液相色谱法基本原理
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色谱柱：Shim-Pack VP色谱柱 ODS 150mm Φ4.6mm 检测器：UV200nm-650nm 检测器 流动相：甲醇(HPLC)，水 分析物质：酚类（五种）， 分析物质 邻苯二甲酸酯类（两种）
JiangXue
岛津 LC-2010A HT 简介
色 谱柱
检测器 检测器 进样器 进样器 输液泵 柱温箱
• • • • • • C18 (ODS) C8 (octyl) C4 (butyl) 苯基 TMS 氰基
非极性色谱柱
-Si-C18H37
Si
流动相极性大于固定相极性， 流动相极性大于固定相极性，流动相具有运载样品分子和选 择性分离的双重作用。 择性分离的双重作用。
JiangXue
液相色谱基本原理
溶剂
数据处 数据处理
由流动相组成的溶剂在输液泵的作用下，通过管道输入系 统内，并保持稳定而准确的流速。进样器是样品进入液相 色谱仪的地方，在流动相的带动下，样品进入色谱柱，柱 温箱可以为色谱柱保持恒定的温度，样品经过分离最后进 入检测器。检测器记录下来的数据由专门的数据处理工作 站完成。
JiangXue
•
色谱分离原理
正相色谱的分离原理：根据溶质极性的不同而产生的溶质在吸附 剂上吸附性强弱的差异而分离。 反相色谱的分离原理： 反相色谱的分离原理：根据因溶质疏水性的不同而产生的溶质在 流动相与固定相之间分配系数的差异而分离。 流动相与固定相之间分配系数的差异而分离。
JiangXue
液相色谱基本原理
反相液相色谱柱
JiangXue
液相色谱基本原理
梯度洗脱
♥ 流动相由几种不同极性的溶剂组成。 ♥ 通过在某些时间段改变流动相中各溶剂组成的比 例改变流动相的极性。 ♥ 使样品中的各组分可在最短时间内实现最佳分离。
如：0-3min使用40%水+60%甲醇， 3-15min 40%水→10%，同时60%甲醇→90%
JiangXue
水 去
去离子水 蒸 蒸水
JiangXue
液相色谱基本原理
溶剂的前处理
过滤： 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 或更小孔径滤膜 脱气： 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 气泡对测定的影响：
☼ 泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 ☼ 色谱柱中气泡使流动相绕流，峰变形 ☼ 检测器中的气泡产生基线波动
分离组分 色素混合物（试样） 碳酸钙颗粒（色谱柱）
JiangXue
液相色谱基本原理
• 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术 • 流动相：携带样品流过整个系统的流体，如甲醇，乙腈等 • 固定相：静止不动的一相，色谱柱 色谱是一种分离技术. 色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量
岛津 LC-2010A HT 简介
A 色谱柱 检测器 检测器 进样器 进样器 A泵 柱温箱
浓度 B B泵 时间
JiangXue
岛津 LC-2010A HT 简介
流动相
JiangXue
岛津 LC-2010A HT 简介
酚类标准物质色谱图
1、苯酚 2、间甲酚 3、2,4-二氯酚 4、2,4,6-三氯酚 5、五氯酚
ODS C8 TMS
分析条件
柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : MeOH : H2O = 7 :3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 40 C 进样体积 : 10 uL 检测器 : UV-254 nm 峰 1. 苯甲酸甲脂 2. 苯甲酸乙脂 3. n-苯甲酸丙酯 4. n-苯甲酸丁酯
方法：超声脱气，减压脱气， 方法：超声脱气，减压脱气，在线脱气
JiangXue
液相色谱基本原理
常用检测器
紫外检测器（包括二极管阵列检测器） 紫外检测器 荧光检测器 示差折光检测器 电导检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
JiangXue
液相色谱基本原理
紫外检测器
♥ 原理：基于被分析组分对特定波长的选择性吸收 ♥ 定量基础：朗伯-比耳定律，A＝kCL ♥ 优点： 1）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感 3）可用于梯度洗脱 ♥ 注意：仅适用于测定有紫外吸收的物质
适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 分析。
如广泛应用于食品分析，环境分析，农业分析，石油化工 分析等领域。
JiangXue
液相色谱基本原理
•
液相色谱方法的分类
液相色谱分离方法大致可以分为正相色谱、反相色谱、离子交换 色谱、疏水作用色谱、体积排除色谱、亲和色谱以及手性色谱。 在高效液相色谱法中，目前应用得最广泛的是正相色谱和反相色 正相色谱和反相色 其中反相色谱是重点应用。 谱，其中反相色谱是重点应用。
液相色谱基本原理
20 %H2O+80%甲醇 %H +80%甲醇 30 % H2O+70%甲醇 +70%甲醇 40% H2O+60%甲醇 +60%甲醇
