木瓜蛋白酶提取实验记录
酶学实验
实验一、木瓜蛋白酶活性测定实验(明胶法)(一)实验原理木瓜蛋白酶从明胶中分解出氨基酸和肽，其氨基型氮可用甲醛复分解，产生氢离子，浓度可用氢氧化钠溶液滴定。
(二)定义一个木瓜蛋白酶单位相当于在规定条件下分解1ug分子量的肽键时所需的酶量。
(三)试剂1. 底物明胶2. 柠檬酸盐缓冲液(pH5.0) 取70.000g一水柠檬酸溶于720mL 1mol/L氢氧化钠溶液中。
用1mol/L氢氧化钠溶液将pH调至5.0，用蒸馏水定容至1000mL。
3. 37%甲醛溶液4. 酚酞溶液取0.5g酚酞溶于95%的乙醇中，并定容至50mL。
5. 0.1mol/L氢氧化钠溶液取4.0克氢氧化钠置于洁净干燥的烧杯中，加纯水稀释、搅拌溶解，将溶液移入1000ml洁净容量瓶中定容至刻度。
6. 酶溶液用蒸馏水溶解酶，每毫升配制溶液应含有40U左右。
酶的称量一定得按以下原则确定：用于主值和空白值试验的耗量之差应在1.8～2.2mL这一范围内。
此外需用一个合适的称量重复测定几次。
(四)操作步骤称取500mg明胶放入一只100mL锥形烧瓶内，加8mL蒸馏水，加热后明胶溶解。
待明胶完全溶解加2.0mL柠檬酸盐缓冲液，置于水浴中冷却至40℃。
加5.00mL已预热至40℃的酶溶液，于40℃下保温60min，加10.0mL甲醛溶液终止反应。
加0.5mL酚酞溶液后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，直至第一次出现明显的粉红色为终点。
用同样方法测定空白值，只是这里在添加酶溶液之前先添加甲醛溶液。
在空白值测定方面耗去大约5mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液。
(五)计算用以下公式计算酶活性：酶活力(U/mg)=(H-B)/E W×100式中：H-用于主值的滴定耗量(mL)；B-用于空白值的滴定耗量(mL)；100-相当于1mL0.1mol/L氢氧化钠溶液；E W-每5.0mL所用酶液中含有酶的重量(mg)。
举例：测定一个木瓜蛋白酶样品。
从样品中称取68.2mg，定容100mL。
双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究
关键词：木瓜蛋白酶；双水相萃取；酶活收率
中图分类号：TQ925.+2
文献标志码：A
doi：10.3969/jissn.1671- 9646(X).2010.10.020
Purification of Papain by Aqueous Two- phase Extraction
Cao Duixi, Du Zheng, Han Yuting, Yu Liping, Liu Kunxun, Chen Yuying, *Duan Shan (College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642, China) Abstract: Papain is extracted by aqueous two phase system consisting of polyethylene glycol (PEG)/ ammonium sulfate (NH4)2SO4). By comparing with the activity of crude papain, it is found that the composition of the system has little effect on the protease activity, the PEG/(NH4)2SO4 system is established for the extraction of papain. The influences of PEG molecular weight, PEG concentration, (NH4)2SO4 concentration, pH value and the dosage of crude papain on the extraction are further investigated. The results show that with the aqueous two phase system consisting of 22.0% PEG6 000, 14.6% (NH4)2SO4, at pH 5.0 and 7.5% crude papain is added, 89.30% protease activity is recovered with 2.02 fold purification and the specific activity is 3 639 U/ mL. Key words: papain; aqueous two- phase extraction; recovery of protease activity
木瓜汁中提取木瓜蛋白酶--实验设计
木瓜汁中提取木瓜蛋白酶一、粗酶制备（冻存、调整浓度）1.蛋白质浓度（考xx蓝法）二、纯化和固定化1.双水相（PEG/磷酸盐）萃取，再过阳离子纯化；2.粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化（咪唑梯度洗，电泳看效果）；3.先双水相，取PEG相（上清）用亲和磁珠纯化和固定化；三、纯度1.快速蛋白质液相色谱；2.非变性碱性蛋白质电泳；四、酶活性1.水解酪蛋白活性（固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重复使用）；2.水解IgG检测特异性；五、载体/相表征亲和磁珠：TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外；双水相：一、xx木瓜制备粗酶[1,2]1.新鲜的木瓜用去离子水洗干净，再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵向2-3mm深的切口，让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。
