药品微生物学检验实用技术分析
药品微生物检验及方法验证
药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。
第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。
器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。
培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。
固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。
煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。
万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。
液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。
万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。
消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。
表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。
可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。
另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。
第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。
首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。
进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。
药品微生物检验的方法与应用研究
药品微生物检验的方法与应用研究摘要：在我国药品生产与检验工作中，药品为何僧物检验工作能够帮助生产厂商以及消费者对药品安全情况进行管控，因此对药品微生物检验工作进行严格质量管控是我国药品行业发展的重要保障，本文首先就药品微生物检验质量控制的作用与特点进行了分析，并就其具体措施进行了探讨。
关键词：药品微生物检验；特点；质控引言在药品质量控制的过程中药品微生物的控制是非常重要的一个环节，因为微生物检验的结果是非常重要的参考依据。
相对于理化检验来说，微生物检验从本质上来说属于活体检验，而且最终的结果也会收到各种因素的综合影响，比如菌种的活力、外围环境、培养基的质量等等。
在当代GMP生产的标准下，药品微生物出现污染的情况属于小概率的事件，而且产生污染的情况不同，并不能通过复试来确定最终的结果，因此，目前很多国家都规定要对异常的结果采取有条件的复试。
1药品微生物的多样性特征对药源性微生物进行研究时，从分类研究的角度入手发现，药源性微生物本身的多样性特征极为明显，主要涉及细菌微生物、真菌微生物以及放线菌微生物等表现类型。
这些种类比较繁多的药源性微生物在西药化学合成生产过程中有比较具体的应用，与其他类型的生物相比，微生物在基础性的遗传物质中以及生理性代谢作用机制中的表现特征比较显著。
能够诱导该类生物形态本身在基础性代谢生理过程中产生多样的化学产物。
根据药品微生物的多样性特征，可以利用这一特性对药源性微生物内的有用制药材料进行提取，并且在生产药品的过程中也可以利用微生物的繁殖能力，保证药物的大量生产。
可以根据药物的具体作用对微生物进行分类，这样能够保证对各种类型的药源微生物进行充分有效的利用。
但是在对微生物利用的过程中还会存在一些问题，影响药品微生物的利用效果，因此，需要对药品微生物进行必要的检测工作，才能够保证药品微生物制药过程的质量和可靠性[1]。
2药品微生物检测的重要性任何一种微生物药物都有着潜在的使用风险,在微生物药物高效性的背后，其风险性是绝对不能够忽视的。
药品微生物检验的方法及应用分析
