大规模可溶性蛋白原核表达与纯化步骤
原核表达和蛋白纯化流程
原核表达和蛋白纯化流程As scientists, we often encounter the challenge of expressing and purifying proteins in prokaryotic cells. Often, the first step in this process is to select an appropriate expression system. 做为科学家，我们经常面临的挑战是在原核细胞中表达和纯化蛋白质。
在这个过程中，通常的第一步是选择一个合适的表达系统。
One commonly used expression system is E. coli, which offers the advantages of fast growth, inexpensive culture conditions, and well-established genetic manipulation techniques. 一个常用的表达系统是大肠杆菌，它具有快速生长、廉价的培养条件和良好的遗传操纵技术的优势。
After selecting an expression system, the next step is to design a suitable expression vector to insert the gene of interest. 在选择表达系统后，下一步是设计一个合适的表达载体来插入感兴趣的基因。
The choice of promoter, selection markers, and fusion tags are important considerations in the design of the expression vector. 表达载体的选择激活子、选择标记和融合标签都是在表达载体设计中的重要考虑因素。
Once the expression vector has been designed and constructed, it can be transformed into the host cells for protein expression. 在表达载体设计和构建完成后，就可以将其转化到宿主细胞中进行蛋白表达。
大规模可溶性蛋白原核表达与纯化步骤
大规模可溶性蛋白纯化实验操作Hao Lab in SII1. 取20 µL E.coli BL21目的菌种加入装有10 ml LB培养基的50 ml离心管中，加入氨苄青霉素(Biobasic inc, #AB0028) 至终浓度为100 µg/ml或硫酸卡那霉素(生工，#0408) 至终浓度为50 µg/ml，37°C, 250 rpm, 摇菌过夜。
2. 取过夜培养的菌液8 ml加入400 ml (1:50) 含有相同浓度抗生素的LB中培养，间断检测菌液OD600值，37°C, 250 rpm, 摇菌大约60~120 min，待其OD600值达到0.6~0.8之间，加入0.4 mM IPTG (碧云天，#ST098), 30°C, 220 rpm, 诱导表达3 h。
3. 收集菌液至50 ml离心管中，7,000 × g, 4°C离心3 min, 弃上清收集沉淀，进行下步实验或置于-80°C冰箱保存。
摇菌用的锥形瓶用84消毒液浸泡或高压灭菌。
4. 将收集到的菌体重悬于20 ml 冰冷的Lysis buffer中，震荡混匀。
以下步骤均置于冰上。
5. 向菌体重悬液加入甘油至终浓度为10%，加入EDTA 至终浓度为0.5 mM，充分混匀。
6. 冰上超声：功率为仪器最大功率的60%，脉冲时间为1 s，间隔时间为1 s，总时间7~15 min。
7. 超声后的蛋白溶液于8,000 × g，4°C离心30 min。
15,000 × g, 4°C离心15 min可省略步骤10。
8. 在步骤7离心的同时。
取下20 ml新层析柱(Qiagen, #34964)的帽子并剪掉底部尖端再盖上帽子，加入混匀的50% NI-NTA beads (Qiagen, #S13-26-36-46; GST beads, GE, #17-0756-01) 悬液2 ml。
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备方法参考一、蛋白的原核表达实验目的蛋白的原核质粒的构建。
适用范围蛋白原核表达。
实验原理参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》实验试剂病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒实验设备和材料DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞操作步骤（一）病毒RNA的提取（Trizol法）参照分子克隆的方法进行，（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。
（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。
（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。
（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。
（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。
（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。
（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。
（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。
（二）反转录反应体系（20 μL）：按下列顺序加样M-MLV Buffer 4 μL10M dNTPs 1 μLDEPC 水 3 μL随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL反转录酶 M-MLV 1 μL提取的 RNA 9.5 μL总体积20 μL反应条件：42℃水浴 1~1.5 h（三）引物设计与合成依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。
原核蛋白可溶性表达策略及方案
原核蛋白可溶性表达策略及实验方案可溶性表达策略大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。
这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。
因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。
有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。
降低重组蛋白合成的速率可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。
高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。
因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。
常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。
