三种病毒转染的异同点
各种转染方法比较
磷酸钙法
磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞
稳定转染,染瞬转染
不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高）,操作简便但重复性差,有些细胞不适用
细胞建议用CSCL梯度离心，转染是拷贝数较多
GIBCO BRL ，Promega
阳离子脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。(若DNA浓度过高，中和脂质体表面电核，而降低了与细胞的结合能力)
稳定转染,瞬时转染,所有细胞
使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用
瞬时性转染，稳定转染
可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞
.
显微注射法
用显微操作将DNA直接注入靶细胞核
稳定转染,瞬时转染
转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞
.
电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入
稳定转染,瞬时转染,所有细胞
适用性广，除了质粒外，还可转染大的基因组（>65kb）但细胞致死率高，DNA和细胞用量大， 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件，拷贝数较少1-20
各种转染方法比较转染方法原理主要应特点主要的厂家及产品deae葡聚糖带正电的deae葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时转相对简便重复比磷酸钙好但对细胞有一定的毒副作用转染时需除血清且一般只用于bsc1cv1cos细胞系sigmaaldrichdeaedextrantransfectionkit磷酸钙法磷酸钙dna复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转转染不适用于原代细胞所需的dna度较高操作简便但重复性差有些细胞不适用细胞建议用cscl梯度离心转染是拷贝数较多gibcobrlpromega阳离子脂质体带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合
瞬时转染和稳定转染的比较
瞬时转染和稳定转染的比较
1.瞬时转染（transient transfection）：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24~72h小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统和荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
导入的遗传物质的高拷贝数导致高水平的蛋白质表达。
单拷贝数或低拷贝数的稳定整合的致较低水平的蛋白质表达。
通常在转染后24-96小时内收获细胞。
需要2-3周的时间筛选出稳定转染的细胞克隆。
通常不适合使用具有诱导型启动子的载体的研究。
适用于使用带有诱导型启动子的载体的研究。
瞬时转染和稳定转染的比较
瞬转
稳转
导入的DNA没有整合到基因组中，而是保留在细胞核上
导入的DNA整合到基因组中
导入的遗传物质不传递到子代， 遗传改变只是暂时的
导入的遗传物质能够代代相传；遗传改变是永久的
不需要选择性筛选
需要选择性筛选出稳定转染的细胞
DNA载体和RNA都可用于瞬时转染
只有DNA载体可用于稳定转染，RNA本身不能稳定地导入细胞中
各种转染方法比较
各种转染方法比较
转染是一种常见的基因表达技术，在微生物、植物、动物等生物的基
因组研究与分析中被广泛应用。
它能够将外源DNA片段引入生物体，从而
产生基因表达，使得目的基因被特定的染色体位置激活。
此外，在转染中
作为功能基因的外源基因，可以约束提示其他的基因表达。
目前，转染在科学领域的应用众多，主要有包二聚体转染、质粒转染、酶联转染、质粒转化、脂质体转染、病毒转染等几种技术。
1、包二聚体转染
包二聚体转染是由三部分组成：DNA片段，10%二聚体和CaCl2溶液，将需要转染的DNA片段溶解在CaCl2溶液中，添加二聚体并调节pH值，
即可形成包二聚体复合体，将复合体注入细胞内，从而达到转染目的。
应
用包二聚体的转染方法可以很好地穿越细胞膜，可以达到突变外源基因的
