实验讲义-分光光度法测量溶液中色素含量
叶绿素含量的测定分光光度法
叶绿素含量的测定分光光度法叶绿素是植物和一些原生生物中重要的光合色素之一，它在光合作用中起到接收和转换光能的关键作用。
测定叶绿素含量可以帮助我们了解植物的光合效率和健康状况，以及研究光合作用的机制和调控。
分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法，本文将介绍该方法的原理、实验步骤和数据分析。
一、原理分光光度法测定叶绿素含量的原理是基于叶绿素对光的吸收特性。
叶绿素分子可以吸收特定波长的光，特别是蓝光和红光，而对绿光的吸收较弱。
利用分光光度计测量叶绿素溶液在不同波长的光下的吸光度，可以通过比较吸光度与叶绿素浓度的标准曲线，计算出待测样品中叶绿素的含量。
二、实验步骤1. 制备叶绿素提取液：将适量的鲜叶片（去除茎和大的叶脉）放入离心管中，加入少量酒精，并用研钵捣碎，使叶绿素释放到酒精中。
然后用酒精将研钵中的残渣洗入离心管中，最后用酒精将叶绿素完全溶解。
注意，酒精的使用要避免火源。
2. 离心沉淀：将叶绿素提取液离心10分钟，以沉淀残渣和悬浮物。
3. 分光光度计测量：取离心后的叶绿素提取液，用分光光度计在特定波长下（如645 nm和663 nm）测量其吸光度。
记录吸光度值。
4. 制备标准曲线：取不同浓度的叶绿素标准溶液，用同样的方法测量其吸光度，记录吸光度值。
5. 计算叶绿素含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。
三、数据分析1. 标准曲线的绘制：将各个标准溶液的叶绿素浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制曲线。
利用标准曲线可以通过待测样品的吸光度值，反推出其叶绿素的浓度。
2. 计算待测样品中叶绿素的含量：根据标准曲线，将待测样品的吸光度值代入，通过计算叶绿素浓度的公式，得出叶绿素的含量。
四、注意事项1. 实验中应尽量避免阳光直射，以免光线对实验结果的干扰。
2. 操作时应注意安全，避免酒精接触到火源。
3. 叶绿素提取液的制备应充分溶解，避免残渣和悬浮物的影响。
分光光度法测定多组分色素含量综合设计实验研究
分光光度法测定多组分色素含量综合设计实验研究分光光度法是一种用于化学分析的常见方法，利用物质吸收光的特性，通过测量吸收光的强度来确定物质的浓度。
在色谱分析领域，分光光度法也被广泛应用于测定多组分色素含量。
本研究旨在设计一种综合实验，通过分光光度法测定多组分色素含量，以探究不同色素在不同波长下的吸收特性，并分析其含量。
实验设计如下：1.实验材料和仪器实验所需材料包括不同色素溶液（如红色素、蓝色素、黄色素等）、溶剂（如乙醇或水）、标准物质用于建立标准曲线等。
实验所需仪器包括分光光度计、比色皿、移液器等。
2.样品制备将不同色素样品加入适量溶剂中，制备各种浓度的色素溶液。
分别称取适量样品溶液进入比色皿中，作为吸光度测定的标准溶液。
3.建立标准曲线在分光光度计上选择各种不同波长进行测定。
分别测定标准溶液在不同波长下的吸光度，并绘制吸光度与浓度的标准曲线。
4.样品测定将待测色素溶液加入比色皿中，在所选择的波长下测定其吸光度。
通过已建立的标准曲线，计算出待测样品中各种色素的含量。
5.数据处理和分析根据实验结果，分析不同色素在不同波长下的吸收特性，计算各色素的含量，比较不同色素的含量差异。
通过以上实验设计，可以研究多组分色素的含量，并了解不同色素在光谱上的吸收特性。
同时，通过建立标准曲线和测量待测样品的吸光度，可以准确地计算出各色素的含量，从而达到定量测定的目的。
这种综合设计实验不仅可以提高学生对分光光度法的理解和应用能力，还可以培养他们的实验操作技能和数据处理能力。
总之，通过分光光度法测定多组分色素含量的实验研究，可以深入了解色素分析的原理和方法，为进一步研究和应用色素提供基础数据支持。
希望本研究能够对相关领域的教学和科研工作有所启发和促进。
分光光度法测定饮料中色素含量
分光光度法测定饮料中色素含量随着人们对食品安全的日益提高，饮料中色素含量的测定变得越来越重要。
色素是一种人工添加物，用于改善食品的色泽，但过量的色素对人体健康可能造成不良影响。
因此，建立准确、可靠的测定方法十分必要。
本文将介绍一种测定饮料中色素含量的方法——分光光度法。
分光光度法是一种通过分析物质对不同波长光的吸收特性来测定物质浓度的方法。
在饮料中色素含量的测定中，分光光度法具有精度高、操作简便、快速等优点。
