药品微生物检验替代方法
药品微生物检验替代方法验证指导原则
药品微生物检验替代方法验证指导原则本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。
随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分为三类：（1)基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；(2)直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞技术法、流式细胞计数法等；（3)基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。
这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。
在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。
微生物检验的类型及验证参数药品微生物检验方法主要分两种类型：定性试验和定量试验。
定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检査。
定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如菌落计数试验。
由于生物试验的特殊性，如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响，因此，药品质量标准分析方法验证指导原则（附录XIX A)不完全适宜于微生物替代方法的验证。
药品微生物检验替代方法的验证参数见表1。
表1 不同微生物检验类型验证参数注：尽管替代方法的验证参数与药品质量标准分析方法验证参数有相似之处，但是其具体的内容是依据微生物检验特点而设立的。
替代方法验证的实验结果需进行统计分析，当替代方法属于定性检验时，一般采用非参数的统计技术；当替代方法属于定量检验时，需要采用参数统计技术。
进行微生物替代方法的验证时，若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改，此时，需要验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。
新修订的《中国药典》对药品微生物检
2015版《中国药典》即将公布，新修订的《中国药典》对药品微生物检验和检定方法发生了重大变化，本次修订是对《中国药典》多年来固有的微生物检查系统进行根本性的调整，着重解决药品微生物相关检查方法及微生物限度标准与欧美等药典的协调统一问题。
宏观变化一：全面与国际接轨以无菌检查法为例从上述无菌检查法的比较中我们不难看出，新药典参考EP7.0、USP35、JPXV 标准，修订中国药典的微生物标准；参考欧美日药典标准修订菌数标准表达方式；以需氧菌总数替代细菌数、耐胆盐的格兰阴性菌替代大肠菌群等等，并增加新的概念：如含菌量较低的供试品细菌总数测定使用最大可能数法、分散均匀并非一定要溶解等等，同时新药典引入的偏差调查概念和内容更具体等等方面说明，微生物检验技术与国际标准要求接轨已成定势。
微观变化二：实验环境的修订2015年版药典中对无菌检查环境洁净度规定：无菌检查应在B 级背景下的A 级单向流洁净区域或D级背景下的隔离器中进行。
限度检查要求在受控洁净环境下的局部不低于B级单向流空气区域进行。
环境的提升，除了对药品检测设备硬件的要求提高，还有验证和维持环境要求的提高。
洁净或无菌室应配备独立的空气机组或空气净化系统，以满足相应的检验要求，包括温度和湿度的控制，压力、照度和噪声等都应符合工作要求。
空气过滤系统应定期维护和更换, 并保存相关记录。
微生物实验室应划分成相应的洁净区域和活菌操作区域，同时应根据实验目的，在时间或空间上有效分隔不相容的实验活动，将交叉污染的风险降低到最低。
活菌操作区应该配备生物安全柜，以避免危害性的生物因子对实验人员和实验环境造成的危害。
实验室环境监测要求提高，增加人员进出表面微生物的监测，以降低人员操作时带来的风险。
对微生物室使用的消毒剂和清洁剂进行验证，从而有效控制微生物，保证无菌环境达到要求。
微生物实验室需要加强人员在环境监测时的操作规范，保证环境监测数据的准确性。
而且实验人员应经过实验室生物安全方面的培训，保证自身安全，防止微生物在实验室内部污染。
2019年版药典无菌检查修定内容
表1 、表2 、表3增修订
表1 （第3列）接种每种培养基改为所需的最少检验数量 表2 （表题）上市抽验样品（液体制剂）的最少检验数量
修改为液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验 数量 第二列每支样品接入每管培养基的最少样品量修改为每 支供试品接入每管培养基的最少样品量
第三列最少检验数量（瓶或支）≤1 全量 ２0 ① 修改为 供试品最少检验数量（瓶或支） １0 ① 注① 每种培养基各接种１０支供试品修改为若供试品每个 容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检
2020/3/28
⑵新增培养基适用性检查方法 ①液体培养基促生长能力检查。 ②固体培养基促生长能力检查。
③培养基抑制能力检查。
④液体培养基指示能力检查。 ⑤固体培养基指示能力检查。 试验结果与对照培养基比较
2020/3/28
控制菌检查用培养基的适用性检查
控制菌检查用培养基的促生长、抑制及指示能力检查
为取每种培养基规定接种的供试品 总量。
2020/3/28
六、供试品的无菌检查增修订内容
⒈检验量 直接接种法除另有规定外，每份培养基接种 的供试品量按表2、表3规定删除采用直接接 种法时的规定。
⒉阴性对照 无菌试验中若使用表面活性剂等应证明其有 效性且对微生物生长无影响修改为无毒性。