不同组成的流动相对样品分离有很大的影响。 不同组成的流动相对样品分离有很大的影响。
JiangXue
岛津 LC-2010A HT 简介
Shimadzu LC-2010A HT
JiangXue
液相色谱基本原理
流动相的选择
不改变固定相任何性质 高纯度（HPLC，无机械杂质） 较低粘度 对样品溶解度适宜 与检测器相匹配 水的等级
JiangXue
液相色谱基本原理
• 水的等级
吸 光
去离子水
– 纯化水 – 蒸馏水 – 去离子水
率
纯化水
(nm)
纯水 18.2MΩ
பைடு நூலகம்
纯水 纯水 离子
HPLC 0.22µm
液相色谱法基本原理
岛津 LC-2010A HT 简介
JiangXue
液相色谱法简介
• 1.色谱法及其起源 色谱法及其起源 • 2.液相色谱法基本原理及其应用 液相色谱法基本原理及其应用 • 3.液相色谱仪基本构造 液相色谱仪基本构造
• 4.样品前处理 样品前处理
JiangXue
色谱法起源
色谱 石油醚（流动相）
JiangXue
液相色谱法基本原理
岛津 LC-2010A HT 简介
结
JiangXue
束
JiangXue
岛津 LC-2010A HT 简介
JiangXue
岛津 LC-2010A HT 简介
JiangXue
岛津 LC-2010A HT 简介
JiangXue
岛津 LC-2010A HT 简介
mV 500 Propyl Paraben 400
Ethyl Paraben
200
100
0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 min
JiangXue
Methyl Paraben
Butyl Paraben
300
液相色谱应用范围
液体作为流动相的色谱分离方法 以液体作为流动相的色谱分离方法
JiangXue
岛津 LC-2010A HT 简介
JiangXue
岛津 LC-2010A HT 简介
JiangXue
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色 谱柱
检测器 检测器 进样器 进样器 输液泵 柱温箱
• • • • • • C18 (ODS) C8 (octyl) C4 (butyl) 苯基 TMS 氰基
非极性色谱柱
-Si-C18H37
Si
流动相极性大于固定相极性， 流动相极性大于固定相极性，流动相具有运载样品分子和选 择性分离的双重作用。 择性分离的双重作用。
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液相色谱基本原理
溶剂
数据处 数据处理
由流动相组成的溶剂在输液泵的作用下，通过管道输入系 统内，并保持稳定而准确的流速。进样器是样品进入液相 色谱仪的地方，在流动相的带动下，样品进入色谱柱，柱 温箱可以为色谱柱保持恒定的温度，样品经过分离最后进 入检测器。检测器记录下来的数据由专门的数据处理工作 站完成。
JiangXue
•
色谱分离原理
正相色谱的分离原理：根据溶质极性的不同而产生的溶质在吸附 剂上吸附性强弱的差异而分离。 反相色谱的分离原理： 反相色谱的分离原理：根据因溶质疏水性的不同而产生的溶质在 流动相与固定相之间分配系数的差异而分离。 流动相与固定相之间分配系数的差异而分离。
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液相色谱基本原理
反相液相色谱柱
JiangXue
液相色谱基本原理
梯度洗脱
♥ 流动相由几种不同极性的溶剂组成。 ♥ 通过在某些时间段改变流动相中各溶剂组成的比 例改变流动相的极性。 ♥ 使样品中的各组分可在最短时间内实现最佳分离。
如：0-3min使用40%水+60%甲醇， 3-15min 40%水→10%，同时60%甲醇→90%
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水 去
去离子水 蒸 蒸水
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液相色谱基本原理
溶剂的前处理
过滤： 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 或更小孔径滤膜 脱气： 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 气泡对测定的影响：
☼ 泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 ☼ 色谱柱中气泡使流动相绕流，峰变形 ☼ 检测器中的气泡产生基线波动
分离组分 色素混合物（试样） 碳酸钙颗粒（色谱柱）
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液相色谱基本原理
• 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术 • 流动相：携带样品流过整个系统的流体，如甲醇，乙腈等 • 固定相：静止不动的一相，色谱柱 色谱是一种分离技术. 色谱的主要目的是对混合物中的目标物分离和定量
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A 色谱柱 检测器 检测器 进样器 进样器 A泵 柱温箱
