CHIP SEQ分析常见问题集锦
ChIP-Seq分析和作用
ChIP-Seq分析和作⽤1：ChIP-Seq数据是基因组特异性富集的序列的测序结果，包括组蛋⽩修饰ChIP-Seq(H3K4me3/启动⼦相关/narrowpeak、H3K4me1/增强⼦相关/narrowpeak、H3K27ac/增强⼦相关/broadpeak)、转录因⼦ChIP-Seq(CTCF/绝缘⼦相关/narrowpeak、pol II/转录起始/narrowpeak)、DNA富集序列(DNase-Seq/弱DNA酶消化/活性区域、MNase-Seq/强DNA酶消化/核⼩体不活跃区域、ATAC-Seq//前两者的结果的集合)。
通过互补染⾊质分析实验分析的基因组位点揭⽰了染⾊质结构的不同⽅⾯：ChIP-seq显⽰特异性转录因⼦（TF）的结合位点; DNase-seq，ATAC-seq和FAIRE-seq显⽰开放染⾊质的区域;和MNase-seq鉴定良好定位的核⼩体。
在ChIP-seq中，特异性抗体⽤于直接或通过包含靶因⼦的复合物中的其他蛋⽩质提取结合⾄靶蛋⽩的DNA⽚段。
在DNase-seq中，染⾊质被DNA酶I内切核酸酶轻微消化。
⼤⼩选择⽤于富集在DNA对DNA酶I攻击⾼度敏感的染⾊质区域产⽣的⽚段（在初期会⽣成包含各种长度的DNA⼩⽚段，但是⼀般来书保留100~300bp长度的⼩⽚段建库测序）。
ATAC-seq是DNase-seq的替代⽅法，其使⽤⼯程改造的Tn5转座酶来切割DNA并将引物DNA序列整合到切割的基因组DNA中（即，标记）。
微球菌核酸酶（MNase）是内切核酸外切酶，其连续地消化DNA直到达到阻塞（和DNA酶相⽐（DNase-seq），属于强切，开放的区域全部都被消化），例如核⼩体。
在FAIRE-seq中，甲醛⽤于交联染⾊质，并且苯酚 - 氯仿⽤于分离剪切的DNA。
2：ChIP-Seq数据的作⽤：a:构建物种的epigenome，利⽤chromHMM将基因组分成⼀个⼀个的区域；b:与交互数据(HiC/chia-pet)联合分析；c:和RNA-Seq联合分析(chirp-seq)。
ChIP-seq实践（H3K27Ac,enhancer的筛选和enhancer相关基因的GO分析）
ChIP-seq实践（H3K27Ac,enhancer的筛选和enhancer相关基因的GO分析）转自简书生信start_site在实践之前，我先查找了一下有关组蛋白修饰的知识点：（参考文章：https:///p/8aca72809c5c）组蛋白修饰能预测染色质的类型（异染色质或常染色质）、区分基因组功能元件（启动子、增强子、基因主体）以及检测决定这些元件处于活性状态或是抑制状态。
例如H3K4me2和H3K4me3修饰大多数富集在转录起始位点附近的启动子上激活基因表达，而H3K27me2和H3K27me3与基因抑制相关。
因此可通过CHIP-seq 分析组蛋白修饰的分布寻找基因的启动子区和增强子区域及其是激活或抑制基因表达。
H3K4me1可作为增强子的标志，H3K4me3作为启动子标志。
研究表明，H3K4me1和H3K4me3与基因激活相关，H3K4me3主要富集在转录起始位点附近的启动子区域，而大多数H3K4me1修饰富集在增强子区域；H3K27ac与基因激活相关，主要富集在增强子和启动子区域，当增强子区只有H3K4me1修饰富集时，该增强子处于平衡状态，而当增强子区域同时富集H3K4me1和H3K27ac修饰时，该增强子就处于激活状态促进基因表达；H3K27的甲基化是可逆的过程，H3K27me1显示出对转录具有正向影响,启动子区域的H3K27me3甲基化修饰时抑制基因的转录,而H3K27me2广泛分布并且在沉默非细胞类型特异性增强子中起作用。
下表为常见的组蛋白修饰的主要分布及功能：image异染色质是染色质的浓缩，转录无活性状态，H3K9甲基化是异染色质的标志。
H3K27me1和H3K9me3存在于着丝粒异染色质区域，而H3K27me3和H3K9me2共同存在于抑制的常染色质区域中。
H3K9ac也与H3K14ac和H3K4me3高度共存共同作为活性基因启动子的标志。
本次实践文章：Targeting super-enhancer-associated oncogenes in oesophageal squamous cell carcinoma用不同浓度的OSCC抗癌物THZ1处理两种OSCC细胞系：KYSE510和TE7。