目的，并且细胞损伤小，可以获得相对高的转染能力。
2、质粒转染
质粒转染是一种常见的转染技术，它是由PEG6000、KCl、CaCl2等混
合物组成，将要转染的DNA与混合物结合，然后把质粒-DNA复合物注入
细胞内，即可转染。
转录过程中慢病毒,腺病毒,逆转录病毒三种病毒表达系统的区别
慢病毒，腺病毒，逆转录病毒三种病毒表达系统的区别
慢病毒表达系统
一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究。
腺病毒表达系统
一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；但与慢病毒不同的是，腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合入宿主细胞的基因组中，而是游离于宿主基因组外独立表达，因此可实现目的基因瞬时、高丰度的表达，同时还避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性高。
逆转录病毒表达系统
逆转录病毒将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，可实现目的基因稳定、长期的表达逆转录病毒表达系统根据不同的包装细胞系可分为单嗜性、双嗜性和泛嗜性，不同包装细胞产生的逆转录病毒能够特异性地感染某一个或某一类宿主细胞。
辉骏生物采用的病毒包装细胞系为plat E 细胞系，该细胞系包含gag、pol和env基因，因此转染单一表达质粒就可以包装出逆转录病毒，但是该病毒具有很强的针对性，只适用于大鼠、小鼠细胞稳定株的建立。
三种病毒表达系统的特点。
关于三种荧光标记的短双链RNA体外转染特性的比较
关于三种荧光标记的短双链RNA体外转染特性的比较【摘要】目的：比较三种不同荧光标记的短双链RNA(siRNA)体外转染特性. 方法：利用脂质体LipofectamieTM2000转染三种荧光标记siRNA入小鼠胚胎成纤维细胞系NIH 3T3，流式细胞仪观察转染效率，普通倒置荧光显微镜观察其淬灭情况，激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的分布情况. 结果：相同转染条件下三种荧光siRNA进入细胞的速度，细胞内的定位不同，转染效率不同，三种荧光标记的抗淬灭能力也不同. 结论：荧光标记siRNA可以起到良好的示踪作用. 用荧光标记siRNA作为无荧光siRNA的分布和转染效率参照时，要考虑到所选用荧光标记siRNA与无荧光标记siRNA的差异.【关键词】荧光标记；siRNA；转染【Abstract】 AIM: To compare the transfection character of three different fluorescently labeled small interfering RNA (siRNA) in vitro. METHODS: Three fluorescently labeled siRNA were transfected with LipofectamieTM2000 into NIH 3T3 cells for moni toring theirtransfection efficiency with flow cytometry， tracking their delivery with confocal microscopy and checking their photostability with fluorescent microscope. RESULTS: These three fluorescently labeled siRNA varied in intracellular distribution， transfection efficiency and quench speed. CONCLUSION: The fluorescence labeled siRNA helps totracking the delivery of siRNA in cells. The difference between fluorescently labeled siRNA and unlabeled siRNA should be considered when the fluorescently labeled siRNA is used to study the distribution and transfection efficiency of siRNA.