其基本原理是，当一束光通过溶液时，溶液中的物质会吸收一定波长的光，吸收的多少与物质的浓度成正比。
通过测量溶液对不同波长光的吸收情况，可以计算出溶液中色素的含量。
试剂：无水乙醇、盐酸-乙醇、蒸馏水、二氧化钛标准品实验步骤试剂准备：将二氧化钛标准品用无水乙醇配制成一定浓度的溶液，备用。
样品处理：将瓶装饮料进行离心分离，取上清液备用。
稀释：用盐酸-乙醇将上清液稀释至适宜浓度。
测量： a.将稀释后的溶液放入1cm的石英比色皿中。
b.用分光光度计在400-700nm波长范围内扫描，记录吸光度值。
c.将二氧化钛标准品溶液调节至与样品溶液浓度相近，测量其吸光度值。
d.根据标准品溶液的吸光度值，绘制标准曲线。
e.根据样品溶液的吸光度值，从标准曲线上查得其对应的色素浓度。
通过分光光度法，我们成功测定了市售瓶装饮料中的色素含量。
数据如下表所示：根据数据，我们发现不同饮料中的色素含量存在差异。
其中，果汁饮料B的色素含量最高，运动饮料D次之，果汁饮料A和碳酸饮料C的色素含量相对较低。
这与不同类型饮料的实际生产过程中添加的色素量相符。
通过绘制标准曲线，我们发现吸光度值与色素浓度之间存在良好的线性关系（R²>99），这为快速、准确地测定饮料中的色素含量提供了依据。
分光光度法作为一种经典且实用的分析方法，在测定饮料中色素含量方面具有重要应用价值。
本实验通过简单易行的操作流程和精确可靠的数据处理方式，成功测定了市售瓶装饮料中的色素含量。
分光光度法测定饮料中色素含量-四川理工学院学报
图２ 、 图 ３分别为柠檬黄和胭脂红的标准曲线， 由标 准曲线可知柠檬黄、 胭脂红 回 归 曲 线 方 程 分 别 为 ｙ＝ ３ ６ ０ ７ ｘ － ０ ０ １ ４ ２ ， ｙ＝３ １ ９ ５ ｘ ＋ ０ ０ ２ ９ ６ ， 由回归曲线斜率
１ 浓度 ／ ｍ ｇ · ｍ Ｌ ０ ０ １ ５
０ ０ ２ ０ ０ ６ ７ ２ ８ ０ １ ９ ０ ８
０ ０ ３ ０ ０ ９ ８ ９ ７ ０ ２ ８ ４ ６
ａ １ ／ Ｌ · ｇ· ｃ ｍ
１
４ ˑ １ ０ ε １ １ ／ Ｌ · ｍ ｏ ｌ · ｃ ｍ
１ １ ４ １ １ 收系数为 ３ ２ ２ ２Ｌ · ｇ · ｃ ｍ ， 摩尔吸收系数为 １ ７ ２ˑ １ ０ Ｌ · ｍ ｏ ｌ · ｃ ｍ ； 胭脂红的最大吸收波长为５ ０ ７ｎ ｍ ， １ １ ４ １ １ ５ ９ ２Ｌ · ｇ · ｃ ｍ ， 摩尔吸收系数为 ２ １ ７ˑ １ ０ Ｌ · ｍ ｏ ｌ · ｃ ｍ 。测定饮料中柠檬黄和胭脂红的 吸收系数为 ３ ３ １ ３ １ 含量分别为 ４ ３ ２ˑ １ ０ ｍ ｇ · ｍ Ｌ 、 ３ ３ ６ˑ １ ０ ｍ ｇ · ｍ Ｌ ， 相对标准偏差分别为 ２ ８ ９ ％、 ２ ５ ７ ％， 加标回收率
、 伏安法
［ ５ ］
、 示波极谱法
［ ６ ］
、
７ ］ ８ ］ 偏最小二乘法 － 分光光度法 ［ 、 紫外可见吸收光谱法 ［
叶绿素含量的测定标准
叶绿素含量的测定标准可以根据不同的方法来确定。
其中，分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法。
该方法基于叶绿素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在特定波长下测定其吸光度，然后根据朗伯-比尔定律计算出提取液中各色素的含量。
以下是使用分光光度法测定叶绿素含量的标准步骤：原理：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：A=acl。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a 为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等丁各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、h的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的吸光系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：Ca=13.95A665-6.88A649 Cb=24.96A649-7.32A665 Cx=(1000A470-2.05Ca-1 14.8*Cb)/245 最终，叶绿素含量计算公式为：叶绿素含量（mg/g）= （色素浓度mg/L * 提取液体积ml * 稀释倍数）/(1000 * 样品鲜重g)。