想做ChIP-seq的你，必须要避免的“坑”（一）
想做ChIP-seq的你，必须要避免的“坑”（⼀）ChIP-seq必须要避免的“坑”ChIP全称是染⾊质免疫共沉淀，就是⽤抗体吊取⽤甲醛交联过的染⾊质中的特异转录因⼦或者发⽣修饰的组蛋⽩，然后，⽤磁珠，琼脂糖珠，或者抗体包被板等策略将转录因⼦或组蛋⽩上交联上的DNA洗脱下来，然后去测序。
说起来很简单，但是，这⾥边有很多“坑”，我们⼀⼀细数⼀下。
ChIP实验最初是为细胞开发的，所以细胞⽔平的ChIP实验体系较为成熟，可以⾃⼰配试剂，也可以买成熟的试剂盒，国产的进⼝的都有很多选择，效果都差不多。
但是组织⽔平就不⼀样了，如果你选择的是⽤组织去做ChIP-seq，那么你要⾸先评估⼀下⾃⼰的组织是什么质地的：组织的质地1.如果是蛋⽩分泌器官，那么，你就需要很⼤的起始量，⽽且做处理组织的时候，要彻底匀浆分多次将⽬标组织悬液洗脱下来。
2.如果你是很纯的组织，⽐如⼀些脏器，没有太多的细胞核以外的蛋⽩质，那么只需要匀浆⼀次，⼀次性就可以洗脱下来⾜够数量的组织悬液。
材料新鲜组织材料是否新鲜也对实验有⼀定影响。
冷冻过的组织，可以做ChIP吗？答案是，可以。
我试过⽤冻了4年的组织去做ChIP依然ChIP下来DNA，但是，这种还是不建议的，ChIP下来的DNA量会变少，⽽且需要3-5倍于新鲜组织的组织起始量。
最好选⽤新鲜的组织去做ChIP，不要冷冻最好了。
想想我们提取核蛋⽩推荐的是什么材料。
时间⼩技巧ChIP实验步骤⾮常多，周期较长，1-3天不等吧。
因此，要涉及到哪⼏步是可以停下来的，毕竟我们都是凡夫俗⼦，不可能不吃不喝连⼲好⼏天吧？不论是⾃⼰配的试剂还是⽤的试剂盒，可以停下来的时间节点分别是：1. ⽢氨酸终⽌交联以后，最好是⽤清洗buffer把含有甲醛和⽢氨酸的溶液换掉以后。
2. 破碎过后的组织悬液可以在-80℃保存3个⽉左右这两步停顿的时间应该基本够我们去吃个饭之类的，还有就是抗体孵育，⼀般是过夜，因为通常情况下，做到这⼀步应该就晚上了，不过经过测试，孵育4个⼩时，和过夜⼏乎没有差别。
20个测序常见的问题
20个测序常见的问题20个测序常见的问题1．为什么需要新鲜的菌液？首先，新鲜的菌液易于培养，可以获得更多的DNA，同时最大限度地保证菌种的纯度。
2．如何提供菌液？如果您提供新鲜菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以将培养好的4～5ml菌液沉淀下来，倒去上清以方便邮寄。
同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破。
3．如何制作穿刺菌？用灭菌过1.5ml或2ml离心管加入LB琼脂(7g/L)斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达管底，不完全盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或4度保存。
4．PCR产物直接测序有什么要求？（1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。
如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；(2）必须进行胶回收纯化；(3）DNA纯度在1.6—2.0之间，浓度50ng/ul以上。
5．为什么PCR产物直接测序必须进行Agarose胶纯化？如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰，这主要是非特异性扩增产物或者原来的PCR引物去除不干净所导致。
大多所谓的PCR“纯化试剂盒”实际上只是回收产物而不能起到纯化的作用的。
对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的PCR引物，这会造成残留的引物在测序反应过程中参与反应而导致乱峰。
6．如何进行PCR产物纯化？PCR产物首先必须用Agarose胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。
使用凝胶回收试剂盒回收，产物用ddH2O溶解。
