微生物菌种的分离和纯化方法
微生物纯培养—分离纯化方法汇总
微生物纯培养—分离纯化方法汇总含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（mixed culture）。
如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（pureculture）。
在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。
得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。
１、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。
单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。
首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。
３、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。
用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
富集培养法的方法和原理非常简单。
我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。
如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
５、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。
然后快速冷却，并进行接种。
接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。
另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。
细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
微生物菌种的分离和纯化方法
微生物菌种的分离和纯化方法1.空气平板法空气平板法是一种常用的微生物菌种分离方法。
将待分离的微生物样品进行适当的稀释并均匀涂布在含有经过固化的琼脂平板上，然后放置在适宜的温度下进行培养。
微生物在平板上呈现为单个菌落，每个菌落都代表一个来自单一细胞的微生物。
通过挑取单个菌落，将其再次传代培养，最终可以得到纯净的菌种。
2.稀释平板法稀释平板法也是一种常用的微生物菌种分离方法，在空气平板法的基础上进行了改进。
先将待分离的微生物样品按一定比例稀释，然后将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上。
由于稀释后的样品中菌落之间的距离更远，因此每个菌落代表的是来自更少数的微生物细胞，得到纯净的菌种的几率更高。
3.前体菌种法前体菌种法是一种通过选择性培养基将目标微生物分离出来的方法。
选择性培养基可以通过添加特定的抗生素、酸碱度调节和特定营养物等来抑制其他微生物的生长而促进目标微生物的生长。
将待分离的微生物样品进行适当的稀释后接种在选择性培养基上，利用培养基的选择性促使目标微生物生长并抑制其他微生物的生长，最终得到纯净的菌种。
4.形态学分离法形态学分离法是一种根据微生物在形态和结构上的差异进行分离的方法。
先选择合适的培养基和培养条件，将待分离的微生物样品进行培养。
在培养过程中，观察并挑选出形态和结构上有明显差异的微生物，然后将其进行单菌维持培养，并通过形态特征进一步分离和纯化菌种。
5.生理生化特性分离法生理生化特性分离法是一种根据不同微生物菌株在代谢和物质转化方面的差异进行分离的方法。
根据微生物菌株的生理生化特性，如生长速度、氨基酸利用能力、产酸产气等，将微生物菌株进行初步分离，然后通过进一步的生化鉴定和特性测试，最终得到纯净的菌种。
总结起来，微生物菌种的分离和纯化方法有很多种类，选择合适的方法依赖于待分离的微生物特性和研究目的。
这些方法在微生物学的研究中起到了关键作用，为了获得纯净的微生物菌种提供了有效的手段。
微生物的分离和纯化实验原理及步骤
实验五微生物的分离和纯化
实验目的：
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。
实验原理：
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有简易单细胞挑取法；平板分离法。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，包括两个方面
1．选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2．微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通
过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成的。
单个菌落并不一定保证是纯培养，纯培养的确定除观察其菌落特征外还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。
实验器材：
1．菌种米曲霉 (Aspergillus oryzae)。
2．培养基高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3．溶液或试剂 10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。
4．仪器或者其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。
食品微生物8 微生物分离、纯化与保藏技术
（一）菌种保藏的目的
保持其原有性状和活力的稳定； 确保菌种不死亡、不变异、不被污染；
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
（二）菌种保藏依据：
根据菌种的生理、生化特点，人为地创造低温、干燥、 缺氧、缺乏营养条件，使菌种的代谢活动和生长繁殖处 于受抑制的休眠状态。 保藏菌种的选取：选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢 子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
沙土管保藏流程：
菌种 斜面产孢 孢子悬浮液（≥106/ml ） 减压干燥
加入沙土管（ 0.3～0.5ml/管） 密封 4℃低温保藏
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
砂土管保藏法的特点
包藏初期，菌死亡率高，后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后 保存期间稳定性较好。 适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌 对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。
(二)通过寄主体进行复壮
对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒 等，由于长期使用，其毒力下降，导致杀虫效率降低及 衰退现象。 可以用菌种去感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上 重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复 和提高毒力。
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
微生物检验基础技能训练模块 ——
8 微生物分离、纯化和保藏技术
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
1、用固体培养基分离和纯化单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。
当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。
大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。
所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。
这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。
固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。
最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。
这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。
1.1 稀释倒平板法首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。
随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
1.2 涂布平板法因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
微生物的纯培养、分离纯化和平板菌落计数法
微生物的纯培养、分离纯化和平板菌落计数法姓名摘要：纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数。
本实验通过稀释涂布平板法和平板划线分离法分离纯化微生物以获得纯培养并进行平板菌落计数，旨在了解微生物的纯培养含义和意义、熟练掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术、了解利用平板菌落计数法测定微生物样品中活细胞的原理、学习平板菌落计数的操作步骤与方法。
实验结果表明，本实验达到了预期的目的。
关键词：微生物的纯培养、微生物的分离与纯化、平板菌落计数法1.引言自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。
人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。
也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。
只有纯培养物才能提供可以重复的有意义的结果，纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
形状稳定的纯培养（菌种）是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。
稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。
后几种方法不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。
常用的方法有：（1）简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。
简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。
它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。
将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。
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从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
1、用固体培养基分离和纯化
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。
当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。
大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。
所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。
这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。
固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。
最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。
这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。
1.1 稀释倒平板法
首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。
随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
1.2 涂布平板法
因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1）。
图1 涂布平板法
1.3 平板划线法
最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线（图2），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
图2 平板划线法
1.4 稀释摇管法
用固体培养基分离严格厌氧菌有特殊性，如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。
对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。
先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。
培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。
进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。
2、用液体培养基分离和纯化
大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。
然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。
稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。
接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。
如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。
如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。
因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。
3、单细胞（孢子）分离
只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类是稀释法的一个重要缺点。
在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。
这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。
单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。
较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。
这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。
对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。
在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。
单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。
4、选择培养分离
没有一种培养基或一种培养条件能够满足一切微生物生长的需要，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。
如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计特定环境使之适合这种微生物的生长，因而能够从混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。
这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，特别适用于从自然界中分离、寻找有用的微生物。
自然界中，在大多数场合微生物群落是由多种微生物组成的，从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释法几乎是不可能的。
要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。
或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。
4.1 利用选择平板进行直接分离
根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。
例如要分离高温菌，可在高温条件下进行培养；要分离某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离；有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移动的微生物分开。
可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。
4.2 富集培养
富集培养法原理和方法非常简单，利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，很容易地分离到所需的特定微生物。
富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。
在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。
如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
5、二元培养物
分离的目的通常是要得到纯培养。
然而，在有些情况下这是很难做到的。
但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。
含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。
例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。
有一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。
对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。
另外，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成。
例如，纤毛虫、变形虫和粘菌。
在以上介绍的几种方法中，平板分离法普遍用于实验室微生物的分离与纯化。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。
值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。