限制性内切酶

特征和种类
1．限制与修饰现象 早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主 控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现 象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可明这一问题 （表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coli 菌株 λ噬菌体感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 104 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。 而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限 制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的 修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲 基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目 的。
Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，能识别 专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的 双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。如 EcoK 和 EcoB。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基 存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。 EcoK 编码基因的结构为 R2M2S。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。 EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表示任意碱基。 TGA*（N）8TGCT EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。 AA°C（N）6GTGC 但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外， 且无特异性。 Ⅲ 型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ， 也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个 核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的，如 EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ， 切割位点则在下游 24-26bp 处。 在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指 Ⅱ 型 系统中的种类。
4．同裂酶（isoschizomer） 识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具体可分 为以下几种情况。 ① 同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同，如 HindⅡ 与 HincⅡ 识别切割位点为 GTY↓RAC ， HpaⅡ 与 HapⅡ 识别切割位点为 C↓CGG ， MobⅠ 与 Sau3AⅠ 识别切割位点为 ↓GATC 。 ② 同序异切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 识别的序列是相同的，但它们的 切割位点不同，分别为 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。另外， Asp718Ⅰ 识 别和切割位点为 G↓GTACC 。 ③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。 如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切割位点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。另外， HpaⅠ 和 HincⅡ 的识别位 点也有交叉，它们的识别和切割位点分别为 GTT↓AAC 和 HincⅡ 。 ④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质粒的多克隆位 点中有一个 SalⅠ 位点（识别切割位点为 G↓TCGAC），该位点也可被 AccⅠ（识别切割位点为 GT↓MKAC）和 HincⅡ（识别切割位点为 GTY↓RAC）切割。
限制性核酸内切酶
制作人：郜原 日 期：2010-3-31
简介
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease):识别并切割 特异的双链DNA序列的一种内 切核酸酶。 [别名] Endodeoxyribonuclease [酶反应] 限制性内切酶能分 裂DNA分子在一限定数目的专 一部位上。它能识别外源DNA 并将其降解。 [单位定义] 在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中， 1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
3．限制酶产生非对称突出端 许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时， 切割的 DNA 产物的末端是不同的，如 BbvCⅠ，它的识别切割位点如下： CC↓TCAGC GGAGT↑CG 有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如 AccⅠ，它的识别切割位点如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称： GT↓AT/CGAC CATA/GC↑TG 有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如 DraⅢ 和 EarⅠ，它们的识别切割位点分别是 CAC↑NNN↓GTG 和 CTCTTC （1/4）。
5．同尾酶 许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的，且是对称的，即它们 可产生相同的粘性突出末端。这些酶统称为同尾酶。这些酶切割 DNA 得到 的产物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同的。通过表 4-3 很容 易判断哪些酶可产生相同的 DNA 末端。 · EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY · SpeⅠ A↓CTAGT NheⅠ G↓CTAGC XbaⅠ T↓CTAGA · BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC StyⅠ C↓CWWGG · ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （pUC19）
2.限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制 与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。 Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。Ⅱ 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近 切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 46bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或 简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。 Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似 的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ， 切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。 Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相 反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两 个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成， 分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。 在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的 一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme）， 如 N.Bst NBI 。
2．限制酶识别序列的结构 限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相 对称的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和切割位置如下： EcoRⅠ G↓AATTC；HindⅢ A↓AGCTT CTTAA↑G TTCGA↑A 有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。识别序列后面括号内的数字表示在 两条链上的切割位置。 AccBSⅠ CCG↓CTC；BssSⅠ C↓TCGTG GGC↑GAG GAGCA↑C 有一些限制酶可识别多种序列，如 AccⅠ 识别的序列是 GT↓MKAC ， 也就是说可识别 4 种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。 HindⅡ 识别的序列是 GTY↓RAC 。 有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱 基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它们的识别序列如下： AlwNⅠ CAGNNNC↓TG；DdeⅠ C↓TNAG GT↑CNNNGAC GANT↑C
定义和命名
DNA限制性内切酶： 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸 酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这 样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母 和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例 如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性 内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基 顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、 HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。
限制反应与甲基 化反应 限制作用是否需 用 ATP
限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度 限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基 （表2-2）。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完 全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点 （4^4=256，4^6=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割 位置。 4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ↓GATC 5 个碱基识别位点：EcoRⅡ ↓CCWGG；NciⅠ CC↓SGG 6 个碱基识别位点：EcoRⅠ G↓AATTC； HindⅢ A↓AGCTT 7 个碱基识别位点：BbvCⅠ CC↓TCAGC； PpuMⅠ RG↓GWCCY 8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC 以上序列中部 分字母代表的碱基如下。 R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T