构建含NURR1基因腺病毒对C17.2神经干细胞调控和其对帕金森病治疗

中山大学博士学位论文构建含ＮＵＲＲＩ基因的腺病毒对Ｃ１７２神经干细胞调控厦其对帕金森病治疗构建含ＮＵＲＲｌ基因腺病毒对Ｃ１７．２神经千细胞调控及其对帕金森病治疗专业神经病学博士研究生李庆军指导教师邢诒刚摘要帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ＳＤｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）又名震颤麻痹（ＰａｒａｌｙｓｉｓＡｇｉｔａｎｓ），是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，６０岁以上人群患病率为１０００／１０万，并随着年龄增长而增高，两性分布差异不大。

１ＰＤ的研究现状ＰＤ的病理改变主要位于黑质，无论是原发性或继发性ＰＤ，黑质几乎都必受累。

ＰＤ时，黑质、纹状体内ＤＡ（ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ）含量显著减少，ＤＡ的抑制作用降低，而乙酰胆碱（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ。

Ａｃｈ）含量相对增加，两者动态平衡遭到破坏，从而出现ＰＤ症状。

因此设法补充体内丢失和保护残存的多巴胺能神经元，使其与所支配的脑区内神经元重建有效的突触联系，恢复原来多巴胺能神经支配，是治疗ＰＤ的最佳途径。

２神经干细胞治疗ＰＤ的研究现状自从帕金森病的病理和生化比较明了后，许多学者就开始摸索细胞移植治疗帕金森病可能性。

初期报道有效的肾上腺髓质细胞移植现已废弃。

胚胎多巴胺能细胞移植因胎龄限制、胚胎来源、论理学等问题，难以为继。

近年来神经干细胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ，ＮＳＣ）的研究进展迅速。

神经干细胞具有未成熟的特性、表型可塑性、免疫原性低和可复制等特性。

用外源基因对体外培养的神经干细胞进行调控后，再移植到已有退行性的病变黑质内，即有可能最大程度的促使神经千细胞分化为与移植部位相适应的神经元。

！！查兰堡圭兰竺竺圭塑塞鱼！！！竺！苎里塑壁堕童翌！！！！塑兰三塑璺塑笙墨苎翌塑垒查堕塑生３基因治疗ＰＤ的研究现状国内外对ＰＤ进行的基因治疗，已取得一定效果。

帕金森病患者脑合成ＤＡ所需的ＴＨ、ＡＡＤＣ酶活性明显不足，因此提供外源性ＴＨ和ＡＡＤＣ基因有助于增加ＤＡ合成。

但单纯补充ＴＨ、ＡＤＣＣ等基因治疗和某些保护多巴胺能神经元的神经营养因子基因治疗不能阻滞ＰＤ进展，也没解决多巴胺能神经元减少这一根本问题。

ＮＵＲＲｌ属于核受体超家族，几乎完全表达在中枢神经系统内。

基因敲除实验表明，ＮＵＲＲｔ与多巴胺能神经元发生、发展和生存关系密切。

随着年龄老化，ＮＵＲＲｌ基因表达逐渐减少，黑质内ＴＨ基因表达随之下调，两者表现为随年龄增长而下降的一致性。

因此构建高效表达Ｎｕｒｒｉ载体，诱导神经干细胞分化后进行体内移植是治疗ＰＤ的理想选择。

然而既往构建的含有ＮＵＲＲＩ质粒载体，受操作技术、插入基因片断、外源基因表达和转染效率等限制，影响了对ＮＵＲＲＩ基因进一步研究。

重组腺病毒载体．有插入外源基因片段大、转染和表达效率高、带有标记基因等优势。

因此本课题组构建Ａｄ－ＮＵＲＲｌ重组腺病毒后，观察其在体外对Ｃ１７．２神经干细胞诱导分化和两者结合体内移植后对ＰＤ的治疗效果。

第一部分Ａｄ－ＮＵＲＲｌ重组腺病毒载体的构建和鉴定１实验方法将ｐＭｎ—ＮＵＲＲＩ测序后用ｔｔｆｎｄ［１Ｉ和Ｙｂａ１双酶切回收，与用同样酶切回收的ｐａｄｔｒａｃｋ－ＣＭＶ质粒连接为ｐａｄｔｒａｃｋ—ＣＭＶ—ＮＵＰ讯Ｉ，连接质粒用Ｐｉｎｅ１酶切回收目的片段后与ｐＡｄｅａｓｙ共转化大肠杆菌ＢＪ５１８３、ＤＨ５ａ，鉴定后用忍ｃ』酶切回收转染ＨＥＫ２９３Ａ细胞进行包装。