【Keywords】 fluorescence label；small interfering RNA；transfection0 引言化学合成的siRNA可以高效特异地抑制靶基因的表达，不仅是分析基因功能的有力工具且有望成为新型药物［1］，但递送效率低和体内有效性问题仍然是其应用的瓶颈，因此，深入研究其在体内的分布和动力学过程已逐步受到重视［2］.利用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等方法检测荧光标记siRNA［3］，观察其摄取、分布及代谢情况，借以推断无荧光标记siRNA的转染效率和分布. 然而目前虽有多种商品化无沉默效应的荧光标记siRNA可供选择，但它们的分布和转染效率是否一致尚少见报道. 本研究比较三种常用荧光标记siRNA利用脂质体转染时转染效率、荧光淬灭情况和细胞内分布特点，以探讨应用荧光标记siRNA时需注意的问题.1 材料和方法1.1 材料三种荧光siRNA分别为：BLOCK iTTM荧光寡聚物(序列未公开)购自Invitrogen公司；FAM no��target siRNA(正义链5′��UUCUCCGAACGUGUCACGU��3′，FAM标记于5′端)购自广州锐博公司；Alexa Fluor 546阴性对照siRNA(靶序列5′��AATTCTCCGAACGTGTCACGT��3′，正义链3′端3标记Alexa Fluor 546)购自Qiagen公司. 前两种为即用型，后一种按照说明书方法加入退火缓冲液，90℃变性并退火，分装后避光保存于-20℃. 三种荧光siRNA的储备液浓度均为20 μmol/L. 小鼠胚胎纤维细胞系NIH3T3由中山大学实验动物中心细胞库冻存；高糖DMEM培养基和DPBS购自Gibco BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青工程材料研究所；脂质体LipofectamineTM 2000，Opti��MEM低血清培养基购自Invitrogen公司；Hochest33342购自美国Sigma公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂.1.2 方法1.2.1 细胞培养与转染NIH3T3细胞常规培养于含100 mL/L胎牛血清无抗生素高糖DMEM培养基，每孔4×104个细胞接种24孔板，24 h后细胞的汇合度达40％. 用LipofectamineTM 2000转染荧光siRNA，按照说明书操作进行. 不同浓度转染效率时siRNA各组终浓度分别为0.5，5，40，120 nmol/L，LipofectamineTM 2000均为1 μL. siRNA进入细胞速度时转染复合物孵育时间分别为1，2，4，6和24h，siRNA浓度均为40 nmol/L，每组不同时间重复3次；观察淬灭情况和共聚焦观察细胞内分布时采用40 nmol/L，观察时间为4 h.1.2.2 流式细胞仪检测荧光siRNA转染效率各组细胞用DPBS冲洗2次，0.25 g/L胰蛋白酶消化，用DPBS制成150 μL单细胞悬液，冰上运输，BD FACSAria流式细胞仪检测，CellQuest软件记录分析.1.2.3 普通荧光显微镜观察淬灭情况和细胞内分布模式转染后6 h后将24孔板直接置于倒置荧光显微镜(Leica DMIRE)载物台上观察，cold CCD数码相机Leica Qwin软件照相. 拍第一张照片时间记为0 min，分别于3 min和5 min后不改动成像参数同一位置再拍摄两张，观察荧光淬灭情况.1.2.4 激光共聚焦显微镜观察［4］细胞铺板时24孔板中放灭菌圆形盖玻片，转染后6 h培养液中加入Hoechst 33342(终浓度5 mg/L)孵育10 min染核，用DPBS洗3遍后，取出爬片，-20℃预冷丙酮固定10 min，PBS洗3遍，抗淬灭水性封片剂封片. Zeiss LSM 510 META共聚焦显微镜40倍物镜下观察，BLOCK��iTTM荧光寡聚物和FAM no��target siRNA使用488 nm激发光和515～540 nm滤片检测；Alexa Fluor 546阴性对照siRNA使用568 nm激发光和575～640 nm检测滤片.统计学处理：采用SPSS 13. 0统计软件处理，χ2分析转染效率差异，P<0.05为差异具有统计学意义.2 结果2.1 FCM检测荧光siRNA转染效率每一样品收集2×104个细胞，设定一个单细胞区域P1用于荧光分析. 以未转染的细胞作为空白对照，设定阳性细胞区(P2区)使阴性对照P区细胞数不超过0.1%(图1A). 