7．PCR产物直接测序的好处？（1) PCR产物直接测序可以反映模板的真实情况；（2) 省去克隆的实验费用和时间；（3) PCR产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更有保障；（4) 混合模板进行PCR的产物直接测序可以发现其中的点突变。
8．对用于测序的质粒DNA的要求有哪些？对测序模板DNA的一般要求：（1)DNA纯度要求高，1.6—2.0之间，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色体DNA，蛋白质等；（2)溶于ddH2O中，溶液不能含杂质，如盐类，或EDTA等螯合剂，将干扰测序反应正常进行。
ChIP实验常见问题解析
ChIP实验常见问题解析ChIP实验常见问题解析1.染色质免疫共沉淀(ChIP)实验中使用超声方法断裂染色质温度不易控制，可能会使蛋白变性，如何进行优化？染色质免疫共沉淀(ChIP)实验中超声的优化一般从如下几个方面考虑:（1）重复已发表文献中的剪切方案时建议进行优化。
尤其是当仪器不同于文献中所使用的仪器时。
（2）使用基于探头的超声破碎仪时，探头要适于样品体积。
（3）在任何情况下，剪切参数都应当根据样品体积、细胞密度和细胞类型而优化。
（4）优化应当包括功率设置（超声时间 vs. 间隙时间/休息时间）以及获得长度为200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循环数，每个优化实验只优化一种参数；（5）注意时间和功率设置。
过度破碎和太高功率设置会损害在免疫沉淀步骤中的表位。
降低染色质免疫共沉淀（ChIP）信号。
（6）始终保持裂解液冰冷，间断超声（而非连续），因为超声处理产生热量会使染色质变性。
（7）在超声破碎过程中避免气泡。
泡沫会导致蛋白质的表面变性，可能使染色质损失在气泡中。
为了避免这种情况，一开始设为较低功率，再逐步提高。
（8）在优化条件时，每个超声破碎循环后通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段的长度。
剪切不足所产生大的不溶复合物可能堵塞琼脂糖凝胶的孔，并延缓电泳过程。
通过消化蛋白质、逆转交联、酚:氯仿提取和沉淀来纯化DNA。
2.染色质免疫共沉淀（ChIP）实验研究转录因子，调控因子结合的DNA和组蛋白结合的DNA操作上最大的区别是什么？染色质免疫共沉淀（ChIP）实验中由于组蛋白在染色质中表达相对较高且较稳定，转录调控因子表达水平很低，往往是瞬时表达。
所以组蛋白相对研究起来更为容易，一般需要105-106个细胞即可完成一个染色质免疫共沉淀（ChIP）反应。
研究起始样本量（细胞，组织）要是组蛋白的10倍，一般每个反应至少需要107个细胞。
另外有些转录因子比较大，往往结合多个核小体，因此在染色质断裂的时候，不太适合使用酶法的处理方式，建议使用超声断裂染色质的方法。
带你读懂ChIP-seq的优点和局限
带你读懂ChIP-seq的优点和局限ChIP-seq或染色质免疫沉淀和测序是一种技术，允许研究人员通过在全基因组范围内绘制蛋白质-DNA相互作用和表观遗传标记来理解转录调控。
与以前的方法相比，ChIP-seq具有几个优点，例如ChIP 芯片，但与所有技术一样，ChIP-seq也有其局限性。
ChIP-seqChIP-seq是下一代测序的首批应用之一，该测序是在2000年代中期开发的。
其前体ChIP芯片通过与微阵列杂交分析片段，显示DNA-蛋白质相互作用。
使用下一代测序的ChIP-seq可以直接测序目标片段，而不是将它们杂交在阵列上。
简而言之，ChIP-seq涉及用甲醛处理细胞以在体内将结合蛋白与DNA交联。
然后使用超声处理将染色质剪切成200-600bp范围内的较小片段。
对靶蛋白特异的抗体用于免疫沉淀DNA-蛋白质复合物。
最后一步涉及逆转交联和DNA的释放，其在任何下一代平台上测序以鉴定蛋白质结合的序列。
ChIP-seq的优点与ChIP芯片相比，ChIP-seq技术可实现单碱基对的分辨率，更少的伪像，更好的覆盖范围和更大的动态范围。
优异的碱基对分辨率是最重要的优势之一，因为阵列在杂交过程中具有基本的不确定性，这限制了分辨率。
虽然ChIP芯片的分辨率因阵列而异，但通常在30-100bp范围内，但ChIP-seq具有单核苷酸分辨率。
绕过杂交过程对ChIP-seq有额外的好处。
在ChIP芯片的杂交过程中，不完全匹配的序列之间可能存在交叉杂交，这增加了信号噪声。