约１０天细胞病变比较完全和细胞内绿色荧光较强时，回收、反复冻融ＨＥＫ２９３Ａ细胞，离心回收上清。

电观察病毒颗粒，ＰＣＲ鉴定，病毒滴度测定。

２结果测序示ｐＭＤ—ＮＵＲＲｌ质粒序列正确，ＰＣＲ鉴定ｐａｄｔｒａｃｋ—ＣＭＶ—ＮＵＲＲｌ穿梭质粒、ｐＡｄｅａｓｙ～ＣＭＹ－ＮＵＲＲＩ整合质粒和重组腺病毒基因组内包含ＮＵＲＲＩ基因。

细胞病变、细胞内荧光表达和电镜示病毒颗粒包装成功，ＰＣＲ结果示病毒基因组内有ＮＵＲＲｌ基因，病毒滴度约为Ｔｔｌ×１０“ｐｆｕ／Ｌ。

第二部分Ａｄ．ＮＵＲＲｌ重组腺病毒在Ｃ１７．２神经干细胞内的表达和其保护作用１实验方法将Ｃ１７．２神经干细胞在３７。

Ｃ，５％Ｃ０２条件下培养。

Ｃ１７．２神经干细胞爬片后固定行ｘ—ｇａｌ染色、免疫组化检测ｎｅｓｔｉｎ和原位杂交检测ＮＵＲＲｌｍＲＮＡ。

将Ｃ１７．２神经干细胞接种在２５ｃｍ２培养瓶中，分对照组Ｉ组和试验组ＩＩ、ＩＩＩ、Ⅳ组，每组ｌＯ只，其中５只加有含Ａｄ．ＮＵＲＲｌ重组腺病毒０．５ｍｌ（ＭＯＩ＝２０）；对照组加入生理盐水，试验组加入６－ＯＨＤＡ，浓度分别为２０、４０、６雎咖ｌ，孵育６ｈ后收集细胞，流式细胞仪检测细胞坏死和凋亡。

２结果ｎｅｓｔｉｎ染色示９５％细胞呈阳性，Ｘ－ｇａｌ染色示９０％以上细胞着色。

原位杂交表明，ＮＵＲＲＩ在细胞浆和细胞核内均有表达。

不同浓度６一羟基多巴对ｃ１７．２神经干细胞影响不同，随着６－ＯＨＤＡ浓度增加，细胞凋亡和坏死明显增加，当６－ＯＨＤＡ为６阻咖ｌ时，细胞凋亡明显减少，细胞坏死明显增加，Ａｄ—ＮＵＲＲｌ重组腺病毒能降低６－ＯＨＤＡ诱发的细胞凋亡和坏死。

第三部分ＮＵＲＲｌ基因对Ｃ１７．２神经干细胞分化影响及其旁分泌效应１实验方法在Ａｄ．ＮＵＲＲｌ重组腺病毒加入Ｃ１７．２神经干细胞内６小时后，更换为无血清培养液继续培养７２ｈ，收细胞上清和未转染病毒的细胞上清后，裂解细胞并回收，ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定细胞上清中和细胞内ｎｕｒｒｌ蛋白。

在Ａｄ－ＮＵＲＲｌ重组腺病毒加入培养细胞６小时后，分别消化、收集加和未加Ａｄ—ＮＵＲＲｌ重组腺病毒的细胞，两者按细胞数１：０、１：１、０：１的比例混合爬片７２ｈ，固定，免疫组化检测ｎｕｒｒｌ、ＮＳＥ阳性细胞。

对ｎｕｒｒｌ阳性细胞比例进行统计学分析，并与ＮＳＥ阳性细胞比例相比较，观察两者之间是否存在相关性。

２结果ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示转Ａｄ．ＮＵＲＲｌ重组腺病毒的细胞上清液和细胞内均有ｎｕｒｒｌ蛋白的存在。

ｎｕｒｒｌ免疫组化示，在转染和未转染Ａｄ－ＮＵＲＲｌ重组腺病毒的混合细胞中大部细胞为阳性细胞，未转染病毒的细胞中偶有阳性细胞。

ＮＳＥ染色示，随转染与未转染Ａｄ－ＮＵＲＲＩ重组腺病毒的细胞的比例下降，ＮＳＥ阳性细胞数目随之降低，与ｎｕｒｒｌ阳性细胞比例呈线性相关。

第四部分Ｎｕｒｒｌ基因联合神经干细胞移植对ＰＤ模型的治疗１．实验方法移植前３天，在Ｃ１７．２神经干细胞加入Ａｄ－ＮＵＲＲｌ（ＭＯＩ＝２０），无菌收集，部分用Ｄｉｌｌ８染色后立体定向注射到ＰＤ模型纹状体内。

