病毒载体与基因治疗
基因治疗中的表达载体构建与优化方法
基因治疗中的表达载体构建与优化方法基因治疗是一种新兴的治疗方法，通过将修饰过的基因导入患者体内，以实现对疾病基因的修复或替代。
在基因治疗中，表达载体的构建和优化是关键的一步，它决定了基因在患者体内的表达效率和稳定性。
本文将介绍基因治疗中常用的表达载体构建与优化方法。
表达载体是将目标基因导入细胞内进行表达的工具。
常见的表达载体主要包括质粒和病毒载体。
质粒是一种双链DNA分子，它可以自主复制和表达携带的基因。
病毒载体是一种利用病毒基因表达机制的表达工具，常见的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和腱病毒等。
表达载体的选择应根据具体的治疗目标、基因大小和细胞类型等因素进行考虑。
表达载体的构建是基因治疗中的关键一步。
首先，需要将目标基因克隆到合适的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后利用限制性内切酶进行酶切，并将目标基因与表达载体连接。
常用的连接方法有限制性内切酶切和连接、PCR聚合、Ligase连接等。
连接完成后，需要进行质粒或病毒载体的复制，以获得足够多的表达载体。
表达载体的优化是为了提高基因在患者体内的表达效率和稳定性。
优化的方法有很多种，下面将介绍几种常见的方法。
首先，可以通过调整启动子和增强子的选择来提高基因表达效率。
启动子是调控基因转录的序列，它的选择可以影响基因的表达水平。
常用的启动子有CMV启动子、EF1α启动子和PGK启动子等。
增强子可以增加基因的表达水平，常用的增强子有CMV增强子、SV40增强子和EF1α增强子等。
通过合理选择启动子和增强子的组合，可以提高基因在细胞内的表达水平。
其次，可以通过改变表达载体的拓扑结构来提高基因表达效率。
常用的方法有线性化质粒和环形质粒之间的选择。
线性化质粒在导入细胞内后，可更容易与细胞内的转录因子结合，从而促进基因的表达。
环形质粒则具有更好的稳定性，在不进一步构建的情况下，可以长期保持在细胞内。
此外，还可以通过引入信号序列来优化基因的靶向表达。
信号序列是一段具有特定功能的氨基酸序列，能够促使基因产物在细胞中的定位和分泌。
基因治疗的原理及应用
基因治疗的原理及应用基因治疗是利用基因工程技术来修复或替代患者体内缺陷或异常基因的一种创新治疗方法。
它的原理是将正常的基因序列引入患者的细胞中，以修复或取代有缺陷的基因，从而恢复正常的生物功能。
基因治疗被广泛应用于多种疾病的治疗，包括遗传性疾病、癌症、心血管疾病等。
基因治疗的原理可以分为三个主要步骤：基因传递、基因表达和疗效评估。
基因传递是将正常的基因送入患者的细胞中的过程。
这通常通过载体来实现，例如病毒载体或非病毒载体。
病毒载体具有高效传递基因的能力，常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒。
非病毒载体则是通过物理或化学方法来将基因引入细胞内。
基因表达是指患者的细胞对引入的正常基因进行转录和翻译，从而产生所需的蛋白质。
在此过程中，传递的基因在细胞内被识别并转录成相应的mRNA。
然后，mRNA将被翻译成特定的蛋白质，以实现患者体内的缺陷修复或功能恢复。
疗效评估是基因治疗的关键步骤之一，它用于确定治疗效果和安全性。
通过对患者的检测和评估，我们可以了解基因治疗是否达到预期的效果，并了解是否有不良反应或副作用。
常用的疗效评估方法包括临床症状观察、血液检测和影像学检查等。
基因治疗已经被广泛应用于多种疾病的治疗。
其中，最典型的应用领域之一是遗传性疾病的治疗。
遗传性疾病是由存在缺陷基因导致的，无法通过常规疗法治愈。
基因治疗通过提供正常的基因，可以修复或替代患者体内的缺陷基因，从而纠正疾病的根源。
例如，遗传性免疫缺陷病、囊性纤维化等疾病都已经通过基因治疗取得了一定的治疗效果。
另一个重要的应用领域是癌症治疗。
