木瓜蛋白酶提取实验方案
超滤法提取,PA修饰木瓜蛋白酶
番木瓜
木瓜蛋白酶理化特性
木瓜蛋白酶简称木瓜酶，是一种含巯基(SH)肽链内切酶，含11个Lys残基 溶于水和甘油，几乎不溶于乙醇、氯仿和 乙醚等有机溶剂 分子量为23400，最适合pH值6～7(一般 3～9.5皆可)，等电点pI为8.75，最适温度 55～65℃(一般10～85℃皆可) 由212个氨基酸残基组成。催化活性位点有 Cys-25、His-159、Asn-175
① 将20mL 5 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液与 10ml 0.020 mol/ L的PA溶液混合，4 ℃下 磁力搅拌反应1 h ② 反应结束后，将上述溶液转入预先处理好 的透析袋中，4 ℃下在pH 7. 0、0. 025 mol/ L磷酸盐缓冲液中透析48 h，多次更 换透析液以除掉多余的修饰剂，得到木瓜 蛋白酶修饰酶
此可以采用pa来对木瓜蛋白酶进行化学修mgml的木瓜蛋白酶溶液与10ml0020moll的pa溶液混合4反应结束后将上述溶液转入预先处理好的透析袋中4下在ph025moll磷酸盐缓冲液中透析48h多次更换透析液以除掉多余的修饰剂得到木瓜蛋白酶修饰酶平均氨基修饰度测定氨基修饰率1氨基残留率enh2h2so4三硝基苯磺酸酶三硝基苯磺酸衍生物43亲和力酶修饰后的变化最适温度最适ph708520酶活力
酶的提取
1. 预处理：新鲜青番木瓜，取皮切碎，加 30%冰水捣碎，过滤掉不溶物，得滤液 2. 取滤液在4℃ 3500rpm 离心15min，得上 清 3. 加入酶活保护剂L-cys 0.04mol/L、EDTA 0.002mol/L，混合均匀 4. 用0.1mol/L HcL或0.1mol/L NaOH调pH至 7.0，静置 3h
平均氨基ห้องสมุดไป่ตู้饰度测定
木瓜蛋白酶的检测
2、以BAEE为底物测木瓜蛋白酶的活性
BAEE( 苯甲酰一L－精氨酸乙酯）被木瓜蛋白酶 催化水解成苯甲酰一L精氨酸(BA) 和乙醇 ， 可以利用 BA和BAEE在253nm 处光吸收值的不同，用光学法测 定酶活性。 BAEE法底物纯度高，准确性高，重复性 好，操作简便， 最省工省时，连续测定时，一个样品 在10min之内即可完成，但仪器设备昂贵， 成本偏高： 该测定方法尤其适合精酶制品的活性检测及酶动力学 性质的研究， 也常用于商品木瓜蛋白酶制品的活性测 定。
紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力 冯健雯
工业生产中木瓜蛋 白酶 的活性检测方法比较 方 焕 生吉萍 吴显荣
十二烷基苯磺酸钠共振散射光谱法测定木瓜蛋白酶活力 黄国霞 蒋治 良 梁爱徐红娣
云南峨山番木瓜中木瓜蛋白酶的初步纯化及活性测定 黄兴奇等
4、实验室木瓜蛋白酶活力测定
(1)样品处理：精确称取0.05g的木瓜蛋白酶干粉于研钵中，加入少量石英砂 和几滴酶稀释液研磨15min,将酶液用蒸馏水少量多次洗入500ml容量瓶 (不 要将石英砂带入)，定溶，摇匀。取样液5ml,加入酶溶解液10ml，混匀盖严， 将酶激活15min以上(激活时半胱氨酸的浓度要高于0.03mol/L，而且要当天 配制，激活的酶最好在2h内测完)备用。
乙醇溶液对木瓜蛋白酶催化活性的影响 何 平 詹福建 丘泰球
初志战 黄卓烈 巫光宏
木瓜蛋白酶的生产工艺研 谭爱娟 王利民
一、木瓜蛋白酶的简介：
木瓜蛋白酶是从南方果王——番木瓜中提取的乳汁，经科 学加工而制成的食品添加剂。木瓜蛋白酶具有很高的蛋白分解 活性，已广泛用于啤酒酿造、肉类加工、动植物蛋白水解制品、 饼干果酱 、果汁加工和果酒的生产上。特别是在啤酒工业上， 木瓜蛋白酶可作为澄清剂 ，将啤酒中游离的蛋白质分解为易溶 于水的短肽 、氨基酸 ，既丰富了营养成分，又防止啤酒在贮 运过程中产生浑浊与沉淀，延长了啤酒的保存期；另外，在麦 芽糖化阶段加入木瓜蛋白酶，可弥补麦芽中蛋酶 活力不足的缺 陷，提高氨基氮的浓度，保证发酵的正常进行，确保产品具有 良好风味；在肉制品加工方面，木瓜蛋白酶可作为肉类的嫩化 剂(如嫩肉粉 )、分解剂(能够将固体肉完全水解为容易消化吸 收的肉汁，例如鸡精、兔精制造等)等 。
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究
木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法研究木瓜蛋白酶（Papain）是一种广泛存在于木瓜中的天然酶，具有优异的蛋白水解能力和广泛的应用领域。
对于木瓜蛋白酶的纯化和鉴定方法的研究，可以为其在食品、药物和生物技术等领域的应用提供重要的理论和实践基础。
纯化木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
首先，通过将木瓜果肉或木瓜乳剂进行初步的提取和分离，得到粗木瓜酶液或浓缩液。
接下来，通过酸性、碱性或酶处理等方法，将杂质蛋白质去除，然后经过一系列的层析纯化步骤，最终获得纯度较高的木瓜蛋白酶。