-20 ℃存放。
（或者10mL汁液加90mL pH 6.0的PBS，搅拌15min，4℃9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。
）2.将解冻后的乳胶与40mM半胱氨酸按3:1(w/v)的比例混合，用6MHCl将悬浮液调整为pH 5.6，在4 ℃搅拌15 min，过滤并用6 M NaOH将滤液pH调整为9.0，4 ℃ 9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定上清中的蛋白质含量，然后用水/PBS调节。
可省略。
3.[1]NitsawangS,Hatti-KaulR,KanasawudP.PurificationofpapainfromCaricapapayalatex:Aqueoustwo-phaseextractionversustwo-stepsaltprecipitation[J].Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioningprocess to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.。
木瓜蛋白酶活性实验报告
一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。
2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。
3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。
二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。
木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。
本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。
三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。
（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。
木瓜蛋白酶提取
0.615
500
15.35 7675.0 27.50
211.1
硫酸铵一次纯 化上清
+
乙 4'
0.292 500
7.09 3545.0 10.00
35.5
硫酸铵二次纯 化沉淀
醇 9'
0.228 500
5.46 2730.0 10.00 27.3 乙醇沉淀
编号
稀释倍 待测管吸
数
光度
1
10000. 0
1.348
18.28 9140.0 12.50
4.06 2030.0 10.00
络氨酸标 准液
酶活(u)
蛋白质 （酶） 含量(mg)
68911.9 169.1
95.6 114.3 20.3
乙醇沉淀
硫酸铵一次 纯化上清
硫酸铵二次 纯化沉淀
酶比活 (u/mg)
乙醇+硫酸铵
410.0
粗提
5’ 5000 0.284 0.201
35.5
1090.0
硫酸铵二次 纯化沉淀
9’ 5560.0 0.479 0.308
62,850. 1 27.3 2300.0 乙醇沉淀
9’’ 5560.0 0.433 0.314
70,314.0 27.3 2570.0 透析
乙 编号 醇1
吸光度值
稀释倍数
标准曲线查 得值浓度 （ug/ml)
测得蛋白质 浓度(ug/ml)
在 275nm 处侧吸 光值
吸光 度 A
A0
取酪氨酸溶液，以蒸馏水为空白，测定吸光度
An
硫 编号 酸1 铵2
吸光度值
0.676
稀释倍数
标准曲线查 得值浓度 （ug/ml)
木瓜蛋白酶在肉类中的嫩化作用实验
木瓜蛋白酶在肉类中的嫩化作用实验摘要：我们以腊牛肉为例，通过使用木瓜蛋白酶，复合磷酸盐和腌制时间对腊牛肉嫩化效果的影响，结果表明：用0.02％木瓜蛋白酶、0.4％复合磷酸盐、经过72h腌制后，嫩化效果最佳。
木瓜蛋白酶是一种从未成熟的木瓜果实中提取的一种蛋白质分解酶，是一种天然的食品酶制剂。
由212个氨基酸残基组成单链蛋白质，分子量为23 406 D．在一定的酸性、中性、碱性范围内均具有活性。
木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白的酶，它之所以能对肉类进行嫩化，是因为它能将肉中的结缔组织及肌纤维中结构较复杂的胶原蛋白、弹性蛋白进行适当降解，使得它们结构中的一些连接键发生断裂，在一定程度上破坏了它的结构，从而大大提高了肉的嫩度。
同时可使肉的风味得到改善，并且安全、卫生、无毒，不产生任何不良风味。
木瓜蛋白酶对于胶原纤维蛋白在40～ 70℃温度范围内有最强的活力，由于脱水干燥时温度在50℃左右能较大程度地利用木瓜蛋白酶降低肉硬度的性质。
嫩化原理：嫩度是指肉在切割时，对破裂的抵抗力。
肉质的老韧主要由肉类中结缔组织的致密度大小、含水量的多少、弹性纤维的多少所决定。
材料和方法牛肉从市场上选购肉质新鲜黄牛肉，剔除筋腱、肥膘。
调味料碘盐、白糖、花椒粉、五香粉等。