基因治疗可通过引入抗癌基因或靶向治疗基因，来增强患者体内的抗癌能力或减少肿瘤的生长。
例如，通过植入编码抑癌蛋白的基因来增加免疫细胞攻击癌细胞的能力，或通过植入靶向治疗基因来阻断癌细胞的增殖等。
此外，基因治疗在心血管疾病的治疗中也有很大应用潜力。
例如，可以通过基因治疗来促进心肌再生，修复心肌缺损，改善心脏功能。
腺病毒载体在基因治疗研究中的应用
腺病毒载体在基因治疗研究中的应用基因治疗是近年来发展非常迅速的一种新型疗法，其通过改变人体内某些基因的表达或功能，从而达到治疗疾病的目的。
而其中的一种常用方法就是利用腺病毒载体进行基因转导。
下面我们将深入探讨腺病毒载体在基因治疗研究中的应用。
一、腺病毒载体基础介绍首先，我们需要了解什么是腺病毒载体。
腺病毒是一种小型病毒，具有广泛的宿主范围和极高的转导效率，因此成为了基因治疗领域中最常用的载体之一。
腺病毒的基因组为一条线性双链DNA分子，它的大小约为30kb，可以携带大量外来基因负责转导。
同时，腺病毒中的大部分基因已被删减或失活，因此可以在病毒粒子内部容纳更多的外来基因。
二、腺病毒载体的优势相比于其他的基因治疗载体，腺病毒载体具有许多的优势。
首先，腺病毒对人体的免疫应答十分低。
因为腺病毒感染人类的过程通常都是无症状的，在人体内会迅速被淋巴系统清除，因此它不会引起人体免疫反应。
其次，腺病毒的转导效率非常高，因为它具有广泛的靶细胞类型和容易侵入细胞的特性。
最后，腺病毒的基因修饰能力也很高，可以很容易的携带大量的外来基因，在转导过程中基因也不会被分解或改变。
三、腺病毒载体在基因治疗中的应用现如今，腺病毒载体已广泛应用于临床试验和基础研究中。
以传统的疗法为例，在肝脏癌等疾病中常常需要利用手术切除病变组织，但手术切除对机体的侵害很大。
通过利用腺病毒载体送入基因，就可以避免这种创伤，缩短患者的恢复期。
此外，腺病毒载体还可以用于治疗和预防一些遗传疾病，例如囊性纤维化和色素性视网膜炎。
四、腺病毒载体的展望在未来，腺病毒载体极有可能成为基因治疗领域的重要发展方向之一。
随着科技的发展和基因治疗研究的深入，人们可以更加深入的了解腺病毒载体中的机制，并且对其进行更加精确的改造。
同时，人们也需要进行更加深入的实验和测试，以探究腺病毒载体在人体内的表现和转导效率。
这一系列的研究和测试，将为腺病毒载体在基因治疗中的应用提供更好的基础和保障。
生物医学中的病毒载体技术
生物医学中的病毒载体技术在生物医学领域中，病毒载体技术被广泛应用于基因治疗、疫苗开发、基因工程和研究及诊断等方面。
病毒载体是一种携带和传递遗传物质的工具，是一种经过改造的病毒，可以将需要表达的基因载入病毒中转运到目标细胞中，实现基因的治疗和修改，是基因治疗的核心技术之一。
病毒载体技术的应用病毒载体技术在基因治疗中的应用是其最为广泛的领域。
基因治疗是一种通过向患者体内注入携带着具有治疗效果的基因或基因片段的生物材料来治疗疾病的方法。
病毒载体技术可以将需要表达的基因载入病毒中，转运到目标细胞内，并在里面释放出来，从而实现基因的治疗和修改。
病毒载体技术在疫苗开发领域中也得到了广泛的应用。
疫苗是一种预防疾病的生物制剂，病毒载体技术可以将病毒中携带有表达病原酶毒素等蛋白的基因，将其转化为病毒载体表达出来，从而促使机体产生免疫反应，对抗疾病。
病毒载体技术在基因工程和研究领域也有着广泛的应用。
科学家们可以利用病毒载体技术构建新的基因模型，从而研究基因的功能和相互作用，为科学家们深入研究基因提供了便利。
病毒载体技术在疾病诊断中也有着广泛的应用。
如HIV病毒的检测，利用了病毒载体技术将病毒中的基因片段与患者体内的血清反应，从而可以实现对HIV病毒的精确检测，辅助医生做出正确的诊断和治疗决策。
病毒载体技术的发展和优化病毒载体技术的发展可以追溯至上世纪80年代，当时科学家们利用腺病毒作为病毒载体，将外来基因载入细胞中，并在目标细胞中进行表达。
但这种方法存在诸多挑战，如感染杂质症状，免疫反应等。