其中，离子交换层析是最常用的纯化方法之一。
离子交换层析是根据蛋白质与固定在固定相上带电的离子交换基团之间的相互作用进行纯化的。
通常使用阳离子交换剂如DEAE-Sepharose CL-6B或阴离子交换剂如CM-Sepharose CL-6B作为固定相，可实现木瓜蛋白酶与其他蛋白质之间的分离。
通过控制缓冲液的pH和离子强度，可以调节木瓜蛋白酶在层析柱上的吸附和洗脱，从而实现对其的纯化。
凝胶过滤层析是另一种常见的纯化方法，其基本原理是根据蛋白质分子大小的差异进行纯化。
凝胶过滤层析对分子量较大且较纯的蛋白质具有较好的分离效果。
在纯化木瓜蛋白酶时，可以选择适当的凝胶过滤层析介质，如Sephadex G-75或Sephadex G-100等，将混合溶液在凝胶柱上进行层析，分离出目标蛋白质。
除了纯化方法的研究外，正确鉴定木瓜蛋白酶的纯度和活性也是非常重要的。
鉴定木瓜蛋白酶的常用方法主要包括：SDS-PAGE电泳、活性测定和质谱鉴定等。
其中，SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分子量分析方法，它可将蛋白质按照分子量大小进行分离和定量。
通过在分离凝胶上染色或通过Western blotting方法检测，可以确定木瓜蛋白酶的纯度和分子量。
活性测定是评价木瓜蛋白酶酶活性的重要手段。
常用的活性测定方法包括卟啉-酪蛋白分光光度法、酪蛋白分解能力法等。
木瓜蛋白酶
食品添加剂木瓜蛋白酶学院:食品与营养工程学院专业:食品加工班级:食工102学号:010*******姓名:王瑞真木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类疏基蛋白酶。
广泛存在与番木瓜的根、茎、叶和果实内，在未成熟的乳汁中含量最丰富。
它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特色，因此在食品、医药、饲料、皮革及纺织等行业得到广泛应用[1]。
一、木瓜蛋白的组分工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
由木瓜乳胶提取粗制酶,除含有木瓜蛋白酶外,还含有半耽氨酸蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、谷氨酞胺以及低相对分子质量的疏基化合物,还有葡萄糖酶等。
其中大部分都是疏基蛋白酶,主要的两种组分是木瓜凝乳酶和木瓜蛋白酶[2]。
二、木瓜蛋白的结构木瓜乳汁中四种已知半肤氨酸蛋白酶的一级结构具有高度同源性,其氨基酸数目和同源性比较如表1所示。
除chymopapain含有8个半肤氨酸外,其余三种酶都只含有7个半肤氨酸。
25位的流基是活性位点,不参与二硫键的形成（chymopapain的117位琉基也不参与二硫键的形成 ）,其余疏基以相同的方式形成三个二硫键，具有同样的保守性。
人们在不同清晰下得到了四种酶的X 一射线结构。
四种酶的肤链折叠方式相似,形成两个大小相、构型不同的区域。
一个是由a一螺旋构成的L一区,另一个是由大量反向平行的片层构成的R一区。
活性位点氨基酸残基Cys25,Asn179和His159 就位于这些区域的表面,其中Cys25位于 L一区,起始a一螺旋上。
木瓜蛋白酶家族的Cys25 ，Gly23，Gly65 形成的S。
亚部位是一个大口袋，对底物专一性影响较小；S亚部位由于酶不同其氨基酸组成不同,几何形状亦不同,对酶的性质影响较大[3]。
三、木瓜蛋白酶的提取工艺1.过去的常规提取方法木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。
木瓜汁中提取木瓜蛋白酶--实验设计
木瓜汁中提取木瓜蛋白酶一、粗酶制备（冻存、调整浓度）1.蛋白质浓度（考xx蓝法）二、纯化和固定化1.双水相（PEG/磷酸盐）萃取，再过阳离子纯化；2.粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化（咪唑梯度洗，电泳看效果）；3.先双水相，取PEG相（上清）用亲和磁珠纯化和固定化；三、纯度1.快速蛋白质液相色谱；2.非变性碱性蛋白质电泳；四、酶活性1.水解酪蛋白活性（固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重复使用）；2.水解IgG检测特异性；五、载体/相表征亲和磁珠：TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外；双水相：一、xx木瓜制备粗酶[1,2]1.新鲜的木瓜用去离子水洗干净，再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵向2-3mm深的切口，让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。
-20 ℃存放。
（或者10mL汁液加90mL pH 6.0的PBS，搅拌15min，4℃9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。