通常操作选取的叶片大概为0.1g，剪碎放入装有5ml 95%以纯的10ml离心管中，暗处理24h，即可测量其吸光度。
叶绿素含量的测定(分光光度法)
实验三十三叶绿素含量的测定(分光光度法)仪器、材料与试剂实验步骤思考题电子课件根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即A＝aCL（a为该物质的吸光系数）。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2 个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。
在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b的80 ％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04 和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：A663=82.04Ca +9.27Cb (1)A645=16.75Ca+45.6Cb (2)式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。
解联立方程(1)、(2)可得以下方程：Ca=0.0127A663-0.00269A645 (3)Cb=0.0229A645-0.00468A663 (4)如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为：Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645 (5)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663 (6)叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663 (7)叶绿素总量也可根据下式求导A652=34.5×CT由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数（均为34.5 ），因此也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）求出叶绿素总量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652×1000/34.5 (8)因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。
分光光度法测定水中的叶绿素a
分光光度法测定水中的叶绿素a分光光度法测定水中的叶绿素a1 检出限水样体积300 mL、使用1 cm比色皿时，叶绿素a的检出限为0.11 μg/L，测定下限为0.5 μg/L；叶绿素b的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L；叶绿素c的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L。
2 方法原理将一定量水样用玻璃纤维膜过滤，收集藻类，使用反复冻融法对藻类细胞进行破碎，用90%丙酮溶液提取叶绿素，根据叶绿素光谱依次测定750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波长下的吸光度，计算叶绿素含量。
3 试剂和材料3.1 碳酸镁悬浊液：ω（MgCO3）= 1%，1.0 gMgCO3 100 mL纯水3.2 丙酮溶液：ψ（C3H6O）= 90%，900 mL丙酮加100 mL纯水3.3 盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。
8.5 mL浓盐酸加入500 mL纯水，冷却后稀释至1000 mL。
4 仪器和设备4.1 抽滤装置4.2 滤膜4.3 具塞玻璃离心管4.4 水浴锅4.5 离心机：转速3000 ~ 4000 r/min4.6 分光光度计4.7 比色杯：3 cm5 水样采集5.1 水样采集采集500 ~ 1000 mL 水样于棕色玻璃瓶或深色塑料瓶中。
5.2 保存避光保存，低温运输，在-20℃以下的冰箱内保存，在25 d 内分析测试。
6 分析步骤6.1 清洗玻璃仪器所有玻璃仪器应该清洗干净，尤其避免酸性条件下引起的叶绿素a 的分解。
