siRNA
sirna退火原理
sirna退火原理
siRNA（small interfering RNA）是一种短小的RNA分子，可
以通过干涉RNA的方式抑制特定基因的表达。
siRNA退火是指siRNA
分子与靶标RNA结合的过程。
当siRNA与靶标RNA结合后，siRNA
会通过RNA诱导靶标RNA降解的机制来抑制靶标RNA的翻译和表达。
siRNA退火的原理涉及到siRNA与靶标RNA的互补配对。
siRNA
分子通常由两个链组成，即导引链和反义链。
导引链与靶标RNA的
序列完全互补，而反义链与导引链相互互补。
当siRNA与靶标RNA
结合时，导引链会与靶标RNA的序列互补配对，形成双链RNA复合物。
这种双链RNA复合物会被RNA内切酶Dicer切割成短小的
siRNA片段，然后siRNA片段会与RNA诱导靶标RNA降解复合物
RISC（RNA-induced silencing complex）结合。
RISC会将siRNA
引导到靶标RNA上，并通过其内在的核酶活性将靶标RNA分解成短
小的片段，从而抑制靶标RNA的翻译和表达。
siRNA退火的过程是一个高度特异的过程，siRNA只会与特定的
靶标RNA结合，并且通过RNA诱导靶标RNA降解的机制来抑制靶标RNA的表达。
这种特异性使siRNA成为一种非常有前景的基因沉默
工具，可以用于研究基因功能、药物研发以及治疗基因相关疾病等
领域。
在实际应用中，科学家们可以利用siRNA退火的原理来设计和合成特定的siRNA分子，以实现对特定基因的沉默和调控。
这种技术对于研究基因功能和开发基因治疗具有重要意义。
sirna原理
sirna原理SiRNA原理。
SiRNA（small interfering RNA）是一种短小的RNA分子，它能够靶向特定的mRNA分子，并导致其降解，从而抑制该mRNA所编码的蛋白质的合成。
SiRNA技术已经成为基因沉默和功能基因组学研究中的重要工具，也在RNA干扰（RNA interference, RNAi）疗法中展现出巨大的潜力。
SiRNA的原理和应用对于理解基因调控机制、疾病治疗和生物技术的发展具有重要意义。
SiRNA的原理基于RNA干扰（RNAi）的机制。
RNAi是一种在真核生物中普遍存在的基因沉默机制，它通过RNA分子的干扰来调控基因表达。
SiRNA是RNAi的重要介质，它由约21-23个碱基组成，其中包含两个对称的3'端过度，这些过度使得SiRNA能够与RNA诱导的靶向基因特异性结合。
SiRNA主要分为双链SiRNA和单链SiRNA两种形式，它们都能够通过RNAi途径介导基因沉默。
SiRNA的作用机制主要分为两个步骤，第一步是SiRNA的引导作用，SiRNA与RISC（RNA-induced silencing complex）结合形成RISC-SiRNA复合物，RISC-SiRNA复合物能够识别和结合靶向mRNA，形成RISC-SiRNA-mRNA三联物。
第二步是靶向mRNA的降解，RISC-SiRNA-mRNA三联物导致靶向mRNA的特异性降解，从而抑制该mRNA 所编码的蛋白质的合成。
SiRNA技术的应用涵盖了基础研究、药物研发和治疗等多个领域。
在基因功能研究中，SiRNA可用于特定基因的沉默，从而揭示其在生物学过程中的作用。
在疾病治疗方面，SiRNA可针对特定的疾病相关基因进行沉默，为基因治疗提供新的途径。
此外，SiRNA 技术还在农业生物技术和生物制药领域有着广泛的应用前景。
总之，SiRNA作为一种重要的基因沉默技术，其原理和应用对于基因调控机制的研究和疾病治疗具有重要意义。
siRNA与癌症治疗
04
的最新进展
针对特定癌症类型的最新研究
肺癌
研究显示，sirna可靶向肺癌细胞中的致癌基因， 抑制其表达，从而抑制肿瘤生长。
乳腺癌
sirna被用于沉默乳腺癌细胞中致癌基因的表达， 降低肿瘤细胞的增殖和转移能力。
结直肠癌
sirna被用于抑制结直肠癌细胞中致癌基因的表达， 降低肿瘤细胞的生长和扩散。
