木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究木瓜蛋白酶（Papain）是一种广泛存在于木瓜中的天然酶，具有优异的蛋白水解能力和广泛的应用领域。
对于木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法的研究，可以为其在食品、药物和生物技术等领域的应用提供重要的理论和实践基础。
纯化木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
首先，通过将木瓜果肉或木瓜乳剂进行初步的提取和分离，得到粗木瓜酶液或浓缩液。
接下来，通过酸性、碱性或酶处理等方法，将杂质蛋白质去除，然后经过一系列的层析纯化步骤，最终获得纯度较高的木瓜蛋白酶。
其中，离子交换层析是最常用的纯化方法之一。
离子交换层析是根据蛋白质与固定在固定相上带电的离子交换基团之间的相互作用进行纯化的。
通常使用阳离子交换剂如DEAE-Sepharose CL-6B或阴离子交换剂如CM-Sepharose CL-6B作为固定相，可实现木瓜蛋白酶与其他蛋白质之间的分离。
通过控制缓冲液的pH和离子强度，可以调节木瓜蛋白酶在层析柱上的吸附和洗脱，从而实现对其的纯化。
凝胶过滤层析是另一种常见的纯化方法，其基本原理是根据蛋白质分子大小的差异进行纯化。
凝胶过滤层析对分子量较大且较纯的蛋白质具有较好的分离效果。
在纯化木瓜蛋白酶时，可以选择适当的凝胶过滤层析介质，如Sephadex G-75或Sephadex G-100等，将混合溶液在凝胶柱上进行层析，分离出目标蛋白质。
除了纯化方法的研究外，正确鉴定木瓜蛋白酶的纯度和活性也是非常重要的。
鉴定木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：SDS-PAGE电泳、活性测定和质谱鉴定等。
其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分子量分析方法，它可将蛋白质按照分子量大小进行分离和定量。
通过在分离凝胶上染色或通过Western blotting方法检测，可以确定木瓜蛋白酶的纯度和分子量。
活性测定是评价木瓜蛋白酶酶活性的重要手段。
常用的活性测定方法包括卟啉-酪蛋白分光光度法、酪蛋白分解能力法等。
木瓜蛋白酶
食品添加剂木瓜蛋白酶学院:食品与营养工程学院专业:食品加工班级:食工102学号:010*******姓名:王瑞真木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类疏基蛋白酶。
广泛存在与番木瓜的根、茎、叶和果实内，在未成熟的乳汁中含量最丰富。
它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特色，因此在食品、医药、饲料、皮革及纺织等行业得到广泛应用[1]。
一、木瓜蛋白的组分工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
由木瓜乳胶提取粗制酶,除含有木瓜蛋白酶外,还含有半耽氨酸蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、谷氨酞胺以及低相对分子质量的疏基化合物,还有葡萄糖酶等。
其中大部分都是疏基蛋白酶,主要的两种组分是木瓜凝乳酶和木瓜蛋白酶[2]。
二、木瓜蛋白的结构木瓜乳汁中四种已知半肤氨酸蛋白酶的一级结构具有高度同源性,其氨基酸数目和同源性比较如表1所示。
除chymopapain含有8个半肤氨酸外,其余三种酶都只含有7个半肤氨酸。
25位的流基是活性位点,不参与二硫键的形成（chymopapain的117位琉基也不参与二硫键的形成 ）,其余疏基以相同的方式形成三个二硫键，具有同样的保守性。
人们在不同清晰下得到了四种酶的X 一射线结构。
四种酶的肤链折叠方式相似,形成两个大小相、构型不同的区域。
一个是由a一螺旋构成的L一区,另一个是由大量反向平行的片层构成的R一区。
活性位点氨基酸残基Cys25,Asn179和His159 就位于这些区域的表面,其中Cys25位于 L一区,起始a一螺旋上。
木瓜蛋白酶家族的Cys25 ，Gly23，Gly65 形成的S。
亚部位是一个大口袋，对底物专一性影响较小；S亚部位由于酶不同其氨基酸组成不同,几何形状亦不同,对酶的性质影响较大[3]。
三、木瓜蛋白酶的提取工艺1.过去的常规提取方法木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法13生物技术第二大组第二小组组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景：在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。
二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。
木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。
木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。
至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。
它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。
木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。
木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。
木瓜蛋白酶实验指导
实验一木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。
二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。
木瓜蛋白酶最适pH随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适pH为7。
据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在pH7.2的磷酸缓冲液、35℃条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在275nm处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。