随后，科学家们又利用了其他病毒载体，如腺相关病毒（AAV）、腺病毒（Adenovirus）等，并进行了大量的优化和改良，以提高其稳定性和效率，降低免疫系统的抵抗力，从而实现更有效的基因治疗和疫苗开发。
随着人类对疾病治疗、预防以及理解基因的需求不断增加，病毒载体技术也在不断地发展和优化。
一方面，科学家们对已有的病毒载体进行了改进，改善其功能，完善其性能；另一方面，科学家们寻求更适合的病毒载体，如双链RNA病毒、退病毒、负链RNA病毒等，以更好地发挥基因治疗和疫苗开发的作用。
病毒载体在基因工程中的优势与应用案例
病毒载体在基因工程中的优势与应用案例基因工程是一门通过DNA分子的重组技术来改变或者改造生物体基因结构的科学技术。
它不仅可以用于基础研究，还可以应用于医学、农业和工业领域。
在基因工程中，病毒载体作为一种重要的工具，具有许多独特的优势和广泛的应用。
本文将介绍病毒载体在基因工程中的优势，并举几个应用案例进行讨论。
病毒载体在基因工程中的优势之一是其高度选择性，可以将外源基因有效地嵌入到宿主细胞的基因组中。
病毒载体的基因组通常很小，可以携带和传递较长的DNA序列。
此外，病毒载体经过长时间的进化，已经具备了高度有效的侵染宿主细胞的能力。
利用这些特性，科学家可以使用病毒载体来将目标基因传递到特定类型的细胞中，从而实现基因工程的目的。
其次，病毒载体在插入目标基因时具有高效性。
病毒载体可以很容易地与外源基因重组，使得目标基因在宿主细胞中高效表达。
病毒侵染细胞的过程中，目标基因会被病毒载体运输并插入宿主细胞的基因组中，从而可以在细胞内产生目标蛋白。
这种高效的表达方式使得病毒载体在基因工程中得到了广泛应用。
病毒载体还具有广泛的宿主范围，可以感染多种类型的细胞。
这一特性使得病毒载体在基因工程中的应用更加灵活多样。
不同的病毒载体适用于不同类型的细胞，科学家可以根据需求选择合适的病毒载体进行基因传递。
例如，腺病毒载体可以感染多种哺乳动物细胞，而慢病毒载体则可以感染较广泛范围的细胞类型。
下面，我们将介绍两个病毒载体在基因工程中的应用案例。
第一个应用案例是利用腺病毒载体进行基因治疗。
腺病毒载体具有高度感染人体细胞的能力，被广泛应用于基因治疗领域。
基因治疗是一种将正常基因导入病人体内，以纠正遗传性基因缺陷或者改善疾病症状的方法。
例如，在严重联免疫缺陷病患者中，科学家使用腺病毒载体将正常的免疫系统基因导入患者的造血干细胞中，以恢复其免疫功能。
第二个应用案例是利用慢病毒载体进行基因敲除。
慢病毒载体具有稳定的遗传物质传递能力，被广泛应用于基因组编辑和基因敲除中。
分子生物学 总结---病毒载体
基因工程与基因治疗的比较：1、概念：基因工程是将具有价值的目的基因，装配在具有表达元件的特定载体中，导入相应的宿主如细菌、酵母或哺乳动物细胞中，在体外进行扩增，经分离、纯化后获得其表达的蛋白产物。
基因治疗是将具有治疗价值的基因，即“治疗基因”装配于带有在人体细胞中表达所必备元件的载体中，导入人体细胞，直接进行表达。
2、进行基因治疗时无需对表达产物进行分离纯化，因为人细胞本身可以完成这个过程。
3、基因工程的“目的基因”主要是可分泌蛋白，如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体等。
基因治疗不受以上限制，几乎所有的基因，只要其具有治疗作用，均可应用于基因治疗。
4、基因工程的操作全部在体外完成，基因治疗则必须将基因直接导入人体细胞。
途径：1、ex vivo：将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体（异种）细胞，这种细胞被称为基因工程化的细胞，经体外细胞扩增后输回人体。
2、in vivo：将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体上，直接导入人体内。