40 nmol/L siRNA转染4 h时转染效率Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率为(62.7±2.4)%， BLOCK��iTTM荧光寡聚物的转染效率为(85.1±5.2)%， FAM no��target siRNA的转染效率为(69.4±3.6)%. χ2分析示Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率显著低于BLOCK iTTM荧光寡聚物(P=0.037)，BLOCK��iTTM荧光寡聚物的转染效率显著高于FAM no��target siRNA的转染效率(P=0.017)，Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率低于FAM no��target siRNA BLOCK��iTTM荧光寡聚物(P=0.000). 随着siRNA浓度增加(图1B)和转染复合物孵育时间延长(图1C)，三种荧光标记siRNA的转染效率增加， 6 h和24 h转染效率相差不大，唯FAM no��target siRNA 24 h转染效率为(59.3±2.5)%. BLOCK��iTTM荧光寡聚物在0.5 nmol/L和5 nmol/L浓度时，转染效率就达FAM��siRNA (27.9±2.5)%和(77.3±3.7)%，孵育1 h和2 h 转染效率达(54.1±4.9)%和(78.2±3.6)%，高于其它两种(P=0.000).2.2 普通荧光显微镜观察淬灭情况和细胞内分布模式三种荧光siRNA在普通荧光显微镜下的荧光模式不同. Alexa Fluor 546阴性对照siRNA倾向于以较大颗粒分布在核周胞浆内(图2A， B， C， D)；BLOCK��iTTM荧光寡聚物胞浆、胞核中都有，在胞核中的荧光强度很高(图2E，F， G， H)；FAM no��target siRNA为细小点状荧光信号，分布于胞浆和胞核中(图2I， J， K， L). 用荧光显微镜照射3 min(图2C， G， K)和5 min(图2D， H， L)发现Alexa Fluor 546阴性对照siRNA抗淬灭能力最高，BLOCK��iTTM荧光寡聚物居中，FAM no��target siRNA最低，3 min已几乎完全淬灭. BLOCK��iTTM荧光寡聚物胞浆中的荧光信号先淬灭，而后是胞核中的. 无siRNA只加LipofectamineTM 2000转染试剂的细胞未见荧光(结果未显示).2.3 激光共聚焦显微镜观察三种荧光siRNA细胞内定位40 nmol/L各种siRNA转染后4 h，Alexa Fluor 546阴性对照siRNA为点状的荧光，多数位于近核胞浆中(图3A，D)；BLOCK��iTTM荧光寡聚物(图3B，E)和FAM no��target siRNA(图3C，F)的模式相似，在核内和胞浆中都可见，部分呈荧光颗粒.3 讨论脂质体转染是体外导入化学合成siRNA的标准方法，siRNA体外转染实验报道中使用最多的转染试剂是LipofectamineTM 2000，对许多细胞可以获得很高的转染效率和基因沉默效率［3］，所以本研究也选用该试剂作为转染试剂比较三种荧光标记siRNA的体外转染特性.本实验发现在相同的转染条件下，三种荧光siRNA的转染效率不同；BLOCK��iTTM荧光寡聚物更易进入细胞，原因可能因为它的核糖骨架经过磷硫酰化修饰［5］，所以其进入细胞的速度明显增加. 转染6 h和24 h的效率相差不大，可见LipofectamineTM 2000推荐4 h和6 h更换转染复合物比较合理，但注意到Alexa Fluor 546阴性对照siRNA 4 h和6 h的转染效率相差仍比较明显，所以6 h更换转染复合物更加合适. FAM no��target siRNA 24 h转染效率降低为59.3%，原因可能是荧光素淬灭而非转染效率低.关于淬灭情况：标记siRNA的荧光物质有许多种，最早有荧光素(fluorescein，FAM)，后来的藻红素(cy系列)，alexa系列的荧光稳定性和可选择波长更进了一步. 本研究三种荧光siRNA中荧光素FAM no��target siRNA采用的是FAM标记，BLOCK��iTTM荧光寡聚物采用的FITC，似乎都为荧光素，但后者经磷硫酰化修饰，稳定性增强，所以其抗淬灭能力也有所增强. Alexa Fluor 546阴性对照siRNA采用的是Alexa fluor546，其中Alexa fluor546标记的siRNA的抗淬灭能力最强.关于细胞内的定位：脂质体转染情况下，siRNA脂质体复合物首先沉积并粘附于细胞表面，然后通过胞吞作用进入细胞形成内含体，在胞浆中通过动力蛋白驱动定向运送到核周区，并迅速在核周区聚集［6］，最后siRNA从脂质体复合物中释放出来才能发挥作用. 