6.2 滤膜过滤每种测定水样取300 mL ，加入0.6 mLMgCO 3悬浊液，用滤膜过滤。
6.3 提取将滤膜转移至具塞试管，加少量碳酸镁粉末和10 mL 已水浴加热至50℃的90%丙酮溶液。
塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分震荡，避光提取4 h 。
6.4 离心提取完毕后，离心管置于离心机上4000 r/min 离心20 min ，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞紧塞子，4000 r/min 再离心10 min 。
叶绿素含量的测定分光光度法
叶绿素含量的测定分光光度法叶绿素是一种广泛存在于植物和一些浮游生物中的绿色色素，它在光合作用过程中起着至关重要的作用。
测定叶绿素含量是研究植物光合作用和生长发育的重要手段之一。
其中，分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法。
分光光度法是通过测量溶液对特定波长光的吸收程度来确定其中物质浓度的一种方法。
在测定叶绿素含量时，我们会选择特定波长的光，并测量通过溶液后的光线强度。
根据光线的吸收程度，可以计算出样品中叶绿素的浓度。
在进行叶绿素含量的分光光度法测定时，我们首先需要提取叶绿素。
通常采用乙醇、丙酮等溶剂来破坏叶绿素在叶片中的结构，并将其溶解出来。
然后，将提取液置于离心管中进行离心，以去除悬浮的杂质。
离心后，我们可以得到含有叶绿素的溶液。
接下来，我们需要使用分光光度计来测量叶绿素溶液的吸光度。
分光光度计通过选择特定波长的光源，将光线通过样品后，再通过光电二极管接收光信号，最后转化为电信号。
根据吸光度的定义，可以通过测量进射光和透射光的光强来计算吸光度，并由此得到叶绿素的浓度。
为了准确测定叶绿素含量，我们需要在测量前进行一些预处理。
首先，需要校准分光光度计，以确保测量的准确性。
其次，应该选择适当的波长进行测量。
常用的波长为663纳米和645纳米，这两个波长对叶绿素的吸光度较高。
最后，要注意样品的稀释，以确保其吸光度在仪器检测范围内。
在实际测定中，我们可以根据测量结果计算出叶绿素的浓度，并进行统计分析。
通过比较不同处理组的叶绿素含量，可以了解不同因素对植物生长和光合作用的影响。
此外，还可以将分光光度法与其他方法相结合，来对叶绿素含量进行验证和比对，以提高测定结果的可靠性。
分光光度法是一种常用的测定叶绿素含量的方法。
通过测量溶液对特定波长光的吸收程度，可以计算出叶绿素的浓度。
在实际应用中，我们需要注意校准仪器、选择适当的波长、稀释样品等步骤，以确保测定结果的准确性。
分光光度法的应用为我们研究植物生长和光合作用提供了重要的手段。
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分光光度法测量溶液中色素含量一、引言（实验背景）在物质检测分析领域，对样品测试时往往直接采用化学方法，或先采用化学方法预处理后再采用物理方法进行测试分析，这样都要采用化学试剂，对环境造成二次污染。
而纯物理方法在整个测量过程没有化学反应，更多依赖于物理手段和数学处理来解决问题，符合环境友好型社会的发展需求，受到国家的重视和社会各界的欢迎。
随着测试方法的转变，人才需求也随之发生转变。
以往利用化学分析方法进行物质检测分析，需要大批量化学、生物相关专业人才。
而随着物理测试方法的广泛采用，光学、光电专业人才需求越来越大。
为了顺应社会需求，适应形势变化，光学、光电专业学生不仅要掌握制造分光光度计的技术，还要创新使用方法，通过实验训练积累知识和经验，以便达到社会人才需求标准，为推动社会的技术进步和发展作贡献。
二、实验目的与内容食品中常添加色素使外观好看而吸引消费者，特别是食品饮料中常常使用人工色素配制成各种颜色。
而毒理学证明化学合成色素有不同程度的毒性，有的甚至可致癌。
各国相继制订了法规，对食品中合成色素的使用做了限量规定。
本实验目的就是要采用光学方法测出溶液中常用的色素含量。
溶液中常使用三种色素显示黄色、橙色或红色：柠檬黄、日落黄和胭脂红，本实验要求：(1)实验前一周进行预习查资料，设计出使用分光光度计同时测出溶液中柠檬黄、日落黄和胭脂红的含量的实验方案，实验方案包括：1）实验所需条件，包括仪器设备、材料试剂、工具器材等；2）配制哪些溶液？测量哪些数据？并设计好记录数据的表格以及主要实验步骤（注：分光光度计输出的数据量较大，每个样品的测量结果以文件形式保存，请先拟好文件名，填入表格，以免搞错）；3）由实验数据计算柠檬黄、日落黄和胭脂红的含量的方法，并说明所需使用的软件或拟编写的程序。