联合治疗策略的探索
特性
sirna具有高度的特异性，能够针对特定的基因进行调控。此外，sirna还具有稳 定性、易于合成和低毒性的特点，使其成为一种有前途的生物治疗手段。
SIRNA的作用机制
识别
sirna通过碱基配对与mRNA结合，特异性地识别并 抑制特定基因的表达。
沉默
sirna与mRNA结合后，引发rna降解，从而在转录后 水平抑制特定基因的表达。
胞的抗原表达，增强肿瘤细胞对免疫细胞的识别和杀伤敏感性。
SIRNA在癌症治疗中
03
的挑战和前景
克服生物屏障
稳定性和保护
在体内环境中，sirna容易受到核酸酶的降解，因此需要采 取措施来保护sirna不被降解。
穿透细胞膜
sirna需要通过细胞膜才能进入细胞，但细胞膜对sirna的通透 性较低，因此需要寻找有效的方法来提高sirna的细胞膜穿透能
调节
sirna可以调节细胞内多种基因的表达，包括致癌基因 和抑癌基因，因此对癌症治疗具有重要意义。
SIRNA的优点和局限性
优点
sirna具有高度的特异性，能够针对 特定的基因进行调控；同时，sirna 还具有稳定性、易于合成和低毒性的 特点。
局限性
sirna的作用机制较为复杂，目前对其 作用机制的理解尚不完全；此外， sirna的体内稳定性、细胞摄取率和靶 向特异性等方面仍需进一步改进。
sirna的表示方法
sirna的表示方法
siRNA是小干扰RNA的缩写，是一种双链RNA分子，通常由21
到23个核苷酸组成。
siRNA的主要作用是通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）途径来抑制特定基因的表达。
siRNA的制备
可以通过化学合成或者在细胞内通过转录后加工而得到。
在化学合
成siRNA的过程中，通常采用化学合成技术合成两条互补的RNA链，然后通过退火和再结晶来形成双链结构。
而在细胞内，siRNA通常
是由长的双链RNA分子在细胞内通过核酸酶Dicer的作用切割而得到。
siRNA分子的两条链分别被称为“sense strand”和
“antisense strand”，它们通过RNA诱导靶向基因沉默的机制来
发挥作用。
在细胞内，siRNA与RNA诱导靶向基因沉默复合物（RISC）结合，然后通过靶向特定mRNA分子来诱导降解或者抑制翻译，从而实现对特定基因的沉默。
siRNA在基因沉默和基因表达调控研究中具有重要的应用价值。
通过设计特异性的siRNA序列，可以实现对特定基因的靶向沉默，
从而研究该基因的功能及其在疾病发生发展中的作用。
此外，siRNA
还可以作为治疗手段，例如在癌症治疗中，可以设计siRNA靶向癌
细胞中的特定基因，实现对癌细胞的沉默，从而达到治疗的效果。
总的来说，siRNA是一种重要的分子工具，具有在基因沉默和基因表达调控研究中应用广泛的潜力，也在疾病治疗领域有着重要的临床应用前景。
sirna是什么意思
sirna是什么意思
siRNA指的是小干扰RNA。
小干扰RNA有时称为短干扰RNA或沉默RN，是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。
已知siRNA主要参与RNA干扰现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。
此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径。
扩展资料：
siRNA具有明确定义的结构，具有磷酸化5'末端的短双链RNA和具有两个突出核苷酸的羟基化3'末端。
该切酶酶催化生产的siRNA由长的dsRNA和小发夹RNA。
由于原则上任何基因都可以被具有互补序列的合成siRNA敲低，因此siRNA是在后基因组时代验证基因功能和药物靶向的重要工具。
siRNA 使用说明