本研究中用共聚焦显微镜观察发现Alexa Fluor 546阴性对照siRNA几乎只以颗粒状分布于近核胞浆中，与Chiu等［3］报道的用LipofectamineTM 2000转染cy3标记的siRNA结果一致，而BLOCK��iTTM荧光寡聚物和FAM no��target siRNA在核内和胞浆中都有，在胞浆中核周区可见大的荧光颗粒. 其中BLOCK��iTTM荧光寡聚物的核定位考虑与其磷硫酰化修饰有关，而FAM no��target siRNA为正义链5′标记，其核定位可能为与其复合物中混合有单链siRNA有关. Ohrt等［7］显微注射荧光标记的siRNA入Hela细胞的胞浆中，发现双链siRNA不能进入细胞核，而单链siRNA有明显聚集于核内的倾向. 而Alexa Fluor 546阴性对照siRNA未于见核中可能因为siRNA还未从脂质体复合物中释放. 而siRNA从复合物中释放是与基因沉默效果相关的，是否说明荧光标记影响基因沉默效果还有待分析.综上所述，选取合适的荧光标记siRNA作为转染效率评估指标和用于细胞内分布研究时，要注意荧光标记物对siRNA的影响，以及靶向目的基因的siRNA与所选用荧光标记的对照siRNA在化学修饰等因素方面的相似性.参考文献［1］Dykxhoorn DM， Lieberman J. Running interference: Prospects and obstacles to using small interfering RNAs as small molecule drugs［J］. Annu Rev Biomed Eng， 2006， 8:377-402.［2］Corey DR. RNA learns from antisense［J］. Nat Chem Biol，2007， 3(1): 8-11.［3］Chiu YL， Ali A， Chu CY， et al. Visualizing a correlation between siRNA localization， cellular uptake， and RNAi in living cells ［J］. Chem Biol， 2004， 11(8):1165-1175.［4］Akita H， Ito R， Khalil IA， et al. Quantitativethree��dimensional analysis of the intracellular trafficking ofplasmid DNA transfected by a nonviral gene delivery system usingconfocal laser scanning microscopy［J］. Mol Ther， 2004， 9(3):443-451.［5］Fisher TL， Terhorst T， Cao X， et al. 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各种转染方法比较
各种转染方法比较不同的实验室转染方法选择会依赖于多个相关因素，如目标细胞类型、转染效率、细胞毒性、需求的表达时间、实验的规模和预算等。
以下是一些常见的转染方法的比较：1. 离子交换法（Calcium phosphate transfection）离子交换法是最早开发和使用的转染方法之一、它使用磷酸钙和DNA或RNA的复合物在细胞表面形成凝析沉淀物。
该方法简单、经济且较为普遍，适用于许多细胞类型。
然而，它的转染效率较低，存在较多的细胞毒性。
2. 迷走转染法（Lipofection）迷走转染法是当前最常用的转染技术之一，通过磷脂体（例如Lipofectamine）与质粒DNA形成复合物。
该方法转染效率高，而且适用于许多类型的细胞，包括哺乳动物和非哺乳动物。
然而，迷走转染法存在一些限制，如细胞毒性、稳定性较差，和细胞特异性。
3. 电穿孔法（Electroporation）电穿孔法是通过应用电场使细胞膜暂时性孔化来实现转染效果。
它可以用于转染各种类型的细胞，包括哺乳动物、鸟类和植物。
电穿孔法的转染效率高，但存在一定的细胞毒性和细胞损伤风险。
此外，电穿孔设备的成本较高，需要专门训练的技术人员来操作。
4. 病毒载体转染法（Viral vector transfection）病毒载体转染法使用经修饰的病毒作为转染载体，可实现高效的基因传递和表达。
常用的病毒载体包括腺病毒、衣壳病毒和逆转录病毒。
这些病毒对于不同类型的细胞具有不同的亲和力和转染效率。
然而，病毒载体转染法的主要限制是细胞对病毒的感染能力，以及在临床应用中可能引发的安全性问题。