药品微生物检验的方法及应用分析摘要：药品微生物指标超标直接影响药品使用者的安全与健康，故需对药品微生物进行检验，该文分析了药品微生物检验中的无菌检查法和限度检查法，结合注射用头孢抗生素无菌检查和妇科胶囊微生物限度检查介绍了此二法的应用。
关键词：药品；微生物检验；检验方法药品用于治疗疾病，但被微生物污染的药品不但影响治疗效果，还会加重病情，而药品微生物检验是保证药品质量的重要手段[1]。
药品微生物污染事件屡见不鲜，已严重影响用药安全，要保证药品微生物检验结果的准确离不开检验方法的选择和应用，例如微生物限度检查方法影响检查结果的准确性，方法适用性的确认是确保检查结果准确可靠的关键环节[2]。
因此，本文对药品微生物检验的方法及应用进行了分析。
1药品微生物检验的方法1.1 无菌检查法要求无菌的药品必须进行无菌检查，所谓无菌检查即按照无菌检查标准及规定的检验条件检查是否有微生物污染。
无菌检查要求严格的无菌条件，并且操作的全过程都达到无菌要求，在这样的情况下仍检不出供试品内含有微生物判为合格。
为了满足无菌条件，应按相关标准验证和确认洁净度，即监测单向流空气区域、工作台面、环境中的悬浮粒子、浮游菌、沉降菌数量符合A级洁净度要求。
对药品进行无菌检查需验证检查方法的适用性，且药品及检验程序发生变化可能影响检验结果时需重新验证适用性。
验证适用性需对菌种及菌液制备、检查方法（薄膜过滤法或直接接种法）进行试验，并按相关要求判断结果。
《中国药典》2020年版三、四部对无菌检查的检验数量、检验量、阳性对照、阴性对照、供试品处理及接种营养基、结果判断作了明确规定。
例如注射剂批产量在101～500个时，接种每种培养基的最少检验数量为10个；供试品最少检验量在供试品装量为41～100ml时，每支供试品接入每种培养基的最少量为20ml；抗革兰氏阳性菌的供试品阳性对照菌为金黄葡萄球菌；采用薄膜过滤法；在培养基规定的温度培养至少14天；供试品管澄清或有浑浊但经确认无菌生长即合格。
药品的微生物学检查详解演示文稿
• 方法： 1.取洁净玻片，用记号笔画两个圈并标号，其中一
个滴加生理盐水另一个滴加兔血浆。
2.接种环烧灼灭菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理盐水中研 匀混悬，另1/2在兔血浆中研匀混悬，静止片刻，观 察结果。
• 结果：
凝集呈颗粒状判定为血浆凝固酶试验（+）， 呈均匀混浊状不凝集判定为（-）
枸橼酸盐2管
1
1
1
1
1
1
第四十页，共57页。
实验四 药物的微生物限度检查（四）
病毒和细菌及其他病原微生物 取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物中细菌进行血浆凝固酶检测,依
据 其反应结果,确定该菌的性质及名称。
第四十一页，共57页。
二.血浆凝固酶试验
• 原理：非致病性葡萄球菌不产生血浆凝固酶而致
无色变 阴性（-）
黄色 阴性（-）
红色 阳性（+）
绿—蓝色 阳性（+）
第五十一页，共57页。
IMViC结果
• 吸哚试验：取出后每管滴加柯氏试剂0.5ml，静止片刻，观察有无颜色改变。大肠 埃希菌能够分解色氨酸产生吲哚，加入对二甲基氨基苯甲醛后形成红色的玫瑰吲哚， 则为阳性反应；产气杆菌不产生吲哚，添加试剂后无颜色变化，为阴性反应。
2）抗生素---青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。
第二十八页，共57页。
药物的微生物限度检查（三）
1）从伊红美兰琼脂平板培养基上----挑取黑色带有金属光泽的湿润菌落，接种在普通琼脂斜面培养基
上面，进行细菌的纯培养。 2）观察外用药物在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上生长状况。
记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠度等。
初次分离标本
药品微生物常用鉴定方法
2、具体操作
1）涂片、固定 2）草酸铵结晶紫染1分钟，水洗 3）碘液覆盖涂面染约1分钟，水洗 4）95%酒精脱色30秒，水洗，吸去水分 5）蕃红复染30秒，水洗，干燥，镜检
3、原理
