R: 编码限制性内切酶 这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双 链DNA切断 ② hsd M: 编码限制性甲基化酶 这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化， 即起修饰 DNA的作用。 ③ hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达 作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。
3. 功能
自我保护作用
细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制
寄主的限制与修饰现象
phage λ (B) EOP=1
E.O.P 成斑率 efficiency of plating
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的
操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，
连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行 人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些 酶称之为“工具酶”。
第一节
限制性核酸内切酶
1、限制-修饰系统
2、限制性核酸内切酶的命名和类型
3、II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、影响限制性内切酶活性的因素
实际应用中，R常被省略。
Escherichia
Coli
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头 2个字母相同则其中一个可用种名的第一和
第三个字母。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第三章限制性内切核酸酶一、填空题1. 严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。
基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2.年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。
3.1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。
5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由——亚基所组成。
它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链；这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。
切割的方式有，产生末端的DNA片段或的DNA片段。
作用时需要——作辅助因子，但不需要和6.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：和7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶；根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。
8.EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是_______ 分子量是300kDa.在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性;γ亚基的作用则是，9.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、三两个字母取自，第四个字母则用表示。
11.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5’-GRCGYG-3’，，其中R，Y12.在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是和13.部分酶切可采取的措施有：(1)(2)(3)等。
14.第一个分离的限制性内切核酸酶是；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是15.限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是,它们属于。
16.由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理沦值应该是·17.SalI和NotI都是哺乳动物中识别序列稀有的酶，在哺乳动物基因组的5kb片段中，找到NotI切点的概率是。
18.部分酶切是指控制反应条件，使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割，它的理论依据是。
19.Ⅰ类限制酶识别DNA的位点和切割的DNA位点是不同的．切割位点的识别结合有两种模型，一种是，另一种是。
20.限制性内切核酸酶通常保存在浓度的甘油溶液中。
二、判断题1.限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它足通过对外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。
2.限制性内切核酸酶在DNA中的识别／切割位点的二级／三级结构也影响酶切效率, 一般来说，完全切割质粒或病毒DNA，要比切割线状DNA需要更多的酶，最高的需要20倍，3.如果限制性内切核酸酶的识别位点位于DNA分子的末端，那么接近末端的程度也影响切割，如HpaII和MboI要求识别序列之前至少有一个碱基对存在才能切割。
4.能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌，其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列。
5.限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP)图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图谱而后者是—个连锁图6.用限制性内切核酸酶HaeⅢ分别切割载体DNA和供体DNA后，可用E.coli DNA连接酶进行连接。
7.已知某—内切核酸酶在一环状DNA上有3个切点，因此，用此酶切割该环状DNA,可得到3个片段。
8.迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链DNA，又能作用于单链DNA。
9.基因工程中使用的Ⅱ类限制性内切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性10.DNA多态性就是限制性片段长度多态性。
11.用限制性内切核酸酶PstI切割质粒pBR322后，再用外切核酸酶ExoⅢ进行系列缺失，可得到一系列大小不同的缺失突变体。
12.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致—些酶的星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在5％以下。
13.具有EcoRⅡ末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoRlI末端的载体中。
14.从Esherichia coliK中分离的限制性内切核酸酶命名为EcoK。