由于直接测序方法，ChIP-seq本质上不受这些噪声源的影响。
但是，可以使用ChIP-seq接收一些GC偏差。
与其他方法相比，ChIP-seq提高了分辨率。
阵列的强度信号可能不完全是线性的，并且阵列的动态范围限制在饱和点之外。
这导致它们在ChIP芯片中被遮挡，但不是ChIP-seq实验。
与ChIP芯片的检测下限相反，ChIP-seq没有有限的动态范围。
(整理)ChIP-seq数据分析流程_上海丰核信息科技有限公司.
ChIP-seq技术及数据分析宣传画册一、ChIP-seq技术概览ChIP-seq技术是一种以研究蛋白质与染色体DNA的相互作用为主要目的的高通量数据分析手段，其实验部分主要包含染色质免疫共沉淀（ChIP）样本制备和深度测序（Deep Sequencing）两个部分。
1、ChIP实验基本步骤（1）甲醛交联整个细胞系（组织），即将目标蛋白与染色质连结起来；（2）分离基因组DNA，并用超声波将其打断成一定长度的小片段；（3）添加特异性识别目标蛋白质的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体；（4）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序。
2、深度测序当我们准备好片段化的DNA样本后，需要通过专业的高通量reads测序仪进行碱基读取的步骤。
之后把这些reads回贴到参考染色体序列上从而间接确定蛋白因子在染色体上的位置分布以及每个结合位点上蛋白因子的结合强度。
二、ChIP-seq数据的生物信息学分析流程展示ChIP-seq数据的生物信息学分析步骤包括：测序饱和度估计、测序后reads的质控和筛选、cleanreads比对、蛋白因子结合位点检测、结合位点周围候选靶基因注释、样本组间数据比较和差异结合位点的确定、特定基因的功能富集分析、个性化下游分析。
三、应用领域四、ChIP-seq数据分析在医学研究中的应用通过对ChIP-seq数据进行系统化的生物信息学分析，我们能够获得如下结果：1、通过检测疾病相关转录调控原件确定该转录调控原件的下游靶基因集合或观察病灶部位内部的表观遗传状态异常；2、比较疾病样本和正常样本中转录调控原件在染色体上结合位置的差异，选取疾病特异性的转录调控原件结合位点，观察这些位点周围的基因，缩小候选研究基因范围；3、结合基因表达谱数据和GSEA分析技术判断转录调控原件对下游靶基因的调控方向（激活基因表达为正调控，抑制基因表达为负调控）；4、通过检测转录调控原件结合位点周围的基序特征（Motif），预测与该转录调控原件发生共定位的潜在转录因子，通过数据挖掘尝试找出其他与疾病发生相关的调控基因；5、基于GeneOntology和基因功能分类知识库，帮助我们了解候选研究基因和共调控因子的具体功能，从而了解目标转录调控原件在疾病发生过程中所起的生物学作用，帮助我们认识疾病发生过程的分子机制。
多个基因的共同转录因子检测方法
多个基因的共同转录因子检测方法随着生物技术的不断发展，人们对基因调控的研究日益深入，共同转录因子在基因调控中扮演着至关重要的角色。
共同转录因子是一类能够同时调控多个基因转录的蛋白质，它们通过结合到多个基因的启动子区域，协同调控这些基因的表达。
发展一种可靠、高效的方法来检测多个基因的共同转录因子对于揭示基因调控网络的机制具有重要意义。
本文将介绍一些常用的多个基因的共同转录因子检测方法，并探讨它们的优缺点。
一、ChIP-seq技术ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）技术是目前最为常用的转录因子结合位点检测方法之一。
该方法通过将特定的抗体与转录因子结合后，利用染色质免疫沉淀技术富集转录因子结合的染色质片段，再结合高通量测序技术对富集的染色质片段进行测序，从而获得转录因子结合的基因组位置信息。
在多个基因的共同转录因子检测中，研究人员可以利用ChIP-seq技术分析多个基因启动子区域上的转录因子结合情况，进而筛选出共同调控这些基因的转录因子。
ChIP-seq技术还可以通过比较不同条件下的样品来鉴定共同转录因子的动态结合情况，进一步揭示基因调控的机制。
ChIP-seq技术也存在部分缺点，如对实验条件的要求较高、数据分析复杂等。
二、RNA-seq技术除了ChIP-seq技术外，RNA-seq技术也可以用于检测多个基因的共同转录因子。
