5.3血红蛋白的提取与分离

的有效方法。
（2）材料：凝胶 凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。 内部有许多贯穿的通道。
（3）原理—分子筛效应
大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。
2.电泳 （1）概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 （2）原理：利用了待分离样品中各分子带电性质的 差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分 子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子 的分离。 （3）类型：琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳 （4）实例：SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳 原理：SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物， SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷 量，使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。 用途：测定蛋白质的分子量 鉴定蛋白质的纯度
。
。
③充分搅拌的目的是 加速红细胞的破裂
。
3.分离血红蛋白 离心分层；滤纸过滤去除脂 溶性沉淀层；分液漏斗分出 红色透明液体
观察你处理的血液样品离心后是否分层。 如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血 浆蛋白的原因。 离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞 一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红 蛋白的提取纯度。
39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.3
思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？ 它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细 胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能， 便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）。
二.实验操作
（一）样品处理及粗分离 （二）纯化 （三）纯度鉴定 （一）样品处理及粗提取 1.红细胞的洗涤 2.血红蛋白的释放 3.分离血红蛋白溶液 4.透析除去分子较小的杂质
1.凝胶色谱柱的制作
2.凝胶色谱柱的装填
步骤 ① 操作要求
操作要求 色谱柱垂直固定在支架上
② ③ ④
计算称量凝胶 配制悬浮液 装填悬浮液
根据色谱柱体积计算凝胶用量
凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀 凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴
一次性缓慢倒入；轻轻敲打
立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h
⑤ 缓冲液洗涤平衡
你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱 装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝 胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是 否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物 质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色 带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明 凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是 气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重 新装柱。
测定蛋白质的分子量 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分 子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进 行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位 置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可 以测定未知蛋白质的分子量。
（三）缓冲溶液 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4 1.作用
课题3 血红蛋白的提取和分离
一.基础知识
（一）蛋白质提取和分离的原理
根据蛋白质各种特性的差异：
•分子的形状、大小
Hale Waihona Puke •电荷性质和多少•溶解度 •吸附性质 •对其他分子亲和力
（二）蛋白质提取和分离的方法
1.凝胶色谱法：又称分配色谱法 2.电泳法
1.凝胶色谱法(分配色谱法) （1）概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质
7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
0.2mol/L Na2HPO4 （mL）
0.2mol/L NaH2PO4 （mL）
8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0
92.0 87.7 81.5 73.5 62.5 51.0
61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7
抵制外界的酸或碱对溶液pH值的影响，维持pH基本不变。
2.配制
通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。
pH
5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8
0.2mol/L Na2HPO4 （mL）
0.2mol/L NaH2PO4 （mL）
pH
1.洗涤红细胞
洗涤过程：
3g柠檬酸钠 吸出血浆 5倍体积生理盐水
血液 低速离心2min 血浆 100mL 红细胞
红细胞
搅拌10min 重复洗涤3次，直至 上清液没有黄色
洗涤的目的是什么？ 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。
2.释放血红蛋白 ①加蒸馏水的作用是 使红细胞大量吸水胀裂
②加入甲苯的作用是 溶解红细胞的细胞膜
4.粗分离——透析 ①过程 取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋 放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸 缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 ②目的
除去样品中分子量较小的杂质
（二）纯化——凝胶色谱法 1.凝胶色谱柱的制作 2.凝胶色谱柱的装填 3.样品的加入和洗脱
3.样品加入与洗脱
注意：正确的加样操作 （1）不要触及和破坏凝胶面 （2）贴壁加样 （3）使吸管管口沿管壁环绕移动。
你能观察到蛋白质的分离过程中，红 色区带的移动吗？请描述红色区带的 移动情况，并据此判断分离效果？
如果凝胶色谱柱装填得很成功、 分离操作也正确的话，能清楚地看 到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、 平整，随着洗脱液缓慢流出；如果 红色区带歪曲、散乱、变宽，说明 分离的效果不好，这与凝胶色谱柱 的装填有关。