siRNA 使用说明siRNA 使用说明一、简介siRNA（small interfering RNA，小干扰RNA）是一种短双链RNA分子，能够特异性地靶向靶标基因的mRNA，从而抑制基因的表达。
本文档旨在提供有关siRNA的使用说明，包括实验准备、转染方法、验证转染效果等内容。
二、实验准备1、设计siRNA序列：根据目标基因序列，使用专业软件设计siRNA序列，确保合适的靶向位点和抑制效果。
2、合成siRNA：选取可靠的siRNA合成公司，按照其提供的合成方案进行合成，并确保纯度和浓度的准确性。
3、存储siRNA：将合成好的siRNA按照要求进行冻干或溶解保存，避免反复冻融对siRNA的影响。
三、细胞培养1、细胞系选择：选择适合的细胞系进行实验，一般常用的细胞系有HEK-293、HeLa、CHO等。
2、培养条件：按照细胞系的要求，配置好适合的培养基，并添加适当的血清和抗生素。
3、培养状态：维持细胞在良好的状态下生长，保持培养皿内细胞的完整和无菌。
四、siRNA转染1、转染试剂选择：根据不同细胞系的特点，选择适合的转染试剂，如RNMAX、Lipofectamine等。
2、转染条件优化：通过实验室预实验，优化转染试剂的用量、培养时间和上清液收集时间等参数。
3、转染操作步骤：a：将siRNA转染试剂溶解于无血清的培养基中，按照转染试剂说明书的推荐比例进行稀释。
b：将稀释后的转染试剂静置15-30分钟，直至形成转染试剂- siRNA复合物。
c：将复合物滴加到细胞培养皿中，保持培养皿在37°C的培养箱中进行适当的培养时间。
d：收集转染后的上清液，进行进一步的实验。
五、转染效果验证1、Real-time PCR：使用逆转录酶和合适的引物进行实时荧光定量PCR，检测目标基因表达水平的变化。
2、Western blot：通过Western blot实验检测目标蛋白的表达水平是否下调。
3、免疫荧光染色：利用免疫荧光染色技术观察目标蛋白在细胞中的表达情况。
sirna干扰原理
sirna干扰原理
sirna是small interfering RNA的缩写，是一种功能性RNA分子，通过降解或抑制特定基因的表达来干扰基因功能。
sirna
干扰的原理主要包括三个步骤：
1. 制备sirna：sirna是由21-23个核苷酸组成的小分子RNA，
可以由体内或体外合成。
通常使用合成的单链RNA，并使用
特定酶进行降解，获得双链sirna分子。
2. 靶向特异性基因：为了使sirna能够特异性地干扰目标基因，需要对目标基因进行序列特异性设计。
sirna的两个链，即导
引链和非导引链，会与靶基因的mRNA序列互补配对。
3. RNA干扰效应：当sirna与靶基因的mRNA配对后，可以
通过两种方式干扰目标基因的功能。
- 解旋和降解：sirna可以与RNA诱导的靶基因降解酶（RISC）结合，形成RNA酶复合体。
该复合体能够通过降解
靶基因的mRNA分子，从而阻止靶基因的翻译和表达。
- 抑制翻译：sirna也可以通过与靶基因的mRNA配对，阻止
其翻译为蛋白质。
sirna结合到mRNA上后，可以阻断转录过
程中的酶或蛋白质结合，从而抑制翻译的进行。
总结来说，sirna干扰的原理是通过合成特异性的小分子RNA，与靶基因的mRNA相互作用，从而降解或抑制目标基因的表
达。
这一技术在基因功能研究和治疗疾病中具有广泛应用的潜力。
siRNA的名词解释
siRNA的名词解释siRNA（short interfering RNA），也称为短干扰RNA，是一种短小的双链RNA分子，通常由21到23个碱基对组成。
与其它类型的RNA分子不同，siRNA在细胞内发挥着关键的调控作用。
在过去的几十年里，科学家对siRNA进行了广泛的研究，并且已经发现了许多关于siRNA的重要发现。
1. siRNA的发现和起源siRNA最早是在1998年由美国的科学家发现的。
当时，他们发现引入双链RNA分子到寄生虫的细胞中，能够抑制特定基因的表达。
这个发现引起了科学界的广泛关注，并且开创了RNA干扰研究的新领域。