G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障， 当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔隙缩小，故保留结晶 紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结 构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶 紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。
7、选择培养基分离
•
选择培养基特性 • 促生长能力 • 抑制能力 • 指示能力
二、革兰氏染色法
细菌学中广泛使用 1884年由丹麦医师、细菌学家汉斯·克里斯蒂 安·约阿希姆·革兰氏(Hans Christian Joachim Gram,1853-1938)创立
1、染色步骤
初染 媒染 脱色 复染
革兰氏染色原理
4、影响因素
1）涂片太厚 2）固定 3）脱色时间 4）革兰氏染液 5）细菌培养时间 -对数生长期 6）培养基 7）碘液 放置时间太长 8） 结晶紫的浓度太高 9）酒精 浓度
5、仪器
6、实验室常用菌革兰氏染色结果
三、微生物鉴定原则
菌种鉴定:它是什么菌？（未知菌）
1、微生物分类
药品微生物常用鉴定技术
四川省食品药品检验检测院
实验助手APP授权发布
2016年10月 成都
一、微生物纯培养分离技术 二、革兰氏染色 三、微生物鉴定原则 四、常用微生物鉴定技术
一、微生物纯培养分离技术
纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体 获得纯培养物对微生物学研究至关重要
微生物纯培养分离技术
1、平板涂布法 2、平板划线法 3、平板倾注法 4、稀释摇管法 5、液体培养基分离法 6、单细胞（孢子）分离法 7、选择培养基分离法
药物制剂的微生物学检查
毒力试验和保护力试验
取破伤风杆菌液体培养物于小鼠后肢肌肉 注射，动物发病时，腿及尾巴强直，肢体痉 挛，最后死亡。
薄膜滤菌器
口服药及外用药物 的微生物学检查
口服药：细菌总数、霉菌总数、大肠杆菌、活螨的 检测。
外用药：绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和破伤风杆菌。 一般眼科制剂：细菌总数、霉菌总数、绿脓杆菌、
金黄色葡萄球菌。 均不能检出致病菌。
细菌总数测定
细菌总数，指每克或每毫升待检药品内含 有的活菌总数。
破伤风杆菌
破伤风杆菌广泛存在于土壤及人和牲畜 的粪便中。以根，茎、叶类植物为原料的中 草药制剂特别易受破伤风杆菌污染，在条件 合适时感染伤口引起病变。
因此用于深部组织、创面和溃疡面的外 用制剂不得检出破伤风杆菌。
检测时首先把待检药品加入到0.1％葡萄糖庖 肉培养基中进行增菌产毒培养。
其为水溶性的药品的无菌检查 特殊注射剂
油剂性药物 含抑菌或防腐成分药物
一般注射剂的无菌检查
直接接种法
需氧菌和厌氧菌的培养已全部采用硫乙醇酸 钠培养基检查。在同一培养基中，需氧菌在 培养基表面生长，而厌氧菌在培养基内生长。
真菌检查用真菌培养基
硫乙醇酸钠培养基
硫乙醇酸钠 还原剂
病原菌检验
大肠杆菌 沙门菌 绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌 破伤风杆菌
大肠杆菌
大肠杆菌是人、畜肠道主要寄生菌。它随粪便 排出体外，故常作为食品、饮水等被粪便直接或间 接污染的指示菌。
药物分析中的药物微生物学研究
药物分析中的药物微生物学研究药物分析是研究药物的组成成分及其质量的科学方法。
在药物分析中，药物微生物学研究是不可或缺的环节。
本文将探讨药物分析中的药物微生物学研究方法和重要性。
一、药物微生物学研究的定义及重要性药物微生物学研究是指对药物样品中的微生物进行检验、鉴定、计数和控制的过程。
药物样品中的微生物可能来自原材料、生产环境、生产设备或其他环境因素，这些微生物有可能会影响药物的质量和安全性，因此药物微生物学研究至关重要。
药物的微生物污染会导致药物失效、变质以及对患者产生不良反应。
通过药物微生物学研究，可以对药物样品中的微生物进行全面的检测和分析，从而保证药物的质量和安全性。
二、药物微生物学研究的主要方法1. 总微生物计数：总微生物计数是药物微生物学研究中最基本的方法之一。