）2.将解冻后的乳胶与40mM半胱氨酸按3:1(w/v)的比例混合，用6MHCl将悬浮液调整为pH 5.6，在4 ℃搅拌15 min，过滤并用6 M NaOH将滤液pH调整为9.0，4 ℃ 9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定上清中的蛋白质含量，然后用水/PBS调节。
可省略。
3.[1]NitsawangS,Hatti-KaulR,KanasawudP.PurificationofpapainfromCaricapapayalatex:Aqueoustwo-phaseextractionversustwo-stepsaltprecipitation[J].Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioningprocess to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.。
木瓜蛋白酶实验指导
实验一木瓜蛋白酶的提取及其活性测定一、实验目的通过本实验，要求学习和掌握木瓜蛋白酶酶源的选取、木瓜乳汁的采集及蛋白酶粗酶制剂提取等的基本原理和方法；学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定方法以及酶样中蛋白质含量的测定。
二、实验原理木瓜蛋白酶大量存在于木瓜汁液中，是一种巯基蛋白酶，其分子量为23900。
木瓜蛋白酶最适pH随底物而异，当以酪蛋白为底物时，酶的最适pH为7。
据此原理，本实验以未成熟的木瓜果实为材料，从果皮中采集新鲜乳汁，利用木瓜蛋白酶在pH7.2的磷酸缓冲液、35℃条件下水解底物酪蛋白产生酪氨酸，酪氨酸在275nm处有最大吸收峰，根据吸光值的大小反映酪氨酸的浓度，进而反映木瓜蛋白酶催化水解的反应速率，以此衡量该酶的活性。
考马斯亮蓝G-250在酸性条件下能够与蛋白质结合，形成的络合物在595nm 处具有最大吸光值，且吸光值的大小与蛋白质的含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
三、实验材料和用具1、实验材料：新鲜、未成熟的木瓜。
2、试剂：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）；1%的酪蛋白溶液：称1g的酪蛋白用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配至100mL；激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.2）配制含半胱氨酸20mmol/L，EDTA 1mmol/L的混合液；10%三氯乙酸（TCA）：称10g的TCA定容至100 mL；考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%磷酸溶液100mL，用蒸馏水定容到1000mL。
3、仪器、用具：恒温水浴锅、电子天平、紫外-可见分光光度计、研钵、烧杯、量筒、试管、移液管、吸耳球、漏斗、滤纸、标签纸、试管架、牙签等。
四、实验步骤1．木瓜乳的采集选取挂果30天以上的木瓜果实，用湿棉布小心擦净表面，用牙签等利器，在果实的表面划若干条深约3mm的划痕，此时有大量白色乳汁流出，于木瓜底部用干净的烧杯收集乳汁，片刻后收集的乳汁便会凝固。
木瓜蛋白酶活性实验报告
一、实验目的1. 了解木瓜蛋白酶的性质和作用机理。
2. 探究不同条件对木瓜蛋白酶活性的影响。
3. 通过实验验证木瓜蛋白酶在食品加工中的应用潜力。
二、实验原理木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。
木瓜蛋白酶的活性受pH、温度、离子强度等因素的影响。
本实验通过测定木瓜蛋白酶在不同pH、温度和离子强度下的活性，探讨其活性影响因素。
三、实验材料1. 木瓜蛋白酶样品2. 酚酞指示剂3. 酶反应缓冲液4. 硫酸铜溶液5. 碘液6. pH计7. 恒温水浴锅8. 移液器9. 试管四、实验方法1. pH对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入0.5ml不同pH的酶反应缓冲液（pH 2、4、6、8、10）。
（4）将5支试管置于37℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（5）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（6）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
2. 温度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别将5支试管置于0℃、20℃、37℃、50℃、70℃恒温水浴锅中保温10分钟。
（4）向5支试管中加入0.5ml酪蛋白溶液，摇匀。
（5）观察并记录各试管溶液的颜色变化。