实验设计方案至少提前一天（需要特殊材料的方案须提前一周）交给任课老师审阅，通过审阅后方可进行实验。
(2) 实验时，按照所设计实验方案，配制所需溶液，并使用分光光度计测出相应的光谱数据；数据记录单须交老师审查签字。
(3) 实验结束后按数据处理要求进行数据处理，一周内上交实验报告，实验报告包括实验方案、实验原始数据、数据处理结论及误差分析、思考题。
三、 实验原理分光光度法是根据物质对不同波长的单色光的吸收程度不同而对物质进行定性和定量分析的方法，常采用吸收光谱曲线来进行分析。
所谓吸收光谱曲线，即将不同波长的光依次通过某一固定浓度和厚度的有色溶液，分别测出它们对各种波长光的吸收程度（用吸光度A 表示），以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图所画出曲线。
由于溶液对不同波长的光的吸收程度是不同，不同溶液的吸收曲线，其形状和最大吸收波长都各不相同，如图1所示，可以作为定性分析的基础。
20025030035040045050055060065070075080050100150200λ1Maxλ3Maxλ2MaxAλ/nm图1不同溶液的光谱吸收曲线1760年，朗伯通过研究后指出：如果溶液的浓度一定，则光对物质的吸收程度与它通过的溶液厚度成正比b K II A 00lg== (1) A 为吸光度；I 0为入射光强度；I 为透射光强度；b 为液层厚度；K 0为比例常数。
1852年，比耳(Beer)提出光的吸收和光所遇到的吸收物质数量有关；即当单色光通过液层厚度一定的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度成正比。
C K II A 10lg== (2) A 为吸光度；I 0为入射光强度；I 为透射光强度；C 为溶液的浓度；K 1为比例常数。
将朗伯(Lambert)定律和比耳(Beer)定律合并，则为朗伯-比耳(Lambert- Beer)定律bC TI I A ε===1lg lg0 (3) 式中：A 为吸光度；T 为透射率；b 为液层厚度(光程长度)，通常以cm 为单位；C 为溶液的浓度，一般为物质的摩尔浓度，单位为mol ·L -1；ε为摩尔吸光系数，单位L ·mol -1·cm -1；（注意：吸光系数有三种表示方式：摩尔吸光系数，单位L·mol -1·cm -1，对应浓度单位为mol/L ；吸光系数，单位L · g –1 · cm -1，对应浓度单位为g/L ；比吸光系数，单位100mL · g –1 · cm -1，对应浓度单位为g/100mL 。
）需要说明的是，（3）式中的比例系数ε对不同波长的光，其值是不同的，所以吸光度A 随波长呈变化的曲线。
同一溶液，不同浓度，其吸收曲线的形状相似，最大吸收波长也一样，根据朗伯-比耳定律，其吸光度与溶液浓度成正比，如图2所示，可利用吸收曲线结合吸光度对溶液物质含量进行定量分析。
3004005006007008000.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.600.650.700.750.80Aλ/nm0.01mol/L0.08mol/L0.16mol/L图2 同溶液不同浓度光谱吸收曲线所以，对于单组分溶液，根据最大吸收峰处的吸光度，即可算出溶液中该物质的浓度。
具体方法是：先配制已知浓度的溶液，测出吸光度，根据（3）式计算出吸光系数；而后再测待测样品的吸光度，由（3）式计算样品的浓度。
对于多组分溶液，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加和性，根据朗伯-比耳定律有：∑=ni i i bC A ε (4)如各组分光谱有叠加，则通过解联立方程组可以确定各组分的浓度。
以三组分混合液为例，先用混合液绘制出吸收光谱，再分别用其中的每单一组分绘制出各自的吸收光谱，而后根据所测三条吸收谱线选择三个合适的波长，在这三个波长处对混合物样品进行测定，其方程式如下：3132121111bC bC bC A εεε++= (5) 3232221212bC bC bC A εεε++= (6) 3332321313bC bC bC A εεε++= (7)应用行列式克莱姆法则，则可计算获得C 1、C 2、C 3。