取合格的ＰＤ模型２７只，分为ＰＤ模型对照组８只；单纯Ｃ１７．２神经干细胞移植治疗组１０只，分为移植后１０ｄ（２ａ组）、４ｗ（２ｂ组）两组；含Ａｄ—ＮＵＲＲＩ＋ＮＳＣ治疗组９只，分为移植后１０ｄ（３ａ组）、４ｗ（３ｂ组）两组，其中治疗组各有４只作荧光示踪实验，模型组在移植后１０ｄ、４ｗ做完阿朴吗啡诱发的旋转实验后，断头取脑作荧光示踪和ＴＨ染色实验。

２结果Ｃ１７．２神经干细胞移植后１０天，治疗组ＰＤ模型转圈数明显减少，Ｐ＜０．０５；Ａｄ—ＮＵＲＲＩ＋ＮＳＣ治疗组ＰＤ模型转圈数较ＮＳＣ组更少，Ｐ＜０．０５；在４ｗ时治疗组和对准组、治疗组之间仍有统计学差异，Ｐ＜０．０５；在神经干细胞移植后的第ｌＯ天和４ｗ时，两组治疗组内比较，Ｐ＞０．０５，差异没有显著性，表明神经干细胞移植后效果持续时间较长。

在荧光显微镜观察，移植后１０ｄ时，移植细胞主要集中在注射针道附近，但已开始向周围移行，部分移植细胞已与临近细胞建立突触联系；４ｗ后移植细胞已明显移行至远离注射部位，并与周围细胞建立明显的突触联系。

免疫组化示ＰＤ模型纹状体内ＴＨ阳性细胞明显减少；神经干细胞移植１０ｄ后，Ｔｉｆｆ阳性细胞明显增多，４ｗ后ＰＤ模型的病理改善仍然非常明显（Ｐ＜０．０５）；神经干细胞移植结合ＮＵＲＲｌ基因治疗ＰＤ模型的病理改善更加明显，ＴＨ阳性细胞增加更多（Ｐ＜Ｏ．０５）。

结论：１本实验构建了Ａｄ－ＮＵＲＲｌ重组腺病毒载体，该载体转染效率高，对ＮＵＲＲｌ基因表达效率高。

２ＮＵＲＲｌ基因可以保护神经干细胞拮抗外源性神经毒素，减少外源性神经毒素诱导的神经干细胞凋亡和坏死。

３Ａｄ—ＮＵＲＲｌ重组腺病毒载体不仅可直接促进神经干细胞分化，还可以通过旁分泌的形式促进神经干细胞的分化。

４ＮＵＲＲｌ基因结合神经干细胞是治疗ＰＤ模型行之有效的途径，可有效改善了ＰＤ模型症状，修复ＰＤ模型病理改变，在一定的程度恢复原来的多巴胺能神经支配。

关键词：帕金森病，神经干细胞，腺病毒，ＮＵＲＲｌ中山大学博士学位论文构建含ＮＵＲＲｌ基因的腺病毒对Ｃ１７２神经干细胞调控及其对帕金森病治疗ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｗｉｔｈＮＵＲＲｌＧｅｎｅａｎｄｉｔｓＣｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｔｏＣ１７．２ＮｅｒｖｅＳｔｅｍＣｅｌｌａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔｔｏＰａｒｋｉｎｓｏｎＤｉｓｅａｓｅｂｙＴｈｅｍＭａｊｏｒ：ＮｅｕｒｏｌｏｇｙＰｈＤ：ＱｉｎｇＪｕｎＬｉＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：ＹｉＧａｎｇＸｉｎｇＡＢＳＴＲＡＣ。

Ｉ’Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ（ＰＤ），ａｌｓｏｎａｍｅｄｐａｒａｌｙｓｉｓａ百ｔａｎｓ，ｗａｓｔｈｅｓｅｃｏｎｄｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎ１１ｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｏｆｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ（ＣＮＳ）．Ｉｔｗａｓｒｅｐｏｒｔｅｄｏｌｄ．ＡｎｄｔｈａｔＰＤｈａｄｂｅｅｎａｆｆｅｃｔｅｄａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ１ｐｅｒｃｅｎｔｐｅｏｐｌｅｏｖｅｒ６０ｙｅａｒｓａｎｄｗｏｍａｎｗｈｉｌｅｉｔｋｅｐｔｔｌｌｅｒｅｗａ５；ｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｍｏｒｂｉｄｉｔｙｏｆＰＤｂｅｔｗｅｅｎｍａｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｗｉｔｈａｇｅｓ．１ｓｔａｔｕｓｑｕｏｏｆＰＤｓｕｂｓｔａｎｔｉａｎｉｇｒａＰＤｗａｓｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏｎｓｉｎａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｏｆｍｉｄｂｒａ恤．Ｔｈｅｓｕｂｓｔａｎｔｉａｎｉｇｒａｗａｓｍｏｓｔｌｙｄａｍａｇｅｄｉｎｂｏｔｈｐｒｉｍａｒｙｔｈａｎｉｎｔｅｒｉｏｒｒｅｔｉｃｕｌａｒｚｏｎ。

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