不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类：依照限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，别离是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；还有认知(recognize)DNA 上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，有效性较高的限制酶种类。
例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用：1、在甚因工程方面利用能产生“粘性结尾”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处置不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性结尾, 能够彼此“粘合”,再经连接酶处置, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶要紧应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必需通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮忙才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用一样的限制酶处置, 使载体带上各类各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再挑选出所需的菌株, 便取得带有某一目的基因的繁衍系.用这种方式, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必需有较高的复制率, 以求取得大量的基因产物；必需具有一个选择性标志, 以便挑选；还要有一最多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求利用平安。
酶切原理
一、DNA的限制性酶切实验原理 DNA的限制性酶切实验原理
1. 限制性内切酶的类型 根据限制酶的识别切割特性， 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ 型三大类。 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 第一类（ 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序 能识别专一的核苷酸顺序， 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它 们在识别位点很远的地方任意切割DNA DNA链 们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA DNA重 酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克 组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克 DNA 隆基因。 隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
材料、 三 材料、设备及试剂
质粒 ：pUC118、pEGFP 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式 高速离心机， 电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、微波炉 试剂： 试剂：琼脂糖 、TAE电极缓冲液、Lamdar DNA EcoR I /HindⅢ 、 EB 、 加样缓冲液
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
平头末端： 平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双 链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ | 3’…… CTA|TAG …… 5’ | 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
一、DNA的限制性酶切实验原理 DNA的限制性酶切实验原理
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定实验原理及步骤、注意事项
实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。
许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。
例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。
5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。
限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。
根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。
根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。
小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。
在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。
二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。
2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
限制酶的多种切割要领
限制酶的多种切割方法 一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体──形成黏性末端 1. 单酶切 （1）同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。
这是最简单的一种方法，含目的基因的DNA片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组DNA分子。
（2）用同裂酶去切割含目的基因DNA片段与运载体。
有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。
同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。
2009年江苏生物高考第34题就出现了同裂酶（BamHⅠ与BstⅠ），其中的差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。
（3）用同尾酶切割含目的基因DNA片段与运载体。
有一些来源不同、识别的核苷酸顺序和切割位置各不相同，但能产生相同的黏性末端，这类酶被称为同尾酶。
常用的限制酶BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ和Sau3A就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC四个核苷酸组成的黏性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其黏性末端之间的碱基互补作用而彼此连接起来。
【例1】（2005年天津理综）：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。
①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。
③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？ 解析：这两种酶属于同尾酶，能产生相同的黏性末端，因此能够连接起来。
③由于两者产生的黏性末端相同（都是GATC），黏性末端之间能发生碱基互补配对而连接。
（4）单酶切的优点与缺点。
单酶切优点就是操作简单。
它的缺点主要有两个：①酶切后的质粒与目的基因在DNA连接酶作用下易自身环化：用单酶切切割后的目的基因和质粒的两侧各有一个黏性末端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因和质粒分别发生首尾相连，都形成环状DNA分子，其中质粒又恢复成没有切割前的样子。
实验2-设计性实验-不同限制性内切酶对质粒切割-指导讲解
实验二不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割（设计性实验）设计实验目的：培养学生独立完成实验设计、实验操作和撰写小论文的能力。
设计实验要求：选用1或2种内切酶，将所提供的质粒DNA切割为至少3-4个以上的片段。
设计实验过程：学生根据实验要求，运用学过的知识，先设计实验方案，提交老师批阅认可；再独立进行实验准备和实验；实验结束，撰写设计性实验报告，即小论文1篇。
小论文要求：字数不少于3000，包括论文题目、作者、摘要、关键词、引言、材料与方法、结果与分析、结论或讨论、参考文献等。
设计实验涉及知识点：1）质粒的限制性内切酶图谱；2）质粒酶切鉴定；3）DNA片段的琼脂糖凝胶电泳。
设计实验要求学生独立撰写小论文。
Digestion of plasmid DNA with different restriction endonuclease 不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割一、原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于A TP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子, 然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶, 它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
质粒的双酶切
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TTC ……3’