RNA-seq技术是一种利用高通量测序技术对RNA进行定量和质量分析的方法，可以全面、准确地检测基因的表达情况。
研究人员可以利用RNA-seq技术分析在不同条件下多个基因的表达模式，通过寻找共同上调或下调的基因来筛选可能存在的共同转录因子。
RNA-seq 技术还可以通过分析基因的剪接异构体来揭示共同转录因子对于基因的剪接调控作用。
RNA-seq技术在检测转录因子结合位点以及动态结合情况方面相对ChIP-seq技术来说存在局限性。
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ChIP-Seq分析常见问题集锦
染色质免疫共沉淀测序（ChIP-Seq）是指对染色质免疫共沉淀（ChIP）获得的DNA片段进行大规模测序，并能把所研究蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上。
Roche GS FLX Titanium、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID4这3种测序技术均可以用于ChIP-seq，其中采用Illumina Solexa GA IIx进行ChIP-Seq已有较多文献报道。
ChIP-Seq技术高质量、高通量、低成本的数据产出，为表观遗传组学研究奠定了技术基础。
研究者可以在以下几方面展开研究：（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；（4）CTCF转录因子研究。
ChIP-Seq有什么样品要求？
答：（1）请提供浓度≥10ng/ul、总量≥200ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品；若单次ChIP后DNA量不够，建议将2~3次ChIP的DNA合并在一起。
（2）请提供DNA打断时检测胶图，要求打断后DNA电泳主带在200-500bp范围内；请对于ChIP 获得DNA设计引物进行QPCR验证和定量，能够提供检测位点的检测报告。
附阳性和阴性对照。
（3）样品请置于1.5ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm
封口。
在运输前将所有样品管固定于50ml带盖离心管中，再将50ml管放在封口袋中。
ChIP-Seq相比ChIP-chip有哪些优势？
答：第一，ChIP-Seq能实现真正的全基因组分析。
目前所能获得的芯片上固定的探针只能代表全基因组部分序列，所获得的杂交信息具有偏向性；第二，对于结合位点分析，ChIP-Seq 通过寻找“峰”，结合分辨率可精确到10~30bp，而芯片上探针由于长度所限，无法精确定位，即使目前最高水平的商业芯片都无法提供可与ChIP-Seq媲美的分辨率；第三是所需样本数量。
ChIP-chip需要多达4~5μg的起始样本，在杂交之前需要进行LM-PCR，但可能导致背景增高，竞争性扩增等导致假阳性。
而ChIP-Seq仅需要纳克级起始材料，如SOLiD起始材料可低至20ng。
两者技术特点如下：
研究方法CHIP-on-chip CHIP-Seq
分辨率30~100bp1bp
覆盖范围受芯片容量限制，只能选择性地扫
描特定区域，无法覆盖全基因组只要测定的序列（Reads）能够定位到基因组上，就能获得全部基因组信息
缺陷探针和非特异性区域杂交测序数据会有一些GC含量偏向
性价比只能研究在基因组上广泛存在的目
的位点（Broading bingding）可以扫描全基因组；可以研究在基因组上存在的稀有目的位点（Sharp bingding）
需要的DNA
量
高低（10~50bp）动态量程弱信号会被遗弃；强信号会饱和没有局限
选择数据产
出量
不可以可以
ChIP-Seq测序文库的构建方法？
答：目前为止，唯有Solexa在ChIP-seq领域被广泛报道，采用Solexa测序其ChIP-seq测序文库构建方法如下
（1）ChIP富集DNA片段（图1）。
首先用甲醛将活体细胞交联，随后将细胞核内的染色质用超声波打断成目标长度（通常0.2-1kb）的短片段形式，用所研究的蛋白特异性抗体将蛋白结合的DNA片段免疫共沉淀，接下来将蛋白质-DNA复合物解交联并纯化DNA片段。
ChIP富集DNA片段示意图
（2）构建测序文库。