食品添加剂硝酸钠、多聚磷酸钠、焦磷酸钠、磷酸二氢钠等均为食品级或分析纯。
木瓜蛋白酶活力为4O万活力单位/克。
设备及用具嫩度计、天平、台称、包装袋、容器、调温烘箱、锅、刀具等。
实验设计采用L4(23)进行正交试验，以木瓜蛋白酶、复合磷酸盐、腌制时间作为影响因素，探讨这3种因素对腊牛肉嫩度的影响。
配方设计采用三因素两水平的正交试验设计表。
工艺流程。
牛肉一清洗一整理一配料一腌制一烘烤一检验一成品实验人员南宁东恒华道技术员小李工艺要点1、整理将牛肉洗净后，剃除筋腱、筋膜、肥膘，为了方便测定嫩度时取样，按直丝分割成0.5 kg 左右的肉块，尽量做到整齐、大小一致。
木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告
木瓜蛋白酶的分离纯化一、目的（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。
（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。
二、原理木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。
它也具有脂酶活力。
其分子量约为 23000 左右。
在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟生成1umol酪氨酸的酶量为 1 单位。
木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。
酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。
吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。
三、实验材料番木瓜汁；PEG (聚乙二醇，分子量为6000)； (NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考马斯亮蓝四、仪器设备（ 1 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式）（ 2 ） 752 紫外分光光度计（ 3 ）水浴箱（ 4 ）冰箱（ 5 ）榨汁机五、玻璃器皿（以组为单位）试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3-6 ）等六、实验试剂配制及实验步骤（一）酪氨酸的标准曲线将上述各管混匀，静置2min, 测定各管的A 275nm，做标准曲线，曲线如下：（二）粗酶活测定1 试剂（ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制）（ 2 ）0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2（ 3 ）用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸（ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制（ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液2 方法量取酶液0.2 mL，加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8 min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1 mL加入此管，在37℃水浴中反应10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL摇匀，静置5 min；另取样液（已激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL，37℃保温10 min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1 mL，静置5 min，测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。
采用木瓜蛋白酶提取柠檬皮果胶
NaOH 溶液滴定，至粉红色（ 不褪色） 为终点，记录下
0. 1 mol / L NaOH 的体积 V1 。加入 20 mL 0. 5 mol / L NaOH，加上瓶塞，用力振摇（ 2 min） 后静置 15 min，加
果胶作为水溶性膳食纤维本身就有降低血糖血 脂，促进维生素的吸收，防止铅中毒，防治动脉硬化等 医疗 保 健 作 用，被 广 泛 应 用 于 食 品、化 妆、医 药 等 工 业［1 －6］。据不完全统计，近年我国果胶的年消耗 4 000 t 以上，并以每年 4% ～ 5% 的速度增长，约 80% 依靠进 口，其中柠檬果胶约 2 000 t 完全依靠进口［7］。因此， 大力开展果胶，特别是柠檬果胶的研究与开发，生产出 优质果胶，满足国内外市场需求已显得极为迫切。
醇冲洗滤干，在 105 ℃ 干燥 2 h，冷却称重（ m2 ） 。 分别准确称取 m2 的一半样品，各移入一个 250
mL 的具塞锥形瓶中，用 2 mL 无水 乙 醇 润 湿，加 入
100 mL 新煮沸并冷却的水，盖上瓶塞，不时转动至样
品完 全 溶 解，加 入 5 滴 酚 酞 指 示 剂，用 0. 1 mol / L
2014 年第 40 卷第 3 期（ 总第 315 期） 227
食品与发酵工业 FOOD AND FEＲMENTATION INDUSTＲIES