通过采用适当的培养基和培养条件，将药物样品中的微生物培养出来，并用计数板进行计数。
总微生物计数能够反映药物样品中的微生物污染水平。
2. 特定微生物的检测和鉴定：除了对药物样品进行总微生物计数外，还需要对特定微生物进行检测和鉴定。
常用的方法包括PCR技术、传统培养方法以及质谱分析方法等。
这些方法可以快速准确地确定药物样品中的具体微生物种类，并判断其是否存在污染。
3. 菌株的保存与病原性研究：药物微生物学研究中，保存菌株非常重要。
保存菌株可以方便后续研究和鉴定，同时也为病原性研究提供了基础。
通过研究保存的菌株，可以深入了解微生物的生理特性和致病机制。
三、药物微生物学研究的应用1. 药物质量监控：药物微生物学研究可以对药物质量进行全面监控。
通过对药物样品中的微生物进行检测和分析，可以评估药物的质量和安全性，并及时采取措施进行改进。
2. 临床应用：药物微生物学研究对临床应用也具有重要意义。
通过对药物样品中微生物的检测，可以预防和控制药物的污染，保障患者用药的安全性。
同时，药物微生物学研究也为临床上药物抗菌治疗提供了重要的参考依据。
3. 药物研发与生产：药物微生物学研究在药物研发和生产过程中也扮演重要角色。
药物的微生物检测
药物的微生物检测随着科技的进步和医学研究的深入，微生物检测成为了现代药物生产中不可或缺的一部分。
微生物检测旨在确保药物的质量和安全性，以预防潜在的细菌、真菌或其他微生物的污染。
本文将探讨药物的微生物检测的重要性、常用的微生物检测方法以及相关的法规和指南。
一、重要性药物的微生物检测对于确保患者的安全和药物的疗效至关重要。
微生物的污染可能导致严重的健康问题，甚至危及生命。
微生物的存在可能导致药物的降解、变质或失效，影响患者的治疗效果。
因此，对药物中微生物的准确检测和有效控制是必不可少的。
二、微生物检测方法1.生物指示剂方法生物指示剂是一种常用的微生物检测方法，通过将生物指示剂与药物一同暴露在一定条件下，观察并记录生物指示剂的生长情况和变化，来判断药物中是否存在微生物。
这种方法的优点是操作简单，结果准确可靠。
然而，生物指示剂方法存在时间周期长、结果需要较长时间才能得出等缺点。
2.光学显微镜方法光学显微镜方法是通过显微观察药物样品中的微生物来进行检测。
该方法对于观察微生物的特征和形态非常有帮助，在病原微生物的检测中具有独特的优势。
然而，光学显微镜方法的缺点是需要有经验的操作者进行观察和判断，结果可能受到主观因素的影响。
3.快速生物计数方法快速生物计数方法利用现代技术对药物样品中的微生物进行快速检测和计数。
这种方法不仅具有高效、准确的优点，而且时间短、操作简便，可以大大提高药物生产过程中的生产效率和产品质量。
然而，快速生物计数方法的设备和技术要求较高，需要相应的专业设备和人员培训。
三、法规和指南为了保护患者的安全和维护药品的质量，各国都制定了相关的法规和指南来规范药物的微生物检测。
例如，美国食品药品监督管理局（FDA）颁布的《药典》包含了详细的微生物检测方法和要求。
此外，国际药典委员会（USP）、欧洲药典委员会（EP）等国际组织也发布了相应的规范和指南，以促进全球药品质量的统一。
结论药物的微生物检测对于保障患者的安全和药品的质量至关重要。
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药品微生物学检验实用技术分析【摘要】药品的微生物学检查属于一项常规安全性检查，该项工作内容相对繁琐，培养基、菌株、实验步骤以及供试品的制备等因素均会对其结果产生影响。
因此对这些影响因素进行分析，并采取相应的技术进行避免为目前药品微生物检验工作中的重点。
本文从微生物检查方法验证的难点、微生物检查方法验证的模式和相关的影响因素几个方面进行了综述。
【关键词】药品检验；微生物学检查；安全性；方法验证；质量控制
研究证实微生物在药品中通过代谢产物或者是微生物体对机体造成过敏、感染以及中毒等不良反应，甚至会危及到患者的生命安全。
因此药品微生物检查具有极大的重要性。
目前在药品质量控制中，微生物学检查已经成为一项常规的安全检查项目。
然而现阶段生物学检查工作所面临的难题为微生物检查方法的验证。
本文便对微生物学检验实用技术的现状进行了综述，详见下文。
1微生物检查方法验证的难点
