基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析
基因工程制药的下游技术
制剂开发与生产技术
制剂开发与生产技术是将目标蛋白转化为药物制剂的过程。它包括药物的制剂设计、工艺开发和规模化生产等。 关注药物的稳定性、生物活性和适宜给药等因素。
药物质检与质量控制技术
药物质检与质量控制技术是确保基因工程制药产品质量的重要环节。它包括药物的质量评价、药物安全性和有 效性的检测等，保证药物符合国家和国际标准。
基因工程制药的下游技术
基因工程制药是利用基因工程技术进行药物研发和生产的过程，对医学和生 物技术领域具有重要意义和广泛应用。
基因工程制药的定义
基因工程制药是通过改变或引入基因来生产药物的过程。它包括基因克隆、基因转化和基因表达等技术，为研 发和生产创新药物提供了强大工具。
基因工程制药的意义和应用
展望与未来发展趋势
基因工程制药的未来发展前景广阔。随着技术更大贡献。
基因工程制药革命性地改变了传统药物研发和生产的方式。它可以生产高效、安全、纯度高的药物，并且能够 针对个体差异进行精准治疗，提高治疗效果和患者生活质量。
下游技术的概述
下游技术是指基因工程制药中从基因表达产物到最终药物形成的一系列工艺流程。它包括细胞培养技术、蛋白 质表达与纯化技术、制剂开发与生产技术以及药物质检与质量控制技术。
细胞培养技术
细胞培养技术是基因工程制药生产中的关键环节，通过培养细胞并控制其生 长条件来生产目标蛋白。它包括细胞株的筛选、培养基的优化以及培养过程 参数的控制。
蛋白质表达与纯化技术
蛋白质表达与纯化技术是将目标基因转化至表达系统中，并通过表达和纯化过程获得纯度高的目标蛋白。常用 的表达系统包括细菌、哺乳动物细胞和酵母等。
重组蛋白的高效表达与纯化工艺研究
重组蛋白的高效表达与纯化工艺研究重组蛋白是指利用基因工程技术将目标蛋白基因表达在外源宿主细胞中，通过特定的工艺流程制备出来的蛋白质。
由于其纯度较高，无传染性等特点，已被广泛应用于药物、生化分析、诊断试剂以及生物制品等领域。
而蛋白高效表达与纯化工艺则是重组蛋白的制备过程中重要的环节，决定了最终的产量和纯度，因此受到广泛关注。
一、重组蛋白表达系统目前常用的表达系统主要有哺乳动物细胞系统、细菌表达系统、酵母表达系统和昆虫细胞表达系统。
这些系统各自有其优缺点，选择合适的系统取决于蛋白质的性质以及应用场景。
一般来说，哺乳动物细胞系统表达的蛋白相对较为复杂，需要进行多种后续处理，但产生的蛋白具有较好的生物活性和免疫原性，适用于药物等要求严格的领域。
而细菌表达系统则具有表达量高、快速、简便的优点，但其表达的蛋白在折叠和修饰方面有局限性，一些复杂的蛋白可能需要在其他表达系统中获得更好的表达。
因此，在实际应用中需要根据实际需要和性质选用最合适的表达系统。
二、重组蛋白纯化工艺重组蛋白的纯化过程决定了最终产物的纯度和质量，而不同的表达系统生成的蛋白具有不同的特点，需要针对性地制定纯化工艺。
纯化工艺的主要步骤包括：细胞破碎、初步筛选、中间层析和后续纯化。
其中，中间层析是纯化工艺的重点，需要针对不同蛋白的特性选择不同的层析介质。
常用的层析介质包括亲和柱、离子交换柱、逆流层析柱、尺寸排阻柱等，这些介质可以根据蛋白特性进行组合，以达到最好的分离和纯化效果。
此外，采用特定的添加剂和离心操作可以进一步增加纯化效率。
三、重组蛋白高效表达与纯化技术的研究进展近年来，为提高重组蛋白的表达效率和纯化效率，不断涌现出一些新的技术手段和方法。
其中，一些常用的技术如下：1、融合表达技术：融合表达是指将目标基因与一个易于表达的载体基因融合，通过转录和翻译的过程共同表达，从而提高目标蛋白的表达效率。
常用的融合载体包括GST、His、MBP等。
这些载体向目标蛋白的N端或C端融合，可以提高目标蛋白的稳定性、纯度和溶解度。
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
基因工程制药中常用的上、下游技术