密码子优化密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。
密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。
经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。
值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。
启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。
在胞内表达中，常采用T7、PL等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的70%。
若重组蛋白多以包涵体形式存在，可采用强度较弱的lac等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。
原核蛋白可溶性表达策略及方案
原核蛋白可溶性表达策略及实验方案可溶性表达策略大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。
这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。
因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。
有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。
降低重组蛋白合成的速率可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。
高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。
因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。
常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。
密码子优化密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。
密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。
经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。
值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。
启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。
在胞内表达中，常采用T7、PL等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的70%。
若重组蛋白多以包涵体形式存在，可采用强度较弱的lac等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。
原核蛋白纯化步骤
摇菌：3-1（12/9）6-4小批量表达过程：取100μl菌液至20ml Amp+LB培养基，摇菌至OD（600nm）值到0.6，IPTG（1:1000稀释）诱导，取0h 2h 4h 6h 8h样品各1ml，离心（6000rpm，5min）加60μl 1×PBS悬浮沉淀。
蛋白大小检测：caspase 3 846bp，约33kd；caspase 6 912bp，约38kd加20μl 4×loading buffer（含2-ME）至60μl菌液中，煮沸10min。
配胶，根据蛋白大小，选12% SDS-PAGE胶，跑胶检测。
70V 30min，120V 60min。
大批量表达过程：1）取20μl菌液至1ml Amp+ LB培养基，十管，摇菌过夜；2）将菌液转移至装有200ml Amp+ LB培养基的锥形瓶中，摇菌2.5h，测OD（600nm），0.6左右较好；3）加IPTG（1:1000）诱导5h；4）转移至灭菌了的50ml离心管中，10000rpm，20min离心收集沉淀；5）加20ml 无菌PBS悬浮菌液，加溶菌酶（1:500）室温静置1h；6）破碎菌液，温度25℃，模式06（6mm）/02（2mm）总时间20min左右，超声开约2s，超声关约5s，功率35%~40%（小于400W）7）离心（10000rpm 30min），收集上清和沉淀，上清-20℃保存，加10ml 1×结合缓冲液充分混匀溶解沉淀，4℃过夜；8）将融有沉淀的结合缓冲液分装,12000min，30min离心收集沉淀，1×PBS溶解后和上清一起跑胶检测。
试剂配置：LB培养基Tryptone 10gYeast Extract 5gNacl 10g定容至1LIPTG2.4g 至10ml无菌水中，过0.22μl 滤膜溶菌酶1g 至10ml 无菌水中，过0.22μl 滤膜Amp5g 氨苄到50ml 无菌水中，过0.22μl 滤膜8×母液（200ml）NaCl 4mol/L 4×58.44×0.2=46.75Tris 160mM 160×121.14×0.2=3.876调pH 至7.9Wash Buffer（200ml）NaCl 0.5M 0.5×58.44×0.2=5.844Tris-HCl 20mM 0.02×121.14×0.2=0.488EDTA.2Na 100mM 0.1×372.24×0.2=7.4448Binding buffer（1L）1×母液+咪唑咪唑浓度梯度：5mM 20mM 40mM 60mM 100mM 250mM8×Charge buffer（40mL）400mM NiSO4.6H2O0.4×262.86×0.04=4.20576g8M尿素100mL加48g。
原核表达及纯化方法
原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。
37℃，过夜摇菌。
2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。
（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。
大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。
二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。
根据这个结果选择纯化方法。
（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。
（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。
三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。
4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。
（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。
原核蛋白表达与纯化
GE tac (Pharmacia) NEB tac
pMal
Amp
MBP· Tag
pET
Merck (Novagen) Transgen
T7 T7lac T7lac
Amp Kan Amp
His· Tag
pEASY
His· Tag
选择表达菌株
菌株
BL21 BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS
pGEX pET