对于ChIP富集的DNA片段纯化后，经末端补平，3’末端加A，连接接头一系列处理后，进行电泳割胶，回收150-300bp范围左右的片段，然后对回收的DNA片段进行PCR扩增，上机测序。
所测序列首先进行基因组比对然后用不同的算法进行结合位点的统计。
样品制备过程中是否需要PCR扩增？PCR扩增后是否会影响最后的结果？还有那些因素会影响ChIP-Seq的结果？
答：由于ChIP下来的DNA样品量非常少，所以在样品制备过程中需要经过一步PCR扩增的过程，PCR扩增主要是为了获得足够上机反应的DNA量。
如果客户能够提供足够量的DNA样品，我们不再进行PCR扩增。
由于是线性扩增，扩增前后的结果很相似，基本上不会影响测序结果。
抗体的质量，特异性，实验设计，ChIP的实验操作，DNA片段长度范围，测序通量，测序质量等都会影响ChIP-Seq的结果。
ChIP-Seq测序对照的选择？
答：ChIP-seq过程中，由于DNA富集过程受多种因素的影响。
因此，在做ChIP实验时，一定要做好实验对照。
因为没有对照，很难对实验结果的可靠性进行评估。
一般有三种实验对照：Input 对照、阳性对照和阴性对照。
（1）Input对照：在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。
Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。
Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含
量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP 实验必不可少的步骤。
（2）阳性对照和阴性对照：阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。
阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。
阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。
目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较，才能得出正确结论。
如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体，只有其他用途的抗体时，可以先做蛋白质免疫沉淀（Immunoprecipitation）检测。
如果抗体可以成功的沉淀蛋白，再进行染色质免疫沉淀实验的检测。
怎样进行ChIP-seq多重测序（Multiplexed Sequencing）？
答：根据所研究的ChIP-DNA的大小以及所选择的测序深度，计算每个样品所需的数据通量，在单个个体的数据量能够保证的前提下，可以对多个样品进行多重测序（Multiplexed Sequencing）。
Solexa运行1个run最多可以获取50Gb的碱基数据，共8个通道，每个通道可以对12个混合样本进行测序，每个run可以对96个混合样本进行测序；多重测序（Multiplexed Sequencing）的步骤如下：（1）对富集得到的双链DNA进行末端修复；（2）将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端；（3）使用特定的测序接头连接DNA片段两端；（4）纯化连接产物以除去未连接的接头序列；（5）以Barcodes标记的引物和高保真聚合酶PCR扩增的DNA片段；（6）检测测序文库。
只要采用高通量测序，就一定可以达到高分辨率？导致ChIP-seq测序假阳性比较高的因素？
答：高通量的测序确实大大提高了ChIP检测的分辨率，但并不是高分辨率的唯一决定因素。
免疫富集后，染色质被打断的片段长度也会影响分辨率。
DNA打碎方法、染色质开放程度的不均一性、PCR扩增偏向性、基因组的重复程度以及测序和序列比对过程中的错误都会引入系统误差造成假阳性，测序后首先将序列比对到已知基因组上并确立真正的结合位点（峰，peak）。
对于转录因子，要寻找“峰”对应的下游调控基因（靶基因），或者构建转录因子结合位点的保守结合序列，如果转录因子的motif是已知的，则可以计算“峰”序列中包含motif序列的百分比，间接估计实验结果的可靠性。