之后的研究表明，siRNA并不仅存在于寄生虫中，而且在许多其他的生物中也有广泛存在。
这些研究揭示了siRNA起源的普遍性和重要性。
2. siRNA的作用机制siRNA发挥作用的机制可以分为两个阶段：siRNA的合成和siRNA的靶向降解。
首先，siRNA通过一个复杂的合成过程来产生。
通常，siRNA是由一种酶（Dicer 酶）切割长的双链RNA前体，形成短双链RNA。
然后，短双链RNA被一个蛋白质复合体（RNA诱导沉默复合体）识别。
该复合体将siRNA中的其中一个链条加载到复合体中，并将其用作导向靶标基因降解的模板。
一旦siRNA和复合体形成，它们会与目标mRNA相互作用。
通常情况下，siRNA与mRNA的特定部位产生互补配对，形成siRNA-mRNA复合体。
这个复合体随后会被其他蛋白质复合体（RNase H和Exonuclease）识别和降解，以此来抑制目标mRNA的翻译和功能。
通过这种机制，siRNA能够选择性地沉默或抑制目标基因的表达。
这使得siRNA成为一种非常有潜力的生物分子工具，在基因功能研究、疾病治疗和生物技术应用等方面有着广泛的应用前景。
3. siRNA在基因功能研究中的应用由于siRNA能够有效地沉默特定基因，它被广泛应用于基因功能研究中。
科学家可以设计并合成特定的siRNA分子，用于沉默感兴趣的基因。
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siRNA的扩增
依赖RNA聚合酶（ RDRP）
缺少保护mRNA的结合蛋白时， RDRP结合mRNA，
并以其为模板，扩增出双链RNA，经Dicer切割等步骤 产生siRNA（见P336图8-45-b）
mRNA的结合蛋白完好时，将体内与之配对的siRNA
作为扩增引物，以mRNA 为模板，扩增出双链RNA， 经Dicer切割等步骤产生siRNA （见P336图8-45-c）
siRNA
加工长链 dsRNA形成 21-23 nt 小片段
Dicer 结构(P334图)
1.两个RNase Ⅲ结构域：形成二聚体结构，各催化 剪切一条链，产生双链断裂。 2.PAZ结构域:结合双链RNA的3 ˊ端2个不配对 的核苷酸。 3.双链RNA结合域，解旋酶结构域等
（2）R2D2的装配（P333图）
A control: not stained B: wt C: wt + antisense RNA D: wt + ds RNA
Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization
1999年，Hamilton（汉米尔顿）等首次在PTGS植株中发现 了长度为25nt的RNA中间产物。
2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（Craig C. Mello） 由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。
siRNA 结构
二、siRNA的生物合成
步骤：
Dicer将dsRNA切割成siRNA
组装复合物 形成有活性的沉默复合体RISC
(1)Dicer 切割
long dsRNA
3.基因治疗（抗病毒、抗肿瘤治疗）
RNAi能使目标蛋白的mRNA发生特异性降解，它具有抵抗病毒入 侵，抑制转座子活动；可以抑制肿瘤的生长。 【1】基因治疗的一种新的方式 【2】特异性的破坏治病性的病毒RNA，如HIV和HBV等 【3】特异性的下调与癌症发生相关的基因的表达量——抑制癌症
4.新药物的研究与开发 RNAi可以作为寻找新的药物靶标的工具，可 以高通量地对发现的药物靶基因做功能分析，可 以帮助了解药物作用的生化模式等等。
AGO结构（P334图）
1.PAZ结构域：与siRNA3’-端露出的两个核苷酸结 合。
2.MID结构域：结合siRNA5’-端。
3.PIWI结构域：催化活性部位，可催化剪切RNA.