考马斯亮蓝G-250在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm 处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。
2、试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）；1%的酪蛋白溶液：称1g的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配至100mL；激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称10g的TCA定容至100 mL；考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100mL，用蒸馏水定容到1000mL。
3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。
四、实验步骤1．木瓜乳的采集选取挂果30天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约3mm的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。
木瓜汁中提取木瓜蛋白酶--实验设计
木瓜汁中提取木瓜蛋白酶一、粗酶制备（冻存、调整浓度）1.蛋白质浓度（考xx蓝法）二、纯化和固定化1.双水相（PEG/磷酸盐）萃取，再过阳离子纯化；2.粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化（咪唑梯度洗，电泳看效果）；3.先双水相，取PEG相（上清）用亲和磁珠纯化和固定化；三、纯度1.快速蛋白质液相色谱；2.非变性碱性蛋白质电泳；四、酶活性1.水解酪蛋白活性（固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重复使用）；2.水解IgG检测特异性；五、载体/相表征亲和磁珠：TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外；双水相：一、xx木瓜制备粗酶[1,2]1.新鲜的木瓜用去离子水洗干净，再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵向2-3mm深的切口，让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。
-20 ℃存放。
（或者10mL汁液加90mL pH 6.0的PBS，搅拌15min，4℃9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。
）2.将解冻后的乳胶与40mM半胱氨酸按3:1(w/v)的比例混合，用6MHCl将悬浮液调整为pH 5.6，在4 ℃搅拌15 min，过滤并用6 M NaOH将滤液pH调整为9.0，4 ℃ 9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定上清中的蛋白质含量，然后用水/PBS调节。
可省略。
3.[1]NitsawangS,Hatti-KaulR,KanasawudP.PurificationofpapainfromCaricapapayalatex:Aqueoustwo-phaseextractionversustwo-stepsaltprecipitation[J].Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioningprocess to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.。
木瓜蛋白酶活性实验报告
一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。
2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。
3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。
二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。
木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。
本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。
三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。
（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。
木瓜蛋白酶提取
0.615
500
15.35 7675.0 27.50
211.1
硫酸铵一次纯 化上清
+
乙 4'
0.292 500
7.09 3545.0 10.00
35.5
硫酸铵二次纯 化沉淀
醇 9'
0.228 500
5.46 2730.0 10.00 27.3 乙醇沉淀
编号
稀释倍 待测管吸
数
光度
1
10000. 0
1.348
18.28 9140.0 12.50
4.06 2030.0 10.00
络氨酸标 准液
酶活(u)
蛋白质 （酶） 含量(mg)
68911.9 169.1
95.6 114.3 20.3
乙醇沉淀
硫酸铵一次 纯化上清
硫酸铵二次 纯化沉淀
酶比活 (u/mg)
乙醇+硫酸铵
410.0
粗提
5’ 5000 0.284 0.201
35.5
1090.0
硫酸铵二次 纯化沉淀
9’ 5560.0 0.479 0.308
62,850. 1 27.3 2300.0 乙醇沉淀
9’’ 5560.0 0.433 0.314
70,314.0 27.3 2570.0 透析
乙 编号 醇1
吸光度值
稀释倍数
标准曲线查 得值浓度 （ug/ml)
测得蛋白质 浓度(ug/ml)
在 275nm 处侧吸 光值
吸光 度 A
A0
取酪氨酸溶液，以蒸馏水为空白，测定吸光度
An
硫 编号 酸1 铵2
吸光度值
0.676
稀释倍数
标准曲线查 得值浓度 （ug/ml)
木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法