2020/3/28
2020/3/28
起草的指导思想
一、以科学发展观为统领，服务于资源节约型社会 、环境友好型社会的要求；落实科学监管理念， 着力解决发展中的问题。
二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；坚持自 主与创新；积极推进药品标准化战略，提高我国 药品标准总体水平，着力提升《中国药典》在国 际社会中的地位和作用，提高综合竞争力，促进 医药产业的健康发展，为构建社会主义和谐社会 作出贡献。
《中国药典》微生物检查法
中国药典2010年版框架(卫)
• 无菌检查法 • 微生物限度检查法 • 灭菌法
• 抑菌效力检查法指导原则 • 药品微生物检验替代方法验证指导原则 • 微生物限度检查法应用指导原则 • 药品微生物实验室规范指导原则
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2010年版微生物限度检查法修订
2010年版《中国药典》微生物限度检查法 附录XIII C（一部） 附录XI J （二部）
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2010年版微生物限度检查法修订
2、附录107页，检验量 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；
（中药）膜剂为（50）100cm2；贵重药品、微 量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门 菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中 10g或10ml用于阳性对照试验 ）。
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2010年版微生物限度检查法修订
可选用的中和剂或灭活方法 亚硫酸氢纳 稀释剂 稀释剂、甘氨酸、硫代硫酸盐 卵磷脂、聚山梨醇酯 亚硫酸氢纳、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 卵磷脂 聚山梨醇酯 硫代硫酸盐 镁或钙离子 对氨基苯甲酸 ß-内酰胺酶
10
2010年版微生物限度检查法修订
8、附录109页，增加： • 若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物
4、附录108页，新增：贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃 或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如 无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。 然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或 卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，或以其他 方法制备成供试液。
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2010年版微生物限度检查法修订
11、附录109页，修订：菌数报告规则 • 细菌、酵母菌宜选取（细菌、酵母菌平均菌落数在30～
微生物检验替代方法的验证
<1223>微生物检验替代方法的验证引言本通则目的是为使用法定药典微生物检查方法之外的替代方法所进行的验证提供指南。
对于微生物的回收和鉴定，微生物检验实验室出于各种不同的原因，如成本、工作量和效率，有时会使用药典附录方法之外的替代方法。
这些方法必须经过验证。
在凡例与要求中的检测与含量测定中提供了一些使用替代方法的验证指南。
这一节还说明，在发生争议时，只有使用药典方法所得到的结果才是决定性的。
微生物替代方法的验证研究应考虑到很大程度的变异。
例如，在使用常规平板计数法进行微生物检测时，经常要面对比通常使用化学分析方法所得到的（RSD为1%〜3%）更为宽泛的结果范围（RSD为15%〜35%）。
许多常用的微生物检验方法容易受到抽样误差、稀释误差、浇碟误差、培养误差和操作误差的影响。
药典分析方法验证<1225>定义了一些在分析方法验证中需要应用的术语，如准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围、重现性和耐用性。
这些定义对于回答“至少与药典方法相当”这一问题所进行的微生物检验替代方法的验证而言是不很适宜的。
（见凡例与要求中的检测与含量测定）。
关键的问题是替代方法将产生的结果能否相当于或优于传统方法。
其他行业组织也提供了微生物检验替代方法的验证指导原则。
通过比较研究USP方法和替代方法来证明新方法或修改后的方法的适用性。
本章定义的特性，可用于建立这种比较。
微生物检验的类型验证的关键点是要确认检验方法中使用了替代技术的哪部分。
例如，有各种技术可用于检测活细胞的存在。
这些技术可能会被各种检验方法所采用（例如，生物负荷，无菌检查），但亊实上，并没有完全地替代检验方法的关键方面。
例如，使用结合有回收培养基的特殊过滤器并按药典规定的程序用薄膜过滤法进行无菌检査，然后使用一些现有的技术来证明活细胞的存在。
对这种方法进行验证，只需要针对所使用的回收系统而不必是整个方法。
针对微生物检验主要有三种检验类型。
微生物限度检查增修定内容
新版药典微生物学检查方法增修定内容大家下午好：今天我和大家一起共同学习2010年版《中国药典》微生物学检查方法增修定内容。
首先我们先了解2010年版《中国药典》新增内容，2010年版《中国药典》分为三部出版，一部为中药，二部为化学药，三部为生物制品。
各部内容主要包括凡例、标准正文和附录三部分，其中附录由制剂通则、通用检测方法、指导原则及索引等内容构成。