3. 离子强度对木瓜蛋白酶活性的影响（1）取5支试管，分别加入0.5ml酶反应缓冲液，编号为1、2、3、4、5。
（2）分别向5支试管中加入0.1ml木瓜蛋白酶样品，编号为1、2、3、4、5。
（3）分别向5支试管中加入不同离子强度的硫酸铜溶液（0.01mol/L、0.05mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L）。
木瓜蛋白酶提取
0.615
500
15.35 7675.0 27.50
211.1
硫酸铵一次纯 化上清
+
乙 4'
0.292 500
7.09 3545.0 10.00
35.5
硫酸铵二次纯 化沉淀
醇 9'
0.228 500
5.46 2730.0 10.00 27.3 乙醇沉淀
编号
稀释倍 待测管吸
数
光度
1
10000. 0
1.348
18.28 9140.0 12.50
4.06 2030.0 10.00
络氨酸标 准液
酶活(u)
蛋白质 （酶） 含量(mg)
68911.9 169.1
95.6 114.3 20.3
乙醇沉淀
硫酸铵一次 纯化上清
硫酸铵二次 纯化沉淀
酶比活 (u/mg)
乙醇+硫酸铵
410.0
粗提
5’ 5000 0.284 0.201
35.5
1090.0
硫酸铵二次 纯化沉淀
9’ 5560.0 0.479 0.308
62,850. 1 27.3 2300.0 乙醇沉淀
9’’ 5560.0 0.433 0.314
70,314.0 27.3 2570.0 透析
乙 编号 醇1
吸光度值
稀释倍数
标准曲线查 得值浓度 （ug/ml)
测得蛋白质 浓度(ug/ml)
在 275nm 处侧吸 光值
吸光 度 A
A0
取酪氨酸溶液，以蒸馏水为空白，测定吸光度
An
硫 编号 酸1 铵2
吸光度值
0.676
稀释倍数
标准曲线查 得值浓度 （ug/ml)
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实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。
是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。
木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。
它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。
有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。
有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。
使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。
硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐析时溶液PH在木瓜蛋白酶等电点时（PI=8.75）则效果最好，盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
木瓜蛋白酶活力测定：蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯乙酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯乙酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
酶活力单位定义：在规定条件下，1min内酶水解酪蛋白释放出相当于1ug/ml酪氨酸在275nm波长处的吸收度为1个活力单位。
以0.1mol/l盐酸溶液做空白，在275nm波长处测定空白溶液，待测定液，对照品溶液的吸光度。
饱和硫酸铵溶解曲线：二、实验材料与仪器：材料：未成熟的番木瓜，无水乙醇，0.05mol/L磷酸氢二钠; 0.1mol/L HC1，乙二胺四乙酸二钠固体；氢氧化钠固体，酪蛋白固体，半胱氨酸固体，氯化钠固体，三氯乙酸固体，硫酸铵粉末，乙酸钠固体，和冰乙酸溶液，EDTA。
仪器：高速组织捣碎机，水浴箱，精确pH计，紫外分光光度计，高速冷冻离心机，精密电子天平，低温冰箱。
三、技术路线四、实验步骤4.1实验前准备：所需试剂的配制以及考马斯亮蓝G-250法测蛋白含量的预实验，确保试验方法的可行性。
考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。
静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。
标准蛋白质溶液（0.1mg/mL）:准确称取牛血清蛋白0.01g用蒸馏水溶解并稀释到100mL。
现配现用。
酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。