浓度 B B泵 时间
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流动相
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酚类标准物质色谱图
1、苯酚 2、间甲酚 3、2,4-二氯酚 4、2,4,6-三氯酚 5、五氯酚
ODS C8 TMS
分析条件
柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : MeOH : H2O = 7 :3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 40 C 进样体积 : 10 uL 检测器 : UV-254 nm 峰 1. 苯甲酸甲脂 2. 苯甲酸乙脂 3. n-苯甲酸丙酯 4. n-苯甲酸丁酯
方法：超声脱气，减压脱气， 方法：超声脱气，减压脱气，在线脱气
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常用检测器
紫外检测器（包括二极管阵列检测器） 紫外检测器 荧光检测器 示差折光检测器 电导检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
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液相色谱基本原理
紫外检测器
♥ 原理：基于被分析组分对特定波长的选择性吸收 ♥ 定量基础：朗伯-比耳定律，A＝kCL ♥ 优点： 1）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感 3）可用于梯度洗脱 ♥ 注意：仅适用于测定有紫外吸收的物质
适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的 分析。
如广泛应用于食品分析，环境分析，农业分析，石油化工 分析等领域。
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液相色谱基本原理
•
液相色谱方法的分类
液相色谱分离方法大致可以分为正相色谱、反相色谱、离子交换 色谱、疏水作用色谱、体积排除色谱、亲和色谱以及手性色谱。 在高效液相色谱法中，目前应用得最广泛的是正相色谱和反相色 正相色谱和反相色 其中反相色谱是重点应用。 谱，其中反相色谱是重点应用。
液相色谱基本原理
20 %H2O+80%甲醇 %H +80%甲醇 30 % H2O+70%甲醇 +70%甲醇 40% H2O+60%甲醇 +60%甲醇
不同组成的流动相对样品分离有很大的影响。 不同组成的流动相对样品分离有很大的影响。
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Shimadzu LC-2010A HT
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流动相的选择
不改变固定相任何性质 高纯度（HPLC，无机械杂质） 较低粘度 对样品溶解度适宜 与检测器相匹配 水的等级
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液相色谱基本原理
• 水的等级
吸 光
去离子水
– 纯化水 – 蒸馏水 – 去离子水
率
纯化水
(nm)
纯水 18.2MΩ
பைடு நூலகம்
纯水 纯水 离子
HPLC 0.22µm
液相色谱法基本原理
岛津 LC-2010A HT 简介
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液相色谱法简介
• 1.色谱法及其起源 色谱法及其起源 • 2.液相色谱法基本原理及其应用 液相色谱法基本原理及其应用 • 3.液相色谱仪基本构造 液相色谱仪基本构造
• 4.样品前处理 样品前处理
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色谱法起源
色谱 石油醚（流动相）
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液相色谱法基本原理
岛津 LC-2010A HT 简介
结
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束
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岛津 LC-2010A HT 简介
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mV 500 Propyl Paraben 400
Ethyl Paraben
200
100
0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 min
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Methyl Paraben
Butyl Paraben
300
液相色谱应用范围
液体作为流动相的色谱分离方法 以液体作为流动相的色谱分离方法
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