表 1 正交试验因素与水平 Table 1 Factors and levels in orthogonal design
A
B
（ 酶量） / mL （ 温度） / ℃
× 100
1. 5 产品分析
果胶产品分析根据国家标准 GB 25533 － 2010《食
品添加剂果胶》中方法进行。即精确称取果胶成品 1 g
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木瓜蛋白酶实验记录2016.11.3实验前准备：所需试剂的配制：饱和硫酸铵：取150ml蒸馏水，放入冰桶中，不断加入硫酸铵固体，直至沉淀不能溶解，过滤取滤液，保存在4℃冰箱中。
酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH 至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。
预实验：确定实验的可行性酶液提取：①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集5ml乳汁加入95ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液。
⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
对静置的酶液继续处理2016．11.4试剂配制考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。
静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。
重提木瓜蛋白酶实验设置对照一组开始即加入酶保护剂编号酶B*、一组加硫酸铵之前才加酶保编号酶*。
①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液（编号为酶液1）。
⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入适量酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
对静置处理后酶液继续处理2016.11． 5试剂配制标准蛋白质溶液（0.1mg/mL）:准确称取牛血清蛋白0.01g用蒸馏水溶解并稀释到100mL。
现配现用。
酪蛋白溶液：称取酪蛋白1.2g加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液160mL（取2.866g磷酸氢二钠固体加160mL蒸馏水即得溶液），置沸水浴中煮30min，时时搅拌，冷却至室温。
加1M盐酸调节PH至7.0 0.1 。
加蒸馏水稀释到200mL。
用前配置。
酶稀释液：A液称取半胱氨酸2.635g，氯化钠11.7g，加蒸馏水250mL 溶解；B液称取乙二胺四乙酸二钠1.115g，加蒸馏水100mL溶解；合并A、B液，搅拌均匀，用4.0mol/L氢氧化钠溶液调节PH值到5.5，加蒸馏水稀释至500mL 。
用前配置。
三氯乙酸溶液：取三氯乙酸3.6g，加乙酸钠5.98g和冰乙酸3.8mL，加水溶解并稀释至200mL。
酶活性的测量酪氨酸标准液和酶液处理酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100mL。
（此为50ug/ml的标准液）酶液的处理：取0.3ml酶液，加酶稀释液2.7ml，稀释至3mL。
操作待测液：准确量取酶液溶液各1.0mL，分别置于2支10mL 带塞试管中，于50度水浴预热5分钟，准确加入50度预热的酪蛋白溶液5mL，立即振摇，置50度水浴中，精确反应10min后，加三氯乙酸溶液5.0mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A。
②空白对照液：再精确量取酶液1.0mL，置于10mL具塞试管中，于50度水浴预热5min，准确加入50度预热的蒸馏水5ml, 置50度水浴中，加入三氯乙酸溶液5mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A0。
③酪氨酸标准液：另取酪氨酸对照溶液，以蒸馏水为空白，在275nm的波长处测定吸光度An。
分别测量酶液的酶活力由于吸光度大于1,对测定结果影响较大故结果不能使用2016.11.9重提木瓜蛋白酶①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集10ml乳汁加入100ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取3ml酶原液（编号为酶液1）。
⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
40%饱和硫酸铵提取45%饱和硫酸铵提取2016.11.10试剂配制500ml的2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取10g 的碳酸氢钠和0.1871g的EDTA溶于500ml蒸馏水中，调节PH至8.0。
500ml的1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取0.1871g的EDTA溶于500ml 蒸馏水中，调节PH至8.0。
对过夜的酶液继续处理40%饱和硫酸铵提取45%饱和硫酸铵提取8000-14000标号的透析袋处理：①取透析袋剪成适当长度的小段。
放入大体积的2%(m/v)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。