500ml的2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取10g的碳酸氢钠和0.1871g的EDTA溶于500ml蒸馏水中，调节PH至8.0。
500ml的1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液：称取0.1871g的EDTA溶于500ml蒸馏水中，调节PH至8.0。
酪蛋白溶液：称取酪蛋白0.6g加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液80mL（取1.433g 磷酸氢二钠固体加80mL蒸馏水即得溶液），置沸水浴中煮30min，时时搅拌，冷却至室温。
加1M盐酸调节PH至7.0 0.1 。
加蒸馏水稀释到100mL。
用前配置。
酶稀释液：A液称取半胱氨酸0.264g，氯化钠1.17g，加蒸馏水25mL溶解；B液称取乙二胺四乙酸二钠0.112g，加蒸馏水10mL溶解；合并A、B液，搅拌均匀，用4.0mol/L氢氧化钠溶液调节PH值到5.5，加蒸馏水稀释至50mL 。
用前配置。
三氯乙酸溶液：取三氯乙酸0.9g，加乙酸钠1.495g和冰乙酸0.95mL，加水溶解并稀释至50mL。
4.2木瓜蛋白酶提取4.2.1粗酶液提取：①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液（编号为酶液1）。
4.2.2粗酶液纯化：将粗液放入冰桶中，加入适量酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.004mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
对过夜的酶液继续处理4.2.3透析：8000-14000标号的透析袋处理：①取透析袋剪成适当长度的小段。
放入大体积的2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。
②用蒸馏水彻底漂洗透析袋。
放在 1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。
③冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。
从此时起取用透析袋是必须戴手套，在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
④系好透析袋的一端，从另一端注入酶液4、5，将透析袋放入蒸馏水中，在摇床上震荡，时时换蒸馏水。
⑤直至向蒸馏水中加入氯化钡溶液，无沉淀产生及透析除盐完成。
取出蛋白质溶液。
4.3木瓜蛋白酶活性及总蛋白含量测定：4.3.1酶活性的测量酪氨酸标准液和酶液处理酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100mL。
（此为50ug/ml的标准液）酶液的处理：取0.3ml酶液，加酶稀释液2.7ml，稀释至3mL。
操作①待测液：准确量取酶液溶液各1.0mL，分别置于2支10mL带塞试管中，于50度水浴预热5分钟，准确加入50度预热的酪蛋白溶液5mL，立即振摇，置50度水浴中，精确反应10min后，加三氯乙酸溶液5.0mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm 的波长处测定吸光度A。
②空白对照液：再精确量取酶液1.0mL，置于10mL具塞试管中，于50度水浴预热5min，准确加入50度预热的蒸馏水5ml, 置50度水浴中，加入三氯乙酸溶液5mL，振摇，于50度水浴中放置40min，用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A0。
③酪氨酸标准液：另取酪氨酸对照溶液，以蒸馏水为空白，在275nm的波长处公式：酶活力（U/g）=10001110210⨯⨯⨯⨯⨯-nWWAAAn式中:Ｗ1—酪氨酸标准液每1ｍＬ中含酪氨酸的量,单位为微克(μｇ);10—反应时间;11—测定总体积;n—待测液的稀释倍数;1000—毫克与克的转换倍数。
在上述条件下,每分钟水解酪蛋白生成1μｇ酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位。
4.3.2酶含量的测量：取8支15 mL试管，按下表加入试剂将试管摇匀，放置2-3分钟。
用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
(注意应在1小时内完成比色)，以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
对酶液进行稀释，统一酶液体积至100ml：分别取1ml 酶液1、酶液2、酶液3、酶液4、酶液5、酶液6于6支干净离心管中稀释至10ml（相当于木瓜蛋白酶溶于100ml蒸馏水中），再进行下步处理。
用倍比稀释的方法找出酶液测吸光度的最适倍数，使再重新取样测量，取1ml酶液于试管中，再加4ml考马斯亮蓝溶液，混匀，静置5min后在A595下测吸光度，再根据标准曲线算酶含量。