离子交换层析法
基于离子交换在不同介质之 间的特性，制备氢氧化微晶 包埋的阴阳离子交换膜在离 子交换残基的基础上:定向压 缩膜内阳离子、阴离子间的 吸附分离。
亲和层析法
利用亲和柱的亲和性选择性 地在蛋白质中寻找高结合性 靶分子，逐渐实现蛋白质的 纯化。
重组蛋白生产
重组蛋白生产是指在细胞内表达外源的基因产物，通过状态微调，最终得到高质量的蛋白质样品。
基因工程制药用途广泛，对于疫苗、抗体、激素等方面展现了重要价值。随着技术的不断发展和完善， 组合技术的应用将是基因工程医药发展的下一个阶段。
1
HIV疫苗的开发
以基因工程技术为核心的疫苗研发取得了很大的进展，HIV的防控也凸现出更多值得期待 的前景。
2
癌症治疗药物
永久性转基因移植可提供生活质量更高的癌症治疗方案。
考虑维持培养细胞的健康状态
选择合适的生长移植原、营养密集型的培养基，延长细胞寿命，保持细胞的生长平衡。
纯化与分离
在基因工程制药中，不同的蛋白质表达量不同，而且蛋白质含量非常低，经过纯化和分离，能够将不同的蛋 白质分离开来，并增加效率。
摸索分离
对目标蛋白质的物理化学特 性、分子结构等方面进行初 步测试，采用分离纯化相结 合的复合策略。
基因工程制药中常用的上、 下游技术
基因工程制药是指利用DNA重组技术等手段，改变微生物、植物、动物等生 物体内的合成代谢途径，大量生产用于医疗或其他用途的具有特异性活性的 蛋白质及其他分子制品。
基因克隆
基因克隆是指将外源基因插入宿主细胞中，实现基因的复制及增加。常见的克隆载体有质粒、噬菌体等，其中 质粒维护简单、较稳定，被广泛应用于基因工程制药的克隆中。
1 全方位筛选
通过演化、高通量筛选等 手段，找到合适的工程菌 株，以获得最大刺激目标 基因表达的效果。
3种进行基因工程表达目的蛋白质的分离纯化方法
3种进行基因工程表达目的蛋白质的分离纯化方法在基因工程研究中，蛋白质分离纯化是非常重要的一环。
下面将介绍三种常用的基因工程表达目的蛋白质分离纯化方法。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种常用的蛋白质纯化方法，基于特定配体与目标蛋白质之间的选择性结合。
通常，可以在目标蛋白质中引入一个标签序列，如融合标签或标签标记，使其与固定在纯化层析柱上的配体相互作用。
配体可以是金属离子、抗体、亲和剂或其他具有与目标蛋白质选择性相互作用的分子。
利用这种亲和层析柱进行分离纯化时，可以通过洗脱缓冲液中高浓度的竞争性配体或特定的环境条件来实现目标蛋白质的高效纯化。
2. 凝胶电泳法：凝胶电泳法是一种常用的蛋白质分离技术，根据蛋白质在电场中的迁移速率差异进行分离纯化。
通常，首先将表达目的蛋白质从细胞裂解物或培养基中提取出来，并用浓缩技术进行初步富集。
然后，将蛋白质样品加载到凝胶（如SDS-PAGE凝胶）中，通过应用电场分离蛋白质。
根据蛋白质的大小和电荷来进行分离，并用染色或质谱等方法进行检测和分析。
3. 逆流层析法：逆流层析法是一种有效的分离纯化方法，根据蛋白质在逆流梯度中的亲和性差异进行分离。
该方法可通过将纯化柱分为若干区域，每个区域都包含不同浓度的缓冲液，从而形成逆流梯度。
蛋白质溶液经过逆流层析柱时，蛋白质会在不同条件下与纯化柱表面相互作用，并在梯度中发生多次吸附和洗脱过程。
通过逆流层析的多次循环，可以逐步富集并纯化目标蛋白质。
综上所述，亲和层析法、凝胶电泳法和逆流层析法是基因工程表达目的蛋白质常用的分离纯化方法。
这些方法各具优势，可以根据目标蛋白质的性质和实验要求选择适合的方法，以获得高纯度的表达目的蛋白质。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
基因工程的下游技术是实现基因功能研究和基因产品开发的关键环节，对于生 命科学研究、生物医药、农业、工业等领域具有重要意义。
基因工程下游技术的分类与流程
01
02
03
04
05
分类