15.同一种限制性内切核酸酶切割靶DNA，得到的片段的两个末端都是相同的，16.在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他的限制性酶就不能切割了。
17.稀有酶是指那些识别序列很长又不常用的限制性内切核酸酶。
三、选择题(单选或多选)1.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。
(a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成(b)这—系统中的核酸酶都是n类限制性内切核酸酶(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰(d)不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统2 .RFLP产生自( )(a)使用不同的限制性内切核酸酶(b)每种类型的染色体有两条(二倍体)(c)染色体中碱基的随机变化(d)Southern印迹(e)不同探针的使用3.Ⅱ型限制性内切核酸酶:( )(a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列(b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供(c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性(e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供4.Ⅲ型限制性内切核酸酶：( )(a)由两个亚基组成，仅识别半甲基化位点。
甲基化位点相对于限制位点的位置(上游或下游)决定了DNA是被甲基化还是被限制(b)不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥：MS亚基促使甲基化，R亚基促使限制(c)由两个亚基组成，在识别位点附近识别并进行甲基化或限制(d)在错配修复中起关键作用，因为酶结合到DNA上是以结构扭曲为基础而不是序列错误识别(e)是光依赖型酶，是嘧啶二聚体进行“光反应”的关键酶，它们能使胸腺嘧啶二聚体间的共价键断裂5.分析限制性内切核酸酶切割双链DNA所得到的DNA片段的长度有助于物理作图。
这是因为：( )(a)即使只用一种限制酶，因为DNA是线性的，所以也可以迅速确定限制性片段序列(b)内切酶在等距离位点切割DNA，同时对于每个生物体的长度是特异的(c)DNA的线性意味着单限制性酶切片段的长度之和等于DNA的总长,而双酶切产生的重叠片段则产生模糊的图谱(d)这些内切酶的消化活性是物种特异的(e)这—技术同时为核苷酸序列提供了广泛信息6.通过限制性片段分析，可以对等位基因进行精确的分析比较，其原因是：( )(a)限制性内切核酸酶只切割两个变异等位基因中的—个(b)它利用限制性位点作为遗传标记(c)一个特定细胞中等位基因的核苷酸序列不会是相同的(d)它不依赖于变异等位基因产物的功能。
(e)限制性内切核酸酶的切点被限制在DNA的编码区域内7.限制性片段长度多态性(RFLP)是：( )(a)用于遗传的“指纹结构”模式分析的技术(b)二倍体细胞中的两个等位基因限制性图谱的差别(c)物种中的两个个体限制性图谱间的差别(d)两种物种个体间的限制性图谱差别(e)两种酶在单个染色体上限制性图谱的差别8.为了正确地构建一个真核基因组的物理图谱：( )。
(a)必须有可能清晰地分离各个染色体(通过脉冲场凝胶电泳)(b)必须从单倍体细胞(配子)中分离DNA，这样避免了由二倍体细胞中同源染色体的存在而产生的干扰信息(c)必须进行单个染色体分析，这只能在细胞分裂后期进行(d)必须找到对于每个染色体只切割一次的限制酶(e)必须首先分离核DNA和细胞器DNA，然后对它们分别作图9.下面有关限制酶的叙述哪些是正确的?( )(a)限制酶是外切酶而不是内切酶(b)限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割(c)同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的(d)一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生黏末端(e)一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA，产生平末端10.因研究入噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( )(a)J.Lederberg (b)WArber (c)H.Smith (d)FSanger11.第一个被分离的Ⅱ类酶是：( )(a)EcoK (b)HindⅢ(c)HindⅡ(d)EcoB12.双链DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列，这种序列一般具有下列特征：（）(a)有对称轴(b)两条链的5'--3'方向的序列相同(c)是Ⅱ类酶的识别序列(d)可增强基因的表达13 在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好？(a)反应时间(b)酶量(c)反应体积(d)酶反应的温度14 在下列试剂中，那—种可以螯合Ca2+离子?( )(a)EDTA (b)柠檬酸钠(c)SDS (d)EGTA15 在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( )(a)S1单链核酸酶(b)末端转移酶(c)碱性磷酸酶(d)Bal31核酸酶16 限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( )(a)双链DNA的特定碱基对(b)双链DNA的特定碱基序列(c)特定的三联密码(d)以上都正确17 在下列酶中，催化反应不需要A TP的是( )(a)EcoK (b)EcoB (c)T4DNA连接酶(d)BamHI18 下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是((a)Sau 3A I (b)E．coR I (c)hindⅢ(d)Sau 3A 119 限制性内切核酸酶的星号活性是指：( )(a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性(b)活性大大提高(c)切割速度大大加快(d)识别序列与原来的完全不同20 下面哪—种不是产生星号活性的主要原因?( )(a)甘油含量过高(b)反应体系中含有有机溶剂(c)含有非Mg2+的二价阳离子(d)酶切反应时酶浓度过低21 DNA被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因哪一项不太可能?( )(a)酶失活(b)蛋白质(如BSA)同DNA结合(c)酶切条件不合适(d)有外切核酸酶污染22 关于回文序列，下列各项中，( )是不正确的(a)是限制性内切核酸酶的识别序列(b)是某些蛋白的识别序列(c)是基因的旁侧序列(d)是高度重复序列23 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当(a)由作用于同—DNA序列的两种酶构成(b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰(d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统四、简答题1 现分离到X82噬菌体的一个突变型，它同野生型的噬菌斑相当不同，并已分离到这两种噬菌体的DNA，请设计—个实验，初步鉴定是点突变、插入突变还是缺失突变?2 说明SangerDNA测序法的原理。