3’…… C T T|AA’G …...5’
|表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是 回文顺序。 ‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成两个DNA片段，各 有一个单链末端，两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA连接酶的作用而“粘合”
• 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶
• 限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情 况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
➢ Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上 切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类 限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结 构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等
E5’c…oR…ⅠG酶’A（A切T|TaTK割CaR…a后公…司3形’） 成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来 1Ⅱ0×型H限B制➢u性ffe内rⅢ切型酶能限识别制专一性的内核苷切酸顺酶序也，并有在该专顺序一内的的固识定位别置顺上切序割双，链。但不是对称的回文顺序，在 3’…… CTA’|识TAG别……顺5’序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸 由这于类这 酶类如限Ec制o对B性、内不Ec切oK是酶等的特识别异和切性割的的核。苷酸因都是此专一，的这。 种限制性内切酶切割后产生的一定长度 这但类这限 几制个性核内苷D切酸N酶对A在不片是DN特A段异重性组，的技具。术或有基因各工种程中单用处链不末大，端无法。用因于分此析D不NA能结构应或用克隆于基因基。因克隆
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不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割
——限制性核酸内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8切割
摘要：【目的】为加深对限制性核酸内切酶和质粒DNA的酶切关系的认识，采用限制性核酸内切酶EcoRI对质粒DNA进行切割，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。
【方法】采用限制性内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。
【结果】经琼脂糖凝胶电泳后，结果获得两条分子量不同的DNA带。
【结论】结果表明，用不同限制性核酸内切酶对质粒DNA 进行切割，可将质粒DNA切割成不同长度的DNA片段。
关键词：限制性内切酶EcoRI 质粒DNA 凝胶电泳酶切图谱
引言：没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。
限制性核酸内切酶均来源于原核生物，用于抗击外来DNA的入侵。
限制性核酸内切酶，能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，既是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。
因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。
材料和方法：
1．材料
1.1 重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实
验室构建
1.2 限制性内切酶：EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司
1.3 琼脂糖：进口分装
2．设备
2.1 DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂
2.2 0.1-2.5ul、0.5-10ul、5-50ul移液枪购自北京市六一仪器厂
2.3 ECFOII手掌型离心机购自碧云天生物技术研究所
2.4 EDC-810基因扩增仪、微波炉、凝胶成像系统等。
3．试剂
3.1 5 x TBE电泳缓冲液
3.2 6 x 电泳载样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液，贮存于4℃；
3.3 溴化乙锭溶液母液：将EB配臵成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储
于室温；
3.4 DNA分子量标准：从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
4．操作步骤
4.1 DNA酶切反应
4.11 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入DNA 1ug和相应的限制核酸内切酶反应10 x 缓冲液2ul，再加入重蒸水使总体积为19ul，将管内溶液混匀后加入1ul酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液
集中在管底。
此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。
使
用限制性核酸内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
4.12 混匀反应体系后，将eppendorf管臵于适当的支持物上，37℃水浴保温
2-3小时，使酶切反应完全。
4.13 每管加入2ul 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，臵于冰箱中保
存备用。
4.2 琼脂糖凝胶的制备
4.21 取5xTBE缓冲液20ml加水至200ml，配臵成0.5xTBE稀释缓冲液，待用。
4.22 胶液的制备：称取0.6-0.7g琼脂糖，臵于200ml锥形瓶中，加入80ml
0.5xTBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，
此为-0.8%琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。
4.23 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。
将封好的胶
槽臵于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，将冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入EB溶液时期终浓度为0.5ug/ml。
用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。
倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。
待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5xTBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4.24 加样：取10ul酶解液与2ul 6x载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品
槽中。
上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
4.25 电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。
控制电压保持在60-80V，
电流在40mA以上，电泳30分钟。
4.26 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察已加有EB的电泳
胶板，DNA存在处显示出肉眼可变的荧光条带。
结果和分析：
如图1所示，用限制性核酸内切酶EcoRI对重组质粒pUC19-P35S:ARF8进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，获得了两条不同的条带图谱，对照DNA Maker 的分子量，可知这两个条带图谱的分子量均大于2000bp，其中有一个条带图谱的分子量约为2703bp。
图1 限制性核酸内切酶EcoRI与重组质粒pUC19-P35S:ARF8的酶切电泳图谱（栏0：DNA Maker ; 栏2：本实验的酶切图谱）
根据限制性核酸内切酶EcoRI的特性可知，限制性核酸内切酶EcoRI属于第II类限制性内切酶，可以切割某一特异的核苷酸序列，是重组DNA的基础。
本实验中限制性核酸内切酶EcoRI在重组质粒pUC19-P35S:ARF8上有6个识别位点，即可以识别六个核苷酸序列：5’-G？AATTC-3’，完全酶切时可把重组
质粒切割成6个分子量大小不一的DNA片段，分别为：289bp、450bp、612bp、873bp、1363bp、2703bp，因此完全酶切时，我们能够在酶切电泳图谱上看到6条不同的条带。
然而，本次实验的酶切电泳图谱表明，本次实验不成功，操作上存在不足或缺陷，导致限制性核酸内切酶EcoRI对重组质粒pUC19-P35S:ARF8的酶切是不完全的或没有酶切的，经过讨论，认为以下原因可能导致本次实验的失败：1．操作时，加入eppendorf管的限制性核酸内切酶EcoRI离开冰箱的时间过长，活性有所降低；
2．制备限制性核酸内切酶EcoRI时没有加入BSA溶液，以致限制性核酸内切酶EcoRI活性下降或影响其酶切机理，导致DNA酶切反应失败；
3．实验时所加入的限制性核酸内切酶EcoRI的用量不足，导致DNA酶切反应不佳；
3．加样时，加样的体积过多或每加完一个样品后没有更换tip头，可能引起相互污染，影响电泳的结果；
4．加样时，由于操作不佳，实验者把样品槽底部凝胶刺穿或损坏，影响了DNA片段的移动。
参考文献：
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