1. 目的基因的克 2. 重组载体转化 3. 表达产物的分 4. 表达产物的分
隆和…
宿主…
离和…
析
基因工程下游技术主要包 括重组蛋白的表达、纯化 和分析等技术。
根据宿主细胞的偏好性， 对重组蛋白基因的密码子 进行优化，以提高重组蛋 白的表达水平。
载体优化
通过改造载体，增加重组 蛋白的表达量和稳定性， 如使用分泌型载体、融合 标签等。
培养条件优化
通过调整培养基成分、温 度、pH等培养条件，提高 重组蛋白的表达水平。
03 重组蛋白的纯化
重组蛋白的分离与纯化方法
详细描述
纯化是重组蛋白制备的关键步骤，通常采用多种分离纯化技术，如离心、过滤、沉淀、离子交换、亲和层析等， 以去除杂质并获得高纯度的目的蛋白。
案例二：重组蛋白的结构与功能分析
• 总结词：重组蛋白的结构与功能分析是了解蛋白性质和功能的重要手段，通过 X射线晶体学、核磁共振等技术，可以解析蛋白质的三维结构，进一步揭示其 生物学功能。
重组蛋白纯化的优化策略
选择合适的亲和配基
针对目的蛋白的特性选择特异性结合的配基，提高亲和 色谱的纯度。
结合多种分离方法
综合运用多种分离技术，如凝胶过滤色谱和反相色谱等 ，提高目的蛋白的纯度和回收率。
ABCD
优化离子交换色谱条件
通过调整离子强度、pH等参数，提高分辨率和纯度。
优化缓冲液和添加剂
选择合适的缓冲液和添加剂，如稳定剂、还原剂等，保 持目的蛋白的稳定性和活性。
基因工程重组蛋白的分离纯化放映
质的衍生物为载体，在某一 pH 条件下，这些 载体带有正电荷或负电荷，当待分离蛋白质分 子通过载体时，离子交换使蛋白质分子分离纯
机械强度大、柱效高、孔径和颗粒大小 易于控制，但应用范围窄
不能进行快速淋洗，且分离时间长，易造 成生物 分子的变性、失活
离子交换层析是发展最早的层析技术之一， 目前已成为蛋白质分离纯化最常用的手段
• 包括允许杂质种类和最大允许含量，特殊 杂质种类和最大允许量。
• 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存 稳定性等。
2021/4/8
8
三．蛋白质分离纯化应遵顺的原则
①具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响， 使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。 ②步骤之间尽量能衔接，减少工艺的步骤，同时工艺与设备也要相互适应，一般分离 原理相同的技术在工艺中不要重复使用，既可减少周期，又能提高纯度和得率。 ③技术条件要温和，温度低，PH值适中，能保持目的产物的生物活性。 ④工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤或干扰产品质盆。 ⑤周期尽量短，因稳定性差的产物随工艺时间增加，收率、质量会下降。 ⑥目的蛋白质选择性好，能从复杂的混合物中将目的产物有效地分离出来，达到较高 纯化倍数。 ⑦工艺和技术必须快速高效、收率高、易操作、对设备条件要求低、能耗低。 ⑧具有较高的安全性。在选择处理技术，工艺和操作条件时，要确保去除有危险的杂 质，保证产品质量和作用安全以及生产过程的安全，药品生产必须保证安全、无菌、 病毒、热原。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，
常用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵 等中性盐。硫酸钠具有化学性质稳定、 溶解度大等优点，现在所指的盐析法实
该法受蛋白质浓度、离子强度、盐的性质、上述两种方法分离纯化蛋白质后，都要采
蛋白质重组表达技术
蛋白质重组表达技术
蛋白质重组表达技术是一种利用基因工程技术将编码目的蛋白质的基因插入宿主细胞中，实现重组蛋白质的表达、纯化和应用的技术。
该技术主要涉及以下步骤：
1.目的基因的获取：根据需求设计合成或从天然基因库中提取目的基因。