基因治疗中的病毒载体应具备的条件：1、携带外源基因并能装配成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体没有致病力。
（使其成为复制缺陷型病毒并删除致癌基因）分类：1、重组型病毒载体：以完整的病毒基因组作为改造对象，在不改变病毒复制和包装所需的顺式作用元件的情况下，有选择性地删除病毒的某些必须基因，尤其是前早期或早期基因以控制其表达，所缺失的必需基因的功能由同时导入细胞中的外源基因表达单元提供，一般通过同源重组方法将目的基因插入到病毒基因组中。
2、无病毒基因的病毒载体：重组载体+辅助系统重组载体主要由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必须的顺式作用元件及载体骨架组成。
辅助系统包括病毒复制和包装所必须的所有反式作用元件。
在辅助系统的作用下，重组载体以特定形式（单链或双链DNA或RNA）被包装到不含有任何病毒基因组的病毒颗粒中。
优点：载体病毒本身安全性好，容量大。
新型基因载体在基因治疗中的应用
新型基因载体在基因治疗中的应用人类疾病的治疗一直是医学科学家们研究的重点。
而基因治疗作为医学界的前沿领域，近年来备受关注。
基因治疗的核心是利用基因技术对人类基因进行修饰，以达到治疗疾病的目的。
而新型基因载体，作为基因治疗的重要工具，被广泛研究和应用。
一、新型基因载体的概念和种类基因治疗需要将外源基因导入到患者体内，而新型基因载体就是用来将外源基因导入到细胞内的一种媒介物，将基因传递到患者体内的细胞和组织中。
新型基因载体种类繁多，主要包括：1.病毒载体：将基因定位到宿主的特定细胞，具有高效、高专一性、长效、传输稳定性和构建方便的优势。
2.质粒载体：是将外源基因直接转染到被治疗细胞中的一种载体，具有结构简单、基因传递效率低的特点。
3.纳米粒载体：将外源基因整合到糖、脂类或蛋白质分子等生物大分子中，具有传输效率高、安全性高的特点。
二、新型基因载体在基因治疗中的应用基因治疗的目标是针对疾病发生的部位和情况，抑制或促进相关的生理代谢过程，最终达到治疗疾病的效果。
新型基因载体在基因治疗中的应用具有广泛的应用前景，特别是在以下几方面：1.基因药物的开发：新型基因载体可以帮助开发新型的基因药物，并使其更好地实现对疾病目标的针对性。
例如，使用病毒载体将特定基因送入乳腺癌组织中，可以更好地治疗乳腺癌。
2.免疫治疗：新型基因载体可以帮助患者产生针对特定病原体的免疫力，从而达到治疗疾病的效果。
例如，将基因载体注射到患者体内，可以使其产生更多的T细胞和B细胞，从而增强其自身的免疫力。
3.组织工程：新型基因载体可以帮助修复受损的组织，从而恢复其功能。
例如，利用基因载体将正常的基因导入到人体的受损肌肉中，可以使其恢复正常的运动能力。
三、新型基因载体的优缺点虽然新型基因载体在基因治疗中具有广泛的应用前景，但不可避免地存在着优缺点：1.优点：新型基因载体具有使用方便、精准、高效、可控性好、生物相容性高以及具有较强的针对性等优点，可以实现对基因的有效修饰和治疗。
病毒载体在基因治疗中的应用
病毒载体在基因治疗中的应用引言：基因治疗作为一种新兴的医疗技术，旨在通过修复或替代患者体内缺陷基因，为治疗遗传性疾病和某些获得性疾病提供新的治疗策略。
在基因治疗中，病毒载体作为一种有效的基因传递工具，广泛应用于基因治疗的研究和临床实践中。
本文将探讨病毒载体在基因治疗中的应用，并讨论其在生物学和医疗技术领域的重要性。
一、病毒载体的选择和构建病毒载体作为基因治疗中的传递工具，需要具备一系列特性，如高效的基因传递能力、低毒性、稳定性和选择性。
常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒等。
其中，腺病毒是最常用的病毒载体之一，因其能够有效传递大片段基因，并且对宿主细胞具有较低的毒性。
逆转录病毒则常用于对细胞内基因进行修复或替代，其利用其逆转录酶将RNA转录为DNA，并将其整合到宿主基因组中。