近几年来人们开始对药品生产、保存以及使用过程中微生物污染问题给予了重视，并采取了诸多措施展开研究与评估。
曾有学者指出，药品中污染的微生物一般处在相对不稳定的状态，不确定性大，并且在药品生产的各个环节中微生物污染存在很大的不均匀性。
因此中国药典对药品微生物限度测试做出了详细的规定，对药品微生物污染的监测力度予以了增加。
微生物限度测试就是对非规
定范围内的灭菌制剂以及原料、辅料受微生物的污染程度进行检测，一般包括细菌数、真菌数、酵母菌数以及控制菌等几项[1]。
所有药品均需要在接受安全性检查后方可投入到临床使用，不管使无抑菌性药物还是抑菌性药物均需要接受微生物限度检查。
一些抑菌性药物被微生物污染后，由于微生物能够在一定条件下稳定存在一定时间，因此尽管其遭到了一定程度的破坏，然而并没有死亡，在条件发生改变时，譬如说人体用药后，存在适宜细菌生长的条件，其可复活进行繁殖。
细菌能够对抑菌药物产生适应性和耐药性，因此抑菌药物内污染的微生物会对人体健康构成严重的威胁。
2微生物检查方法验证的模式与影响因素
2.1培养基的无菌检查和性能检查在微生物检查时每批次的培
养基均应该全数按照使用目的和时间进行预培养，并在使用过程中对每一个培养皿进行检查，对是否发生微生物污染进行观察，并应注意培养基是否发生干裂或者是由于干燥而发生收缩，若是任何一项存在问题均需要及时进行更换。
经过预培养的培养基应严格按照要求对微生物进行检测，一般需要采取5代内的标准菌株进行试验，并且应该对控制菌设置阴性对照组，对专属性进行考察[2]。
2.2菌株的准备在对标准菌株进行选择时应注意菌株代数不得
超过5代。
2.3微生物方法验证
2.3.1细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证在进行验证试验时应至少展开3次独立性的平行试验，并对个试验菌在每次试验中的回
收率进行准确计算。
一般情况下验证菌包括有：大肠埃希菌、白色念球菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌以及枯草杆菌，菌株代数不得超过5代，菌液制备量在10-100cfh/ml之间。
在验证时分为试验组、菌液组、稀释剂对照组、供试品对照组[3]。
2.3.2控制菌检查方法的验证常用的控制菌包括：大肠菌群、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌以及梭菌。
按照规定对试验菌株的控制菌相应验证菌株进行选择，对于大肠菌群而言检查用大肠埃希菌，梭菌检查用生孢梭菌；在对大肠埃希菌、大肠菌群以及沙门菌进行验证时应设立金黄色葡萄球菌阴性对照组菌株；在对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌以及梭菌进行验证时应设立大肠埃希菌阴性对照组菌株。
菌液制备量在10-100cfh/ml 之间[4]。
3小结
在微生物方法验证合格之后，需要严格按照验证确立的方法对供试品展开严格的微生物检查。
对于药品的微生物限度检查方法验证工作而言，其内容相对繁琐、复杂且耗时耗材，并且该项检查的周期相对长，会受到诸多因素的干扰因，若是没有得到合理的控制会很难达到验证要求以及预期的效果。
因此在今后的微生物限度检查工作中要求验证单位应具备良好的实验环境、实验设施以及工作条件，并对实验工作者的理论基础掌握情况以及工作经验提出了更高的要求，需要对操作规范予以严格执行，从而实现减少或者是避免方法验证结果误差的出现。
应使微生物方法验证资料资源共享，
从而能够对我国药品微生物限度检查工作的快速发展产生有效的促进作用。
参考文献
[1]向东.影响微生物限度检查及方法验证的因素分析[j].现代医药卫生，2009，23（15）：2329-2330.
[2]中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[s].二部.北京：化学工业出版社，2010.1.
[3]关于执行《中华人民共和国药典》（2010年版）微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明[s].国药典发[2010]98号.
[4]郑钧镛，王光宝.药品微生物学及检验技术[m].北京：人民卫生出版社，2009：143-146.。