2.构建基因表达载体：将目的基因插入到表达载体中，形成重组质粒。
表达载体可以是原核或真核生物的质粒或病毒载体。
3.转化或转染宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等。
转化或转染的方法包括化学法、电穿孔法、噬菌体感染等。
4.重组蛋白质的表达：宿主细胞接受重组质粒后，开始表达目的蛋白质。
表达形式可以是细胞内或细胞外表达，具体取决于目的蛋白质的性质和宿主细胞类型。
5.蛋白质的纯化和鉴定：通过各种纯化技术，如离心、过滤、离子交换、亲和层析等，将重组蛋白质从宿主细胞中分离出来，并进行性质鉴定，包括SDS-PAGE、Westernblot、质谱等技术。
6.蛋白质的功能研究和应用：对重组蛋白质进行生物化学性质和功能的研究，发掘其在医药、农业、工业等领域的应用价值。
总之，蛋白质重组表达技术是现代生物技术领域中非常重要的技术平台之一，可应用于新药研发、疫苗生产、生物材料制备等多个领域。
基因工程制药中常用的上、下游技术
• HA-tag (YPYDVPDYA)
• Flag-tag (DYKDDDDK) • Myc-tag (EQKLISEEDL)
和Plac杂合成的Ptac，启动强度分别是Ptrp的3倍
和 Plac 的 11 倍。启动子的强弱程度还与所控外源 基因的性质密切相关。
优化转录调控元件
双启动子表达载体
• 为提高转录活性，增加外源基因的 表达量有时将两个启动子串联到一起。 • 两个不同的启动子串联， 如 PR+T7 • 两个相同的启动子串联, 如 T7+T7
异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
包涵体型表达的优缺点
• 优点：
• 外原基因的表达量极高，对宿主细胞的 生长和代谢影响小 • 抗宿主细胞内蛋白酶降解的能力强 • 目标蛋白的纯度高，易于分离和纯化
• 缺点：
• 必须复性
异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式
分泌型表达
• 分泌型表达的特点： • 在 N 端加上能够跨膜的信号肽序列。这对 重组蛋白的折叠可能有一定好处；由于跨膜是 逐个进行的，蛋白间的交联机会较少；周质中 的蛋白酶活性比胞质低；周质蛋白仅占菌体总 蛋白的4%，使之易于纯化。但分泌到周质中的 重组蛋白其构象不一定是天然构象，在周质中 的重组蛋白也可能形成包涵体。
外源基因染色体定位整合原理
•
根据DNA同源交换原理，在外源 基因两侧各组合一段与染色体特定 部位完全相同的同源序列。外源基 因越长同源序列也需越长。
外源基因在大肠杆菌 中的高效表达的方法
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调节序列
结构基因
The structure of lac operon
Repressor and negative regulation
异乳糖
异乳糖
异丙基硫代半乳糖苷
CAP and positive regulation
低乳糖时
高乳糖时
在协调调节下，lac operon的强诱导作用发生在高乳 糖、低葡萄糖的状态。
葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性， 并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP 的浓度，抑制转录。
➢ 阻遏蛋白负调节与CAP正调节的协调
当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能 发挥作用；而没有CAP存在时，即使没有阻 遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活 性。只有在CAP存在且没有阻遏蛋白与操纵 序列结合时，或者说只有高乳糖低葡萄糖时， 操纵子发挥最大转录活性。
三．材料与试剂
1. 材料
2.