②用蒸馏水彻底漂洗透析袋。
放在1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。
③冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。
从此时起取用透析袋是必须戴手套，在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
④系好透析袋的一端，从另一端注入酶液，将透析袋放入蒸馏水中，在摇床上震荡，时时换蒸馏水。
⑤直至向蒸馏水中加入氯化钡溶液，无沉淀产生及透析除盐完成。
取出蛋白质溶液。
2016.11.11酶活性的测量酪氨酸标准液和酶液处理酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100mL。
（此为50ug/ml的标准液）酶液的处理：取0.1ml酶液，加酶稀释液0.9ml，稀释至1mL。
操作酶活力单位（U）定义：在以上条件下,每分钟水解酪蛋白生成1μｇ酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位（U）。
公式：酶活力（U）=x W1x11x n÷10式中:Ｗ1—酪氨酸标准液的浓度(μｇ/ml);10—反应时间;11—测定总体积;n—待测液的稀释倍数;分别测量各样品酶液的酶活力，结果如下：加标准1、酶质量的测量：考马斯亮蓝G-250法测蛋白含量取8支15 mL试管，按下表加入试剂将试管摇匀，放置2-3分钟。
用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
(注意应在1小时内完成比色)，以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测得的数据如下表用倍比稀释的方法找出酶液测吸光度的最适倍数，再从新取样测量，取1ml酶液于试管中，再加4ml考马斯亮蓝溶液，混匀，静置5min后在A595下测吸光度，再根据标准曲线算质量。
SDS-PAGE电泳试剂配制：30%丙烯酰胺(Acr)：称Acr29.0g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)1.0g，加蒸馏水至100mL，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。
10%十二烷基磺酸钠(SDS): 称取SDS固体10g加蒸馏水溶解定容至100mL。
1.5mol/L pH8.9 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50mL水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100mL。
分离胶缓冲液，含0.4%SDS。
1mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液（浓缩胶缓冲液）：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100mL。
1×SDS电极缓冲液（0.1%SDS-0.025mol/LTris- 0.192mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至2000mL。
10%过硫酸铵(AP):称取0.5gAP加蒸馏水溶解定容至5mL。
TEMED（四甲基乙二胺）。
固定液：取50%乙醇454mL，冰乙酸46mL混匀。
考马斯亮蓝R250（SDS-PAGE专用）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250mL，过滤后备用。
脱色液：冰乙酸75mL，乙醇50mL，加蒸馏水定容至1000ml。
（一）SDS-PAGE电泳具体实验步骤1.实验前准备对蛋白质溶液进行取样，部分溶液进行浓缩，使其蛋白质含量提高，条带更加明显配制所需试剂；清洗玻璃胶板、梳子，要使与胶接触的一面玻璃板没有残余的胶并用蒸馏水多次冲洗风干不能有颗粒杂质；查阅相关资料对所用胶的浓度进行分析，已知木瓜蛋白酶的分子量为21KD-23KD，故可以选择12%的分离胶，选择分子量在14.3KD-97.2KD的蛋白质Marker做定性分析，实验室有5×上样缓冲液。
2.制胶将玻璃板在灌胶支架上固定好，配制一定浓度的分离胶、浓缩胶，配方见下表。
制好分离胶后，在15min内将胶沿一侧注入胶板中，避免产生气泡，加至高度到玻璃板的2/3处，加好后加入一定量的蒸馏水防止与空气过多接触，待分离胶凝固后（约40min）用滤纸将上层水分吸干再加入配制好的浓缩胶，将浓缩胶加满距玻璃板边缘5mm 处立即插入梳子（1.0mm 10孔），放置约30min使胶充分聚合老化。
3.样品处理经预实验得每孔点样量在20µl所得条带较好。
取已经浓缩的酶液15µl于1.5EP管，加5µl上样缓冲液，至沸水中煮沸10min，冷却后可点样。
4.点样、电泳将凝胶板固定在电泳槽上，倒入电泳缓冲液，使缓冲液没过点样孔，将梳子平衡地拔出，开始点样。
之后开始电泳，盖上电泳槽的盖子，电极对应准确，开始用80V恒压电泳，当样品进入分离胶界面后改用120V继续电泳，至可见的蓝色染液条带已接近胶板底部约1-2cm 处停止电泳，总用时约1.5h。
5.染色和脱色关闭电源，将胶板取出放在盛有水的平盘中，用平口镊子将两块玻璃板撬开，在胶板凹槽处用镊子划破将胶剥离下来，放在染色液中染色30min左右，再放入脱色液中脱色(不断换脱色液)至可以清楚的看到条带为止。