药典二部收载化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品以及药用辅料等。
药典三部收载生物制品。
新版药典在凡例、品种的标准要求、附录的制剂通则和检验方法等方面均有较大的改进和发展，特别是对药品的安全性、有效性和质量可控性方面尤为重视。
新版药典在继承前版药典的基础上，做了大量发展和创新性的工作。
本版药典具有以下几个特点：一是新增与淘汰并举，收载品种有较大幅度的增加；二是药品检测项目和检测方法增加，标准提高；三是中药标准有突破和创新；四是新版药典在凡例、品种的标准要求、附录的制剂通则等方面均有较大的变化和进步；五是力求覆盖国家基本药物目录品种和社会医疗保险报销药品目录品种。
2010年版《中国药典》在2005年版的基础上，做了大幅度的增修订和新增品种的工作。
本版药典共收载品种4598种，新增1462种。
其中：一部收载品种2136种，新增990种、修订612种；二部收载品种2220种，新增341种、修订1549种；三部收载品种131种，其中新增27种、修订104种。
药用辅料、标准新增130多种。
附录其中药典一部新增14个、修订54个；药典二部新增15个、修订70个；药典三部新增18个、修订38个。
主要特色与2005年版药典相比，新版药典新增加品种总计1358个，总数达到4615个，形成了中药材、中药饮片、中成药、化学药品、药用辅料、生物制品等各类齐全的药品标准体系，基本覆盖国家基本药物目录品种的需要。
新版药典广泛收载国内外先进成熟的检测技术和分析技术，品种标准进一步扩大对新技术的应用使化学药品标准与国际先进水平趋于一致，中药的专属性质量控制方法进一步提高。
杜平华XX年版药典附录无菌检查和微生物限度检查方法增
2010年版无菌检查法增修订内容
杜平华XX年版药典附录无菌检查和 微生物限度检查方法增
一、进一步确定了无菌检查法的定义： 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、医疗器具、
原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。 二、进一步明确了无菌检查保障 1、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ， 但采用的措施不得影响微生物的生长。 2 、无菌检查要进行环境检测增加了日常检验还需进 行环境检测。 2、无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过 无菌技术的培训。
杜平华XXX年版药典附 录无菌检查和微生物限
度检查方法增
2020/11/20
杜平华XX年版药典附录无菌检查和 微生物限度检查方法增
起草的指导思想
一、以科学发展观为统领，服务于资源节约型社会、 环境友好型社会的要求；落实科学监管理念，着 力解决发展中的问题。
二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；坚持自 主与创新；积极推进药品标准化战略，提高我国 药品标准总体水平，着力提升《中国药典》在国 际社会中的地位和作用，提高综合竞争力，促进 医药产业的健康发展，为构建社会主义和谐社会 作出贡献。
杜平华XX年版药典附录无菌检查和 微生物限度检查方法增
⑵培养时间修改内容 除另有规定外，细菌培养48小时
改为3天，霉菌、酵母菌培养72小时 改为 5天，必要时，可适当延长培养 时间至7天进行菌落计数并报告。
杜平华XX年版药典附录无菌检查和 微生物限度检查方法增
菌数报告规则增修订内容 ⒈若同稀释级两个平板的菌落平均数不 小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。 ⒉细菌、酵母菌和霉菌平均菌落数在 30～300 、30～100之间的稀释级修改 为选取菌落数小于300cfu和100cfu的稀 释级作为菌数报告的依据。
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑵ 水不溶性非油脂类供试品
• 取供试品， 用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。 分散力较差的供试品，可在稀释液中加入 表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供 试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供 试液进一步 10倍系列稀释。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
或cm²）。
– 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或
• 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的 总菌落数（包括真菌菌落数）；
• 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
• 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌 和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可 使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡 萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红 钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