腺相关病毒则因其对呼吸道黏膜具有亲和力，常用于治疗呼吸道相关疾病。
二、病毒载体的基因传递机制病毒载体通过特定的机制实现基因的传递。
以腺病毒为例，其传递机制主要包括侵入宿主细胞、解包装、基因表达和基因整合等步骤。
首先，病毒通过与宿主细胞表面受体结合，侵入宿主细胞。
随后，病毒的外壳蛋白被去除，释放出病毒基因组。
病毒基因组进入宿主细胞的细胞核，并被转录为mRNA。
mRNA进一步翻译为蛋白质，实现基因的表达。
最后，部分病毒载体的基因组会整合到宿主细胞的染色体中，确保基因的稳定传递。
三、病毒载体在基因治疗中的应用1. 遗传性疾病治疗：病毒载体可用于治疗遗传性疾病，如囊性纤维化、血友病等。
通过将正常的基因导入患者体内，可以修复或替代患者缺陷的基因，从而实现疾病的治疗和预防。
2. 肿瘤治疗：病毒载体在肿瘤治疗中也具有广泛的应用。
例如，通过将病毒载体导入肿瘤细胞中，可以选择性地杀死肿瘤细胞，从而实现肿瘤的治疗。
此外，病毒载体还可以用于激活免疫系统，增强对肿瘤的免疫反应。
3. 器官移植：病毒载体在器官移植中的应用也备受关注。
通过将特定基因导入器官移植体内，可以减少器官移植后的排斥反应，并提高移植器官的存活率。
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根据基因导入的靶细胞分为两种：
1.生殖细胞基因治疗
生殖生物学问题复杂 伦理学问题 禁止应用人体
2. 设计和制备方便 体外转录获得
3. 能直接作用于一些RNA病毒
RNA干扰技术
概念：短的双链RNA (dsRNA) 导入细胞，可以使同源mRNA 发生特异性的降解，从而阻断 相应基因的表达。
❖ 高度的序列专一性 ❖ 高效性 ❖ 易操作性
(二) 间接策略
导入与致病基因无直接联系的治疗基因
1. 免疫基因治疗 2. 分子化疗 3. 特异性细胞杀伤
受体介导的反义RNA转移
❖ 脱唾液酸糖蛋白（ASGP）受体介导的转移，通过化学 物质作为中间连接物，将ASGP与多聚赖氨酸（PL）共 价结合，得到ASGP-PL复合物，这种复合物可以携带 RNA，再专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别， 并被吞噬到肝细胞内发挥作用。
反义RNA应用前景
1. 安全性高 不改变基因结构，最终在细胞内被降解。
筛选等。
逆转录病毒载体的特点
1. env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受 体，基因转移效率更高；
2. 结构基因gag、env、pol的缺失不影响其他 部分的活性；
3. 整合到靶细胞基因组，可长期表达； 4. 包装好的假病毒颗粒分泌至包装细胞的培养
上清中，易于分离制备。
问题
1. 靶细胞DNA合成必须很活跃，因为病毒感 染和整合作用均依赖靶细胞DNA的复制；
3. 基因增强（gene augmentation）
成熟的策略
是指不去除异常基因，将有功能的正常 基因导入病变细胞或其它细胞后发生非 定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基 因的功能，或使原有的功能得以加强。
4. 基因干预（gene interference）
是采用特定的方法，导入外源基因选择性地 阻断、干扰、抑制和封闭有害基因在DNA、 RNA和蛋白质水平的表达及其生物合成。
2. 安全性问题 随机整合：诱发插入突变，激活癌基因 缺陷型逆转录病毒通过重组获得复制能力
腺病毒载体
1. 基因组：双链无包膜DNA病毒，36kb 2. 通过受体介导内吞作用进入细胞，基因导入效率高。 3. 不整合宿主基因组，安全。 4. 宿主细胞范围广泛。 5. 可口服、喷雾吸入或气管内滴注。 6. 载体容量大。 7. 体外容易培养制备，病毒滴度较高。
常用的病毒载体及其基因转移的特点
逆转录病毒 腺病毒 腺相关病毒 单纯疱疹病毒