同一物质，不同的测试波长有不同的摩尔吸收系数，即有不同的灵敏度，由于实际实验有误差，吸光度较小处相对误差较大，而最大吸收波长处的摩尔吸光系数最大，分析测试的灵敏度最高，且最大吸收波长处吸光度绝对误差A ∆变化最小，所以三个波长分别选在三种物质的吸收峰处较合适。
当用分光光度计进行测量时，一般会对波长进行扫描，即同时给出许多波长下的测量值，这时为了充分利用现有数据减小误差，可采用最小二乘法对数据进行处理（参考附录3）。
一般情况下，采用分光光度法对某种物质进行测量时，物质的吸光系数是未知的，为了获取物质的吸光系数，常用下列方法：绝对法：选择待测物质的吸收峰波长，通过书刊、手册查阅待测物质在吸收峰波长处吸光系数，利用实验所得的吸光度或透射率或反射率计算获得待测物质浓度。
标准对照法：在同样的条件下配制标准溶液及试样溶液，在所选波长处分别测量吸光度，获得标准溶液及试样溶液的A 标及A 样，通过样标样标C C A =A 获得样品浓度。
标准曲线法：配制一系列已知具有不同浓度的标准溶液，分别在选定波长处测其吸光度A，然后以标准溶液的浓度C为横坐标，以相应的吸光度A为纵坐标，绘制A-C关系图，获得标准曲线和标准关系方程。
在相同条件下测量样品溶液的吸光度，根据标准曲线和标准关系方程即可获得样品溶液浓度。
标准加入法：在样品溶液中加入已知具有不同浓度的标准溶液，分别在选定波长处测量其吸光度，根据吸光度变化量和所加已知具有不同浓度的标准溶液浓度变化量的关系，进而获得样品待测物含量。
分光光度计是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，它主要由光源、单色器、吸收池、检测器、信息显示系统组成。
分光光度计结构组成框图如图3所示。
图3 分光光度计结构框图光源主要提供符合要求的入射光，较常用氘灯(165-375 nm)和钨灯(320-2500nm)。
单色器是将光源发射的复合光分解成连续光谱并可从中选出任一波长单色光的光学系统，主要由狭缝、色散元件（棱镜、光栅）和透镜系统组成。
吸收池又叫比色皿，是用于盛放待测溶液和决定透光液层厚度的器件，主要有石英吸收池和玻璃吸收池两种。
检测器是利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号的器件，常用的有硒光电池、光电管、光电倍增管等。
四、实验仪器和试剂仪器：UV-4501S紫外可见分光光度计，TU1901紫外可见分光光度计（带两个1cm 石英比色皿）；基本操作步骤见附录1。
电子天平；容量瓶、移液管、烧杯等玻璃仪器。
试剂：柠檬黄、日落黄、胭脂红（试剂说明见附录2）；乙酸铵；光学纯水；五、思考题(1)分光光度计有哪些类型？分别有什么特点？(2)测定过程中产生误差的原因有哪些，并简要进行分析？注意事项：(1)在配制所需浓度溶液过程中，天平读数要精确；玻璃仪器要轻拿轻放，配制完后，清洗干净放回原处。
(2)所配制溶液浓度在最大吸收波长处吸光度最佳范围为0.2~0.8，相当于本实验所用溶液浓度范围为20~200μg/mL。
浓度高低也可以用一定体积（与使用的容量瓶有关，如100mL）中含储备液多少来表示（如1mL，3mL等），可称“体积浓度”。
等数据处理完成后，再将它转换成标准浓度单位。
(3)在一次测量完成后，比色皿须经光学纯水清洗，待测浓度溶液清洗后，再加入待测溶液进行测试。
(4)分光光度计测量常常涉及数十个甚至上千个波长数据，要想利用好这些数据，就可能要解数目巨大的方程组，所以仅靠手工计算是不可能的，需要编程计算或利用软件计算。
本实验提供VB编写的计算软件程序或自行采用MATLAB软件或其他软件进行计算。
附录1：光谱仪基本操作步骤(1)开机，仪器参数设置：1)打开分光光度计电源开关，预热约20min；2)在Windows操作系统下启动光谱仪程序，待计算机与光谱仪通讯成功，可进入主工作程序；3)选择附属功能-狭缝设置设定狭缝宽度。
狭缝宽度过大时，入射光的单色光降低，校准曲线偏离比耳定律，灵敏度降低；狭缝宽度过窄时，光强变弱，仪器的增益提高，仪器噪声增大，于测量不利。
4)选择附属功能-波长设置设定波长范围，波长范围太大，测试时间太长，并增加数据处理量，增加误差；波长范围太小，不能完全覆盖物质的吸收光谱宽度，测试数据不全，增加测量误差；因而选择合适的波长范围，可以有效减少误差。
5)选择测试-波长扫描进入波长扫描界面-模式选择吸光度或透射率；6)选择测试-波长扫描进入波长扫描界面-参数设置对扫描次数、扫描速度、起止波长、坐标上下限进行设定；7)在参考通道与物光通道分别插入装有蒸馏水的石英比色皿，盖好防尘盖，选择附属功能-建立基线进行基线扫描。