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＋ 表示需要验证的参数 － 表示不需要验证的参数
尽管替代方法的验证参数与药
品质量标准分析方法验证参数有相
似之处，但是其具体的内容是依据 微生物检验特点而设立的。替代方
查。
定量试验
测定样品中存在的微生
物数量；如微生物限度检查。
生物试验特殊性
抽样误差
稀释误差
操作误差
培养误差
计量误差
计数误差
由于生物试验的这些特殊
性，都会对检验结果造成影响， 因此，药品质量标准分 析方法验证指导原则（附录 ⅩⅧA）不完全适宜于微生物 替代方法的验证。
表1 不同微生物检验类型验证参数表
方法使用者应优先测定该验证参数。
4、耐用性
与药典方法比较，若替代方法检验条件较 为苛刻，则应在方法中加以说明。 替代方法与药典方法的耐用性比较不是必 须的，但应单独对替代方法的耐用性进行 评价，以便使用者了解方法的关键操作点。
3、重现性
微生物定性检验的重现性 指相同的样品在 正常的实验条件（如实验地点、实验人员、 仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得 检验结果的精密度。
3、重现性
重现性可视为微生物检验方法在检验 结果上抵抗操作和环境变化的能力。
可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗 操作和环境变化的能力。方法使用者应优 先测定该验证参数。
2、检测限
微生物定性检验的检测限 指在替代方 法设定的检验条件下，样品中能被检 出的微生物的最低数量。
2、检测限
由于微生物所具有的特殊性质，检测限是 指在稀释或培养之前初始样品所含有的微 生物数量，而不是指检验过程中某一环节 的供试液中所含有的微生物数量。例如， 微生物限度检查中规定不得检出沙门菌， 对检测限而言，是指每10g 样品中能被检 出的沙门菌的最低数量。
3、重现性
在样品中接种一定数量的试验菌（接种量 应在检测限以上），采用药典方法和替代 方法，分别由不同人员，在不同时间，使 用不同的试剂（或仪器）进行检验，采用 卡方检验（χ 2）来评价两种方法的重现性 是否存在差异。 验证过程中，应关注样品的一致性。
4、耐用参数有 小的刻意变化时，检验结果不受影响的能 力，为方法正常使用时的可靠性提供依据。
法验证的实验结果需进行统计分析。
替代方法属于定性检验时，一般采 用非参数的统计技术。
当替代方法属于定量检验时，需要 采用参数统计技术。
进行微生物替代方法的验证时，若替代 方法只是针对药典方法中的某一环节进行 技术修改，此时，需要验证的对象仅是该 项替代技术而不是整个检验方法。
如：无菌试验若改为使用含培养基的过滤 器，然后通过适宜的技术确认活的微生物 存在，验证时仅需验证所用的微生物回收 系统而不是整个无菌试验方法。
替代方法验证的一般要求
验证应至少使用2 个批号的样品，每批样品 应平行进行至少3 次独立实验。
在开展各参数验证时，涉及的菌种除应包括 微生物限度检查法（附录ⅩⅢ C）和无菌检 查法（附录ⅩⅢ B）中培养基适用性检查规 定的菌株外，还应根据替代方法及样品的特 点增加相应的菌株。各菌种应分别进行验证。
成分的分析技术，如脂肪酸测定技
术、核酸扩增技术、基因指纹分析
技术等。
替代方法特点
简便快速
有实时或近实时监控的潜力，使生
产早期采取纠正措施及监控和指导 优良生产成为可能 促进生产成本降低 促进检验水平的提高。
药品微生物检验方法类型
定性试验
测定样品中是否存在活
的微生物；如无菌检查及控制菌检
药品微生物检验替代方法 验证指导原则
概
述
在控制药品微生物质量中，微生物试 验室出于各种原因如成本、生产量、 快速简便及提高药品质量等需要采用 非药典规定的检验方法（即替代方法） 时，应进行替代方法的验证，确认其 应用效果优于或等同于药典的方法。
概
述
当替代检验方法与药典检验
方法的结论有争议时，以药 典检验方法的结果为准。
替代方法验证的一般要求
在开展替代方法对样品检验的适用性 验证前，有必要对替代方法有一个全 面的了解。首先，所选用的替代方法 应具备必要的方法适用性证据，表明 在不含样品的情况下，替代方法在不 同类型的微生物检验中所具有的专属 性、精密度和检测限等参数。
替代方法验证的一般要求
这些证据或由替代方法的研发者提供， 或由方法使用者完成。 使用者在基本确认替代方法的适用性 后，应采用样品按表1 规定的参数逐 一进行验证，以确认替代方法可否用 于该样品的检验。
2、检测限
检测限确定的方法 在样品中接种较低浓度的试验 菌（每单位不超过5cfu），然后分别采用药典方 法和替代方法对该试验菌进行检验，以检出与否 来比较两种方法的差异。 试验菌的接种量须根据试验而定，以接种后采用 药典方法50％的样品可检出该试验菌为宜。 检测限验证至少应重复进行5 次。对于同一种试 验菌可采用卡方检验（χ 2）来评价两种方法的检 测限是否存在差异。
样品中微生物定性检验方法的验证
1、专属性
微生物定性检验的专属性 指检测样品 中可能存在的特定微生物种类的能力。
1、专属性
当替代方法以微生物生长作为判断微 生物是否存在时，其专属性的验证应 确认所用培养基的促生长试验，还应 考虑样品的存在对检验结果的影响。
1、专属性
当替代方法不是以微生物生长作为判 断指标时，其专属性验证应确认检测 系统中的外来成分不得干扰试验而影 响结果，如确认样品的存在不会对检 验结果造成影响。采用替代方法进行 控制菌的检验，还应选择与控制菌具 有类似特性的菌株作为验证对象。
目
的
为所采用的药品微生物检验的试验
方法能否替代药典规定的方法提供
指导。
药品微生物检验新技术
基于微生物生长信息的检验技术，
如生物发光技术、电化学技术、 比浊法等。
药品微生物检验新技术
直接测定被测介质中的活微生物
的检验技术，如固相细胞技术法、
流式细胞计数法等。
药品微生物检验新技术
基于微生物细胞所含有的特定组成