基因组
正链RNA 线性dsDNA
线性ssDNA dsDNA
8～11 kb
36 kb
4.7 kb
152 kb
外源基因容量 < 8 kb
2～7 kb
< 3.5 kb
30 kb
重组病毒滴度
中
高
较低
高
靶细胞状态 分裂细胞，表面 分裂细胞或 分裂细胞或 分裂细胞或
导入抑癌基因 RNA干扰（RNA interference)
抑癌基因疗法
❖ 抑癌基因：是正常细胞内正常存在 的，能抑制细胞转化和肿瘤发生的 一类基因群。
Rb基因，p53基因，MTS基因， nm23基因
反义RNA技术
反义RNA（antisense RNA）：与mRNA互 补的RNA，抑制mRNA的加工与翻译。
1. 免疫基因治疗 2. 分子化疗 3. 特异性细胞杀伤
2.分子化疗
(1) 自杀基因疗法： TK基因、CD基因 (2) 化疗保护性基因治疗： MDR基因 (3) 药物增敏基因治疗： 钙调素基因
(1) 自杀基因疗法
自杀基因（suicide gene)，前体药物酶转化基因 该基因表达产生的酶可催化无毒性的药物前体转变为
如将多药抗性（multiple drug resistance, MDR） 基因MDR-1导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受 抑制的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。
(3) 药物增敏基因治疗
将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对 药物的敏感性。
如将钙调素基因转入癌细胞，其表达产物作为 细胞内信号转导系统的重要物质，明显增强肿 瘤细胞对化疗药物的吸收量而相应减少了排出 量，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。
基因克隆 人工合成 PCR扩增
外源基因的选择原则
1. 体内少量表达就可显著改善症状； 2. 过高表达不会对机体造成危害； 3. 在抗病毒和病原体的基因治疗中，所选择的靶基因
应在病毒和病原体的生活史中起重要的作用，并且 该序列是特异的； 4. 肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入 人体；可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或 向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生长，所 针对的癌基因或抑癌基因应与该肿瘤的发生和发展 有明确的相关性。
(五) 基因转染细胞的筛选与鉴定
抗性筛选方法： 重组载体上插入有标记基因Neo，导入受体细
胞后可使其产生对G418（Geneticin）药物的 抗性。在加入G418的培养基中进行选择性培养 时，转染NeoR基因的细胞能够存活，而未转染 的细胞则死亡；
应用标记基因作为探针进行分子杂交法筛选。
(五) 基因转染细胞的筛选与鉴定
须有特殊受体 非分裂细胞 非分裂细胞 非分裂细胞
基因转移效率 高
高高Biblioteka 高基因整合随机整合
不整合
定点整合于 不整合
染色体19q
外源基因表达状况 短暂/稳定表达 短暂表达 稳定表达 短暂/稳定表达
安全性及其它 相对较安全 可引起炎症 无病原性 可能出现毒性反应
宿主范围广 和免疫反应
(三) 靶细胞的选择
生殖细胞: 禁止
传统治疗方法
1. 药物治疗 2. 手术治疗 3. 放射治疗 4. 理疗
新的生物治疗： 基因治疗 (gene therapy)：以重组DNA技术和
基因转移技术为基础的生物高新技术。
基因治疗
一、概念 二、种类和策略 三、基本流程 四、应用与展望
一、基因治疗的概念
Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.