含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质
粒工程菌。
2. 试剂
① LB 液体培养基 ：
蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g，加800mL双蒸 水溶解，用10M NaOH调pH至7.2-7.5， 定容至1000mL。
分装，高压灭菌，4℃保存。
➢乳糖操纵子的降解物阻遏（续）
降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白 （Catabolite gene Activation Protein， CAP），又称cAMP受体蛋白（cAMP Receptor Protein，CRP）属于激活蛋白的一 种，对乳糖操纵子进行正调节。
CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP结合 区 。 当 CAP 与 cAMP 结 合 后 ， 就 可 结 合 到 CAP结合位点上，促进转录。
② 氨苄青霉素溶液：
无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20℃保 存，使用终浓度为50μg/mL或100μg/mL。
③ IPTG溶液：
将 2 3 8 .3mg IPTG 溶 解 于 1 0 mL 双 蒸 水 ， 0.22μm细菌滤器过滤除菌，分装，-20℃保 存备用，贮存浓度为100 mM。
④ 20%葡萄糖溶液：
当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳 糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白 的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上， RNA聚合酶可以从启动子向3’端移动，于是， 结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋 白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操 纵子被诱导。
乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异 乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解， 它的诱导作用是持久的。
3#：接50μL重组菌（含pGFPuv ）过夜培养 物 然后，加37入℃2培0%养葡至萄O糖.D56000μ约L为至0终.5浓（度约为3h0-.24%h)，， 及100mM IPTG 5μL至终浓度为0.1mM，2528℃培养8h-10h或过夜；
➢ 乳糖操纵子的诱导表达（续）
本实验所使用的表达载体上含有乳糖操纵子 的调节序列，目的基因为绿色荧光蛋白基因。 在IPTG的诱导下，目的基因表达可增强105 倍。然而，诱导表达常常受到温度和诱导物 的影响。
➢乳糖操纵子的降解物阻遏
当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长 时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。 只有当葡萄糖耗尽后，细菌才能充分利用乳 糖，这种现象称葡萄糖效应，其实质是由葡 萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解 物阻遏（catabolic repression）。
基因工程的下游技术
重组蛋白的表达、纯化和分析
重组蛋白的表达
表达体系：
表达载体
原核
受体细胞
真核
选择表达载体常用的关键元件：
启动子和调节序列（表达强弱、细胞或组织特 异性、表达调节等，如本实验的乳糖操纵子。）
融合基因（纯化、标签，或增强蛋白可溶性等。 如多聚His标签－6×His，便于镍柱亲和层析纯 化。GST融合蛋白用GST柱亲和层析）
2. 取3支已灭菌的大试管，分别加入5mL含 有氨苄青霉素的LB培养液，编号为1#， 2#，3#，另取一个250mL的灭菌三角瓶， 编号为6#，加入50mL含氨苄青霉素的LB 培养液。
3. 1#：接50μL空载工程菌（含pUC18）过夜培 养物，25-28℃培养10 h-12h；
2#：接50μL重组菌（含pGFPuv）过夜培养 物，25-28℃培养10 h-12h；
20g葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至 100mL，121℃，15min 灭菌，4℃保存。
四．实验仪器
超净工作台、 恒温摇床、离心机等。
五．操作步骤
1. 挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质 粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉 （终浓度为100μg/mL，以下同)的5mL的 LB培养基中，于37℃、250rpm过夜培养 12h-14h至对数生长期。
分泌信号
筛选标记
其它
6×His
重组蛋白的纯化
亲和层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 ……
本单元实验流程：
细菌（pEF-GFPuv） IPTG诱导
细菌总蛋白 亲和层析
乳糖操纵子的特性
重组蛋白融合蛋白 SDS-PAGE
初步分析
实验十 重组DNA在大肠 杆菌中的诱导表达
一．实验目的 二．实验原理 三．材料与试剂 四．实验仪器 五．操作步骤 六．注意事项 七．实验安排 八．思考与讨论
➢ 乳糖操纵子的诱导表达
当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录 的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵 序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的 RNA聚合酶向前移动，使结构基因不能转录， 也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有 乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态。
➢ 乳糖操纵子的诱导表达（续）
一．实验目的
➢ 了解和掌握IPTG诱导表达的原理。 ➢ 了解降解物阻遏的现象及其机理。
二．实验原理
➢ 操纵子是基因表达的协调单位。通常由2 个以上功能相关的结构基因以及一些调节 序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。
➢ 乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和 操 纵 序 列 、 启 动 子 、 CAP 结 合 位 点 等 调 节序列组成。