Lane 2：30℃ Lane 3：25℃
促进包涵体形成
• 目的 高浓度，高纯度 毒基因表达
免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽）
• 手段 胞质表达 提升表达速率（诱导温度，IPTG浓度，etc） 特定的表达载体（pET-17xb，pET-31b(+)）
蛋白纯化障碍 • 表达——纯化是一个完整的、密切联系的过程，蛋 白纯化过程中，很多问题的根源来自上游表达 • 蛋白不结合，洗脱杂带多，包涵体不易溶解…… • 下篇详述
常用表达载体系统
系统名称 公司 pGEX 启动子 抗性 Amp 常用标签 GST· Tag 特点 可溶性表达，纯化难以控制，谷 胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯 度较低,通常需要去掉GST· Tag 可溶性表达，纯化难以控制，麦 芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度 较低,通常需要去掉MBP· Tag 种类丰富。标签小，无需切割， 一般来说，对蛋白活性无影响。 纯化及其方便。 同pET系统
GE tac (Pharmacia) NEB tac
pMal
Amp
MBP· Tag
pET
Merck (Novagen) Transgen
T7 T7lac T7lac
Amp Kan Amp
His· Tag
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
大规模可溶性蛋白纯化实验操作
Hao Lab in SII
1. 取20 µL E.coli BL21目的菌种加入装有10 ml LB培养基的50 ml离心管中，加入氨苄青霉素(Biobasic inc, #AB0028) 至终浓度为100 µg/ml或硫酸卡那霉素(生工，#0408) 至终浓度为50 µg/ml，37°C, 250 rpm, 摇菌过夜。
2. 取过夜培养的菌液8 ml加入400 ml (1:50) 含有相同浓度抗生素的LB中培养，间断检测菌液OD600值，37°C, 250 rpm, 摇菌大约60~120 min，待其OD600值达到0.6~0.8之间，加入0.4 mM IPTG (碧云天，#ST098), 30°C, 220 rpm, 诱导表达3 h。
3. 收集菌液至50 ml离心管中，7,000 × g, 4°C离心3 min, 弃上清收集沉淀，进行下步实验或置于-80°C冰箱保存。
摇菌用的锥形瓶用84消毒液浸泡或高压灭菌。
4. 将收集到的菌体重悬于20 ml 冰冷的Lysis buffer中，震荡混匀。
以下步骤均置于冰上。
5. 向菌体重悬液加入甘油至终浓度为10%，加入EDTA 至终浓度为0.5 mM，充分混匀。
6. 冰上超声：功率为仪器最大功率的60%，脉冲时间为1 s，间隔时间为1 s，总时间7~15 min。
7. 超声后的蛋白溶液于8,000 × g，4°C离心30 min。
15,000 × g, 4°C离心15 min可省略步骤10。
8. 在步骤7离心的同时。
取下20 ml新层析柱(Qiagen, #34964)的帽子并剪掉底部尖端再盖上帽子，加入混匀的50% NI-NTA beads (Qiagen, #S13-26-36-46; GST beads, GE, #17-0756-01) 悬液2 ml。
9. 取下层析柱的帽子使NI-NTA beads重悬液体流净再盖上帽子，加入PBS至总体积约20 ml，用5 ml 移液器轻柔吹打混匀(避免气泡产生)，静置5 min之后取下层析柱的帽子将液体放空并盖上帽子，重复二次。
10. 取步骤7，离心后的上清用0.45 µm滤器(Millipore, #SLGP033RS) 过滤，滤液置于50 ml离心管中。
11. 取适量蛋白溶液将NI-NTA beads重悬并转移到装有蛋白溶液的50 ml离心管中。
4°C摇荡过夜。
空的层析柱加入约10 ml PBS，4°C保存。
12. 将摇荡过夜的beads和蛋白混合液以50 × g, 4°C离心1 min使beads沉淀。
保留上清于4°C冰箱，可以考虑用旧的beads做二次结合。
13. 用10 ml PBS重悬beads, 50 × g, 4°C离心1 min, 弃上清，重复一次。
再以20 ml wash buffer 重悬，装入层析柱中，静置5 min, 取下层析柱的帽子，收集0.5 ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测，标记为20W-1，剩余液体流空再盖上帽子。
14. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子，流空液体，盖上帽子。
15. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子收集0.5ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测，标记为20W-3，剩余液体液体流空，盖上帽子。
16. 加入5 ml Elution buffer重悬NI-NTA beads，静置5 min，取下层析柱的帽子，收集液体，于15 ml新离心管中并留样品20 µl, 标记为E-1。
为盖上帽子。
用Nanodrop2000粗测蛋白浓度。
再以3 ml Elution buffer 重复三次上述步骤，收集至另一新15 ml离心管中。
17. 回收beads: 洗脱后的NI-NTA beads以20 ml PBS重悬，静置5 min，取下层析柱的帽子，流空液体，盖上帽子。
再以20 ml PBS重复两次上述步骤。
再用20 ml 0.5 M NaOH重复一次，加入约10 ml 30%乙醇置于4°C保存。
19. 将16步得到的蛋白溶液加入3 KDa的15 ml超滤管(Millpore, #UFC900396)中, 4,000 × g, 4°C离心45 min进行超滤。
倒掉超滤管底的废液，将约为15 ml PBS加入超滤管中，轻轻颠倒混匀，4,000 ×g, 4°C离心45 min，倒掉超滤管底的废液。
重复超滤四次，最后一次离心1 h。
如果16步第一次收集的蛋白溶液粗测浓度大于0.5 mg/ml，可以先超滤第一次洗脱得到的5ml蛋白溶液，其它的再用同一个超滤管进行第二次超滤。
纯化后的蛋白溶液留样20 µl标为EC，加入终浓度为40%的甘油，每管100 µl分装，-80°C保存。
SDS-PAGE检测各样品的蛋白浓度及纯度。
溶液配制：
0.5 M EDTA stock, pH8.0: 93.05 g Na2EDTA•2H2O 加入350 mL ddH2O。
10M NaOH调整pH 至8.0 with (约25 mL，缓慢加入)。
加ddH2O至500 ml。
高压灭菌，室温保存。
10 M NaOH: NaOH 16g，加ddH2O至40 ml, 0.22 µM滤器过滤除菌。
Wash buffer：20 mM imidazole/PBS
Elution buffer: 300 mM imidazole/PBS
甘油储存液：80%甘油/ PBS，高压灭菌。
Lysis buffer: 1% Triton-X100/PBS。
(Triton-X100储存液：20%用PBS配制)
1 M IPTG (异丙基硫代-β-D半乳糖苷): 在8ml ddH2O中溶解2.383g IPTG后，用ddH2O定容至10ml, 0.2
2 μm滤器过滤除菌，分装成1 ml -20°C避光保存。
3 M Imidazole (生工，#IB0529): 2.0
4 g 加入PBS至10 ml, 0.22 µM滤器过滤，4°C保存。