双歧杆菌实验操作

双歧杆菌的分离与鉴定

一、实验背景

双歧杆菌( Bifidobacterium) 系1899 年巴斯德研究院的Tissier首先在以母乳喂养的婴儿粪便中发现并分离出来[1]。双歧杆菌是人体肠道内重要的益生菌之一，还具有抗肿瘤、抗衰老、营养等作用。双歧杆菌为专性厌氧菌，对营养条件要求苛刻，活性保持相对比较困难。因此，研究一种适宜的分离方法具有现实的意义。为了丰富双歧杆菌菌种资源及开发双杆菌产品，本实验主要是了进行双歧杆菌分离、纯化、生化鉴定以及PCR检测，进行对双歧杆菌的分离与鉴定。

二、实验步骤

（一）材料

1、分离源

母乳喂养的健康婴儿粪便

2、培养基和试剂

TPY培养基、生理盐水、革兰染料（结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红液）、厌氧袋（硼氢化钾、柠檬酸、碳酸氢钠）、生化鉴定试剂管（F6PPK 试验、乳糖、葡萄糖、硫化氢、纤维二糖、棉籽糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖酸盐、木糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜜二糖、甘露醇、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、阿拉伯糖、过氧化氢、联苯胺）、双蒸水、TaKaRa Taq、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5mM)、16sRNA 90916 F、16sRNA 90916 R、3、设备

PCR仪、紫外分光光度仪、凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、恒温培养箱、厌氧罐、无菌操作台、冰箱、显微镜、接种环等微生物实验室所需的常规设备。（二）实验内容

1、样品的采集与处理

（1）用灭菌棉签取母乳喂养的健康婴儿的粪便约l g，放入装有9ml生理盐水的无菌试管中，充分振荡摇匀，做成1∶10 的均匀稀释液。另取1 mL 灭菌的移液管吸取1∶10 的稀释液注入到灭过菌的含有9 mL生理盐水的试管中，充分振荡摇匀，做成1∶100 的均匀稀释液。按上述操作顺序，依次做成1×10- 3～1×10- 7 梯度的均匀稀释液。

（2）分别取1×10- 1~1×10- 7 梯度的均匀稀释液在TPY培养基平板上进行划线分离（预实验），37℃厌氧培养24~48h观察哪几个梯度的双歧杆菌分离的比较好，然后进行试验。（例如1×10- 5~1×10- 7 )

3、分离培养

用接种环取a、b、c三种梯度的稀释液中的双歧杆菌进行TPY培养基平板划线分

离，每个梯度的稀释液划2块平皿，并做空白对照。37℃厌氧培养24~48h。

4、革兰染色和镜检

双歧杆菌经24~48h 培养后多数形成直径为0.5 ~ 1mm、凸起、边缘整齐、乳白色或灰白色不透明的菌落，菌体宽约0.5μm，长度在1~6μm 之间，有弯曲和分叉现象，形成双歧杆菌特有的“V”或“Y”结构[1]。挑选平板上菌落较小、光滑、凸圆、边缘整齐、白色或乳白色不透明、质地柔软的特征菌落[2]，取菌落的一半进行涂片，然后进行革兰氏染色，如果挑选的菌落是革兰氏阳性、显微镜下具有双歧杆菌形态特征，如菌体形状不太规则，呈弧形、两端大小不一、V 形或Y 形的菌落，那么取菌落的另一半进行划线平板分离培养，再革兰染色和镜检。重复上述实验2~3次，直至出现分离出纯净的单个菌落。

5、生化鉴定

取分离纯化的双歧杆菌菌落，分别接种在以上几种生化鉴定试剂管内，并用液态石蜡油封口，观察其反应结果。

6、PCR法检测

从步骤4中分离出来的纯净单菌落进行大面积的一区划线，37℃厌氧培养24~48h。取培养好的双歧杆菌接种到装有双蒸水的离心管中，摇匀，离心5 000 r/min,5 min, 弃上清, 用双蒸水重悬后同上离心, 双蒸水再次重悬, 煮沸15 min, 离心12 000 r/min, 5 min，取上清,即DNA。配置PCR扩增体系：10×PCR Buffer(Mg2+Plus)15μl、TaKaRa Taq0.75μl、dNTP Mixture(各2.5mM)12μl、16sRNA 90916 F3μl、16sRNA 90916 R3μl、双蒸水111.75 μl，各成分依次加入到灭菌2 ml 离心管中（超净台内操作），离心10s.同时以装有49ul体系、1ul双蒸水无菌离心管作为阴性对照。将配制好的PCR体系放置于PCR仪中进行扩增。PCR 循环参数及扩增条件: 94 ℃预变性5 min, 30 个循环( 94℃ 30s, 53℃ 30s, 72 ℃ 90s) , 72℃延伸8 min。将5 ul的6×Loading Buffer 和1ul的PCR产物充分混合均匀，注入到凝胶孔中，同时在注入4 ul 1 kb marker。电泳30 min，置于全自动凝胶成像分析系统下，观察处理得到的条带。

三、实验结果

双歧杆菌特征

样品稀释

度菌

数

菌落特征个体特征颜色边缘大小透明度高度形状革兰染色

1×10- 5（a）1×10- 5（b）1×10- 6（a）1×10- 6（b）

双歧杆菌生化鉴定结果

菌种 项目 1×10- 5（a ） 1×10- 5（b ） 1×10- 6（a ） 1×10- 6（b ） 1×10- 7（a ） 1×10- 7（b ） 对照组

阿拉伯糖 乳糖 纤维二糖 棉籽糖 山梨醇 淀粉 葡萄糖酸盐 木糖 甘露糖 蔗糖 麦芽糖 海藻糖 蜜二糖 甘露醇 吲哚 硝酸盐还原 明胶液化 硫化氢 过氧化氢 联苯胺 F6PPK

文献：

[ 1] James A, et al. Bifido bo uteria [ J] . Bacter olo gical River s, 1973, 48: 136～142 [ 2] 王建业,王永坤,朱国强.猪源双歧杆菌筛选及生物特性参数测定[J].扬州大学学报(自然科学版),2000,3(3):23-27

1×10- 7（a ） 1×10- 7（b ） 对照组

[ 3]文钰，杨汝德，猪源双歧杆菌的分离纯化及初步鉴定[J].现代食品科技

[ 4]Wei G,Pan L,Du H, et al.ERIC-PCR fingerprinting-based community DNA hybridization to pinpoint genome-specific fragmenta as molecular markera to identify and track populations common to healthy human guts.J Microbiol,2004,59(1):91-108.

[5]Satokari R M.Vaughan E E,Akkermans A,et al.Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel eletrophoresis.Appl Environ Microbiol,2001,67(2):504-513.

[6]胡晓红, 彭惠民, 刘昕, 黄正根, 袁科,PCR 及Real- time PCR 评价细菌DNA 提取方法[J].重庆医科大学学报2008年第33卷第2期