5. 直接注射法（Direct microinjection）直接注射法是一种机械刺伤细胞膜直接将DNA注入细胞的方法。
这种方法对于特定的细胞类型具有高效转染的能力，如哺乳动物受精卵和干细胞。
它可以实现精确控制和单细胞水平的转染，但需要昂贵的设备和专业技能。
总结起来，转染方法的选择应根据实验的具体需求来进行。
慢病毒，腺病毒转染
慢病毒，腺病毒转染质粒转染是可以构建稳转细胞的，但是耗时⽐较长，需要G418等药物的筛选，⽐较费时费⼒，不过成本要⼩⼀些，慢病毒⼏乎可以感染所有种类的细胞，将含有⽬的基因的慢病毒颗粒感染宿主细胞，⽬的基因被整合到宿主染⾊体上，采⽤相应的抗⽣素进⾏筛选，得到稳定表达⽬的蛋⽩的细胞株。
步骤内容说明获取⽬的基因客户提供序列或模板，通过全基因合成或通过PCR扩增得到构建慢病毒载体采⽤酶切、连接和转化等⽅法，构建慢病毒载体包装慢病毒颗粒转染细胞，包装慢病毒颗粒，纯化并测定滴度慢病毒颗粒感染⽬的慢病毒颗粒感染⽬的细胞，加⼊抗⽣素筛选稳定细胞株细胞稳定细胞株鉴定采⽤合适的⽅法，检测⽬的蛋⽩的持续表达腺病毒载体特点1.可感染的细胞种类多，宿主范围⼴，⼏乎可以感染所有类型的细胞。
2.感染效率⾼，特别适合质粒载体转染效率低的细胞，如原代培养细胞，神经细胞等，且外源基因表达⽔平较⾼。
3.包装外源基因的⽚段⼤，⾼达8kb。
4.腺病毒载体构建及包装容易操作，易于制备出滴度⾼的⼤量病毒。
5.当腺病毒感染细胞后，病毒基因组存在于细胞染⾊体外，不整合到细胞染⾊体中，避免了因整合引起的基因突变及激活致癌基因，⽣物安全性⾼。
慢病毒与腺病毒转染区别：1.转染效率：慢病毒较⾼2.慢病毒可以实现稳定转染，腺病毒是瞬时转染3.包装量：慢病毒可以包装4kb左右，不超过8kb的外源基因，腺病毒可以包装8kb左右外源基因4.慢病毒操作较⽅便，周期也短。
但腺病毒表达快，1-2天，慢病毒要2-4天。
5.安全性：两个差不多6.感染细胞类型：都可以感染分裂和不分裂的细胞7.免疫原性：腺病毒⾼免疫原性，慢病毒低免疫原性8.腺病毒不能得到转基因动物，慢病毒可以9.产⽣的病毒滴度，腺病毒要⾼些。
各种细胞转染方法比较
各种细胞转染方法比较细胞转染方法包括DEAE－葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，阳离子聚合物，病毒介导法，Biolistic 颗粒传递法（基因枪粒子轰击法），显微注射法，电穿孔法等，对各种方法的原理，应用，特点，厂家产品等信息的比较结果如下表：转染方法原理主要应用特点厂家及产品DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时转染相对简便、重复比磷酸钙好，但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清且一般只用于BSC-1，CV-1，COS细胞系Sigma-Aldrich(DEAE-DextranTransfectionKit)磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染，染瞬转染不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高），操作简便但重复性差，有些细胞不适用细胞建议用CSCL梯度离心，转染是拷贝数较多GIBCO BRL ，Promega阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。
(若DNA浓度过高，中和脂质体表面电核，而降低了与细胞的结合能力)稳定转染，瞬时转染，所有细胞使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。
虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用Invitrogen（Lipofectamine 2000，Lipofectamine，Lipofectin，LipofectaminePlus，Cellfectin）Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE6）CPG Biotech Co（GeneLimoPlus，GeneLimoSuper）Promega（Transfast，Tfx，Transfectam）阳离子聚合物带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多稳定转染，瞬时转染，所有细胞除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点，是新一代的转染试剂。