三、
转录后水平mRNA的降解
转录水平siRNA介导的基因沉默
转录后水平mRNA的降解
dsRNA的剪切
RISC的形成
反义RNA技术-----是借助基因重组技术，根 据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成 的特定RNA片段(或其化学修饰物)抑制或封 闭基因表达的技术。
1998年，Andrew Fire（安德鲁.法尔）等首次将正义链反义链
RNA混合注入线虫C.elegans（秀丽隐杆线虫）中，观察到更强
的基因表达抑制。首次提出了RNA interference的概念。由此， 在2006年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
1995年，Guo（郭）和Kemphues（康费斯）在线虫中 也发现了RNA干扰现象
1. 1995年， Su Guo（郭苏） and Kenneth J. Kemphues（康费斯），做了反义RNA阻断线 虫基因表达的试验 2. 发现利用反义RNA技术阻断线虫中的par-1 基因。在对照实验中给线虫注射正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 3. 然而，正义RNA和反义RNA都能够有 效地抑制基因的表达！
2000年，Zamore（萨莫勒）和Hammond（哈蒙德）等使用 体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA通过耗 能过程降解成21-23nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）引发RNAi。
2000年，Wianny（维尼）和Svoboda （斯沃博达）等分别 证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。
R2D2蛋白与Dicer 形成异源二聚体， Dicer/R2D2/siRNA三者形成RISC装载复合物
（3）RISC的装配和成熟
AGO蛋白与Dicer交换，结合到siRNA的一端，然后 与R2D2交换，将整个siRNA装载到AGO中，此时， 将乘客链降解，形成有活性的沉默复合物（RNA induced silence complex,RISC）
2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA可在避免激活dsRNA 依赖的蛋白激酶(dsRNA-dependent protein kinase，PKR） 和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylate synthetase，2',5'-OAS)信号转导途径的同时，有效抑制 人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的 表达。 2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小 发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体 pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳 动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因 治疗研究奠定了基础。
共抑制现象
因为外源性导入基因和内源性具有相似功能基因序列，存在同源 性，内源基因的表达受到抑制的现象。
1992年，罗马诺（Romano）和Macino（马奇诺）也在 粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列 的内源基因的表达[1]。
Macino G, Romano N．Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences：Mol Microbiol，1992
5.在基础研究中的应用
【1】反向遗传学的手段，gene knock-down 【2】基因功能的鉴定
siRNA
Small interfering RNA
干扰小RNA
siRNA的定义
1. RNA干扰（RNA interference,RNAi)：生物体内 通过双链RNA分子在mRNA水平上诱导具有特异性序列 的基因沉默的过程. 2.而今将统一介导这种沉默现象的小片段RNA称为干扰 小RNA（small interfering RNA,siRNA)
siRNA介导的RISC 对mRNA 的剪切作用
siRNA介导的RISC 对mRNA的剪切作用
通常siRNA的第2~8个核苷酸 与靶mRNA特异性配对
长约10个核苷酸的mRNA— siRNA配对物位于PIWI功能 域，切割往往发生在第9、10 个核苷酸上，由PIWI催化将 靶mRNA切断，并使切断的 mRNA离开RISC，再通过细 胞外切酶进一步降解mRNA
RNAi的研究历程
一、siRNA的发现
1. 1990年，Rich Jorgensen将由强启动子控制的 Chalcone synthase gene转入淡紫色的矮牵牛花 > 加深紫色 2. Hypopigmentation: 许多花出现杂色，甚至紫 色消失，变成白色 3. Co-suppression----共抑制 当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外 来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑 制”。
转录水平siRNA介导的基因沉默
由siRNA介导的组蛋白甲基化、DNA甲基化
将导致染色体相应区域的异染色质化或基因 沉默
DNA甲基化、组蛋白甲基化
siRNA是一些甲基化转移酶活化的起始信号, 在siRNA
的作用下, 甲基化转移酶使DNA 序列中的胞嘧啶-鸟嘌 呤核苷酸连续区（CG岛） 、CNG (N: A /T /C /G) 、 CHH (H: A /C /T)中的胞嘧啶核苷C 和组蛋白H3K9)发 生甲基化, 基因表达为此而受到抑制
异染色质的形成
异染色质区域的典型标志是组蛋白H3K9的甲基化。 s iRNA 通过RNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用将
组蛋白甲基化转移酶募集到染色质的相应区域，将组 蛋白H 3K9 甲基化
四、siRNA 的应用 1.研究信号传导通路的新途径 联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术 可以很容易的确定复杂的信号传导途径中不同基 因的上下游关系。 2.基因功能研究的有力工具 人类基因测序已经完成，后期任务是研究 蛋白质组学，分析基因功能的表达。研究表明 RNAi能在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表 达，制作多种表型，产生多种类似基因敲出的效 应。