木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法木瓜蛋白酶（papain）是一种天然的蛋白酶，广泛应用于食品、制药等行业中。
其提取与分离纯化的方法可以分为以下几个步骤：1.选择合适的木瓜品种：不同品种的木瓜蛋白酶活性不同，因此选择具有较高酶活性的木瓜品种对提取纯化效果至关重要。
2.酶源准备：将选好的木瓜切成小块，去掉果肉，保留果实中的细胞浆和硬实质。
然后将木瓜块浸泡于缓冲液中，以提取木瓜蛋白酶。
3.离心分离：将浸泡木瓜块的混合液进行离心分离，以去除果肉等杂质，得到较为纯净的木瓜蛋白酶液。
4.澄清液处理：将离心分离得到的液体通过滤纸或滤膜进行澄清，去除悬浮的固体颗粒。
5.蛋白酶的分离：通过离心、超滤、透析等手段，将木瓜蛋白酶与其他蛋白质分离，得到较为纯净的蛋白酶液。
6.结晶纯化：可以采用醇沉淀、浓缩、结晶等方法对蛋白酶进行纯化。
其中，醇沉淀方法是常用的分离纯化方法之一，通过醇的添加，使蛋白酶蛋白质聚集并沉淀下来，然后进行洗涤、溶解等操作，最终得到纯净的木瓜蛋白酶。
7.洗脱：将获得的木瓜蛋白酶溶解于缓冲液中，使其达到所需的适宜酶活性和稳定性。
8.酶活性测定：用适当的方法测定提取分离纯化后的木瓜蛋白酶的活性，以确定其纯化程度和活性。
需要注意的是，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化过程中，应注意保持温度、pH值等参数的控制，以防止酶的失活或蛋白质的降解。
同时，在纯化过程中需要使用无菌操作，以防止细菌、病毒等污染物的引入。
总结起来，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法包括酶源准备、离心分离、澄清液处理、蛋白酶的分离、结晶纯化、洗脱和酶活性测定等步骤。
通过合理的步骤设置和操作，可以得到较为纯净、高活性的木瓜蛋白酶，以满足工业和科研的需求。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
木瓜蛋白酶的分离纯化
一、目的
（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。
（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。
二、原理
木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。
它也具有脂酶活力。
其分子量约为 23000 左右。
在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟生成1umol酪氨酸的酶量为 1 单位。
木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。
酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。
吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。
三、实验材料
番木瓜汁；PEG (聚乙二醇，分子量为6000)； (NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考马斯亮蓝
四、仪器设备
（ 1 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式）
（ 2 ） 752 紫外分光光度计
（ 3 ）水浴箱
（ 4 ）冰箱
（ 5 ）榨汁机
五、玻璃器皿（以组为单位）
试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器
5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3-6 ）等
六、实验试剂配制及实验步骤
（一）酪氨酸的标准曲线
将上述各管混匀，静置2min, 测定各管的A 275nm，做标准曲线，曲线如下：
（二）粗酶活测定
1 试剂
（ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制）
（ 2 ）0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2
（ 3 ）用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸
（ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制（ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液
2 方法
量取酶液0.2 mL，加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8 min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1 mL加入此管，在37℃水浴中反应10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL摇匀，静置5 min；另取样液（已激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL，37℃保温10 min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1 mL，静置5 min，测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。
（三）纯化
固定体系总质量为20.5 g，在PEG（分子量6 000）质量分数为22.0%，(NH4)2SO4质量分数为14.6%，pH值为5.0，粗酶添加量为7.5%所组成的双水相体系下，室温下静置分相后，读取上、下相体积，计算相体积比R，分别测定上、下相的酶活力
（四）计算与结果
R = 9/17 = 0.529
粗酶活 = （0.103– 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.03 = 156.16
上相酶活 = （0.32 – 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.02 = 804.7
下相酶活 = （0.02 – 0.0139）/10.496/181.2 * 100000 / 0.012 =
26.7
酶分配系数 = 上相酶活/下相酶活 = 804.7 / 26.7 = 30.14。