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三种病毒转染的异同点
一、病毒表达系统简介
病毒载体是指以病毒为基础的载体，也是目前最常用的基因导入方式之一。
通过对病毒基因组的遗传改造，使之能够携带外源目的基因和相关的病毒元件，并被包装成病毒颗粒。
病毒进而侵染宿主，使携带的外源基因在宿主体表达。
病毒的基因组可分为编码区和非编码区。
其中，编码区包含病毒的必需基因和非必需基因，可分别表达产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；非编码区则含有病毒复制和包装所需的全部顺式作用元件。
由于野生型病毒常常具有致病性，为了避免实验或治疗中使用的病毒恢复成野生型，必须对病毒载体进行一系列的遗传改造。
譬如删除病毒基因组的非必需区，将顺式作用元件和反式作用元件分开连接至不同的载体上，或结合利用不同种病毒的必需蛋白等，最大程度地保证实验的安全性。
哺乳动物病毒表达系统常常包含一到多个载体，将所需的载体转染包装细胞后，在反式因子的作用下，病毒复制、包装所需的顺式作用元件和外源基因表达盒即可被包装，最终产生带有外源基因的病毒颗粒。
经浓缩和纯化后的病毒液即可用于侵染目标宿主细胞或动物体，实现外源目的基因在宿主体的表达。
二、病毒表达系统的优势
病毒的转导效率比常规真核表达载体高很多，因此特别适合于介导外源基因在难转染甚至无法转染的哺乳动物细胞中表达。
三、辉骏生物病毒服务简介
辉骏生物的病毒产品包括慢病毒、腺病毒和逆转录病毒，服务项目包括：各类病毒载体的构建和病毒包装，以及慢病毒介导的稳定表达株建立等。
慢病毒表达系统：一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究。
图1 慢病毒感染宿主细胞原理图
..
腺病毒表达系统：一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；但与慢病毒不同的是，腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合入宿主细胞的基因组中，而是游离于宿主基因组外独立表达，因此可实现目的基因瞬时、高丰度的表达，同时还避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性高。
图2 腺病毒感染宿主细胞原理图
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逆转录病毒表达系统：逆转录病毒将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，可实现目的基因稳定、长期的表达。
逆转录病毒表达系统根据不同的包装细胞系可分为单嗜性、双嗜性和泛嗜性，不同包装细胞产生的逆转录病毒能够特异性地感染某一个或某一类宿主细胞。
辉骏生物采用的病毒包装细胞系为plat E细胞系，该细胞系包含gag、pol和env基因，因此转染单一表达质粒就可以包装出逆转录病毒，但是该病毒具有很强的针对性，只适用于大鼠、小鼠细胞稳定株的建立。
图3 逆转录病毒感染宿主细胞原理图
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四、辉骏生物三种病毒表达系统的特点
表1三种病毒表达系统的特点
五、辉骏生物病毒包装和稳定株构建流程
辉骏生物提供的病毒服务可分为三部分：
A.病毒载体的构建：将目的基因片段连接至病毒载体；
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B. 病毒包装：重组病毒质粒（或与包装质粒一起）转染包装细胞；收集病毒颗粒，浓缩后进行滴度测试；
C. 稳定细胞株的建立（仅针对慢病毒）：分别使用实验组和对照组慢病毒感染细胞，建立实验组和对照组的稳定细胞株。
图4病毒包装和稳定株构建流程
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六、辉骏生物病毒服务项目
辉骏生物的病毒服务项目包括了基因钓取、RNAi设计、载体构建、病毒包装、稳定细胞株建立和表达/干扰检测等全套服务容。
除此之外，我们还可以提供个性化的定制服务，您只需要将实验目的告诉我们，即可享受高品质的实验服务体验。
表2辉骏生物病毒服务项目列表
本文相关标签参考：稳定株构建慢病毒病毒服务病毒包装服务
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