1. 基因修正（gene correction） 指将致病基因的突变碱基加以纠正，而保留正 常部分。
2. 基因替代（gene replacement） 指通过同源重组（基因打靶）技术，将正常基 因定点整合到靶细胞基因组内，以原位替换致 病基因。
❖ 不涉及基因组整体改变的情况下对缺陷基因进 行精确的原位修复，是最理想的治疗方式。
（二）载体的选择与构建
病毒载体：
非病毒载体：
逆转录病毒（RV)
• 脂质体法
腺病毒（AV)
• 直接注射法
腺相关病毒（AAV) • 受体介导基因转移
单纯疱疹病毒（HSV) • DNA-磷酸钙共沉淀
痘苗病毒（VV)
• 电穿孔
逆转录病毒
逆转录病毒的基因组结构
5’LTR gag pol env 3’LTR
1.免疫基因治疗
(1) 细胞因子基因治疗 IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、 INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF
(2) 免疫增强基因疗法 MHC I类抗原、共刺激分子
(3) 肿瘤DNA疫苗疗法 癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤DNA疫苗
(二) 间接策略
导入与致病基因无直接联系的治疗基因
基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础 的医学治疗。
概念的发展
经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补 患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目 的。
广义概念：将某种遗传物质转移至患者细胞内， 使其在体内有效表达，最终达到治疗疾病目的 的方法，均称之为基因治疗。
二、基因治疗的种类
根据基因导入的方式分为两种： 1. 直接体内疗法（in vivo）
结构基因
gag (group antigen) ：编码核心蛋白和属特异性抗原 pol (polymerase) ：编码逆转录酶 env (envelop) ：编码病毒外壳蛋白和包膜蛋白
LTR 调控序列
含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号
逆转录病毒的生活史
逆转录病毒
宿主细胞
病毒RNA
cDNA
整合
（一）外源基因的选择与制备 （二）载体的选择与构建 （三）靶细胞的选择 （四）基因转移 （五）基因转染细胞的筛选与鉴定 （六）回输体内
（一）外源基因的选择与制备
外源基因 目的基因：
与致病基因相对应的有功能的正常基因 与致病基因无关、有治疗作用的基因
标记基因:
新霉素磷酸转移酶（Neo）基因
外源基因的获得
外源基因表达的鉴定：
采用Northern印迹杂交：检测mRNA的表达 测定其表达产物即蛋白质的含量等方法。
(六) 回输体内
方式： 静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等
体外合成反义RNA，直接导入；
将特异的反义基因通过特定的表达载体（质粒、 病毒）导入细胞，转录出反义RNA发挥作用， 避免了在给药途径中易被RNase降解的缺点。
关键性问题
1. 专一性转移 如何专一的作用于病变细胞，而不影响其他正常细胞。
2. 反义RNA进入靶细胞前的降解问题
解决： 特定受体介导的反义RNA转移
(二) 间接策略
导入与致病基因无直接联系的治疗基因
1. 免疫基因治疗 2. 分子化疗 3. 特异性细胞杀伤
3.特异性细胞杀伤