病毒载体
疫苗研发中的病毒载体技术
疫苗研发中的病毒载体技术新冠病毒的爆发让全球陷入了一场前所未有的危机当中，疫苗成为了人们最为关注的话题之一。
在这场疫情下，病毒载体技术成为了备受关注的关键疫苗研发技术。
什么是病毒载体技术？病毒载体技术，是将目标抗原基因和病毒基因组进行重组，从而将目标抗原表达在病毒表面并刺激免疫反应的一种技术手段。
具体而言，就是将病毒作为载体，将目标抗原的基因组加入病毒基因组中，经过相关工艺生产疫苗，上市后即可作为疫苗接种。
以新冠疫苗为例，当前已有的疫苗大多采用了病毒载体技术。
这些疫苗通过将新冠病毒的抗原基因进行重组，将这些基因插入到另外一个已知能够安全的病毒上，通过制备病毒疫苗刺激免疫系统应对新冠病毒而产生的保护性免疫。
病毒载体技术能够有效提升疫苗的有效性病毒载体技术在疫苗研发中，可以大大提升疫苗的有效性。
这是因为在病毒载体技术下，新冠病毒的抗原基因会由病毒本身来表达出来。
而病毒的基因组，能很好的将抗原基因与病毒结合在一起，并能够通过病毒自身的生物反应基础来制备疫苗，从而使得疫苗楹特别安全和有效。
此外，病毒载体技术还能够将多个抗原基因进行合并，以刺激更加强大的免疫系统反应，从而在疾病预防和治疗方面发挥着越来越重要的作用。
比如，在SARS的全球大范围大流行期间，首次使用了病毒载体技术，成功研发出了对SARS的冠状病毒的疫苗。
这也说明了该技术在抗击全球传染病方面的潜在应用性。
重要的生产工艺流程病毒载体技术在疫苗研发流程中，需要进行病毒重组和制备过程。
在进行病毒重组时，科学家们需要先进行核酸重组，将目标抗原基因与病毒基因进行重组，得到新的暂时性重组物。
随后，科学家们需要通过慢慢提升筛选程序，得到最终的重组病毒，这样就能够让其完美表达目标病原体的识别位点并成功制备出疫苗。
制备疫苗的过程，需要严格遵循生产流程，在一个安全的环境中，利用病毒来进行疫苗制剂的制备。
在这个过程中，制造工程师和质量保障人员需要协同合作，确保生产过程中的物质流动和工艺优化符合标准，疫苗的生产批次均匀，并且有足够的放大因素以及所需要的存储条件，以确保疫苗能够安全有效地被运输至各个角落，并能够抵抗各种外在的环境影响。
维真生物-如何阅读基因载体图谱
如何阅读基因载体图谱1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。
可发生于完整活体或是细胞培养中。
可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。
用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件：（1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒；（2）介导外源基因的转移和表达；（3）对人体不致病；（4）在环境中不会引起增殖和传播。
非病毒载体一般是指质粒DNA。
2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。
3、按功能分类：克隆载体、表达载体克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。
表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。
1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。
Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。
2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+（1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。
（5）hygr：使潮霉素β失活。
3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
还要再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
生物医学中的病毒载体技术
生物医学中的病毒载体技术在生物医学领域中，病毒载体技术被广泛应用于基因治疗、疫苗开发、基因工程和研究及诊断等方面。
病毒载体是一种携带和传递遗传物质的工具，是一种经过改造的病毒，可以将需要表达的基因载入病毒中转运到目标细胞中，实现基因的治疗和修改，是基因治疗的核心技术之一。
病毒载体技术的应用病毒载体技术在基因治疗中的应用是其最为广泛的领域。
基因治疗是一种通过向患者体内注入携带着具有治疗效果的基因或基因片段的生物材料来治疗疾病的方法。
病毒载体技术可以将需要表达的基因载入病毒中，转运到目标细胞内，并在里面释放出来，从而实现基因的治疗和修改。
病毒载体技术在疫苗开发领域中也得到了广泛的应用。
疫苗是一种预防疾病的生物制剂，病毒载体技术可以将病毒中携带有表达病原酶毒素等蛋白的基因，将其转化为病毒载体表达出来，从而促使机体产生免疫反应，对抗疾病。
病毒载体技术在基因工程和研究领域也有着广泛的应用。
科学家们可以利用病毒载体技术构建新的基因模型，从而研究基因的功能和相互作用，为科学家们深入研究基因提供了便利。
病毒载体技术在疾病诊断中也有着广泛的应用。
如HIV病毒的检测，利用了病毒载体技术将病毒中的基因片段与患者体内的血清反应，从而可以实现对HIV病毒的精确检测，辅助医生做出正确的诊断和治疗决策。
病毒载体技术的发展和优化病毒载体技术的发展可以追溯至上世纪80年代，当时科学家们利用腺病毒作为病毒载体，将外来基因载入细胞中，并在目标细胞中进行表达。
但这种方法存在诸多挑战，如感染杂质症状，免疫反应等。
随后，科学家们又利用了其他病毒载体，如腺相关病毒（AAV）、腺病毒（Adenovirus）等，并进行了大量的优化和改良，以提高其稳定性和效率，降低免疫系统的抵抗力，从而实现更有效的基因治疗和疫苗开发。
随着人类对疾病治疗、预防以及理解基因的需求不断增加，病毒载体技术也在不断地发展和优化。
一方面，科学家们对已有的病毒载体进行了改进，改善其功能，完善其性能；另一方面，科学家们寻求更适合的病毒载体，如双链RNA病毒、退病毒、负链RNA病毒等，以更好地发挥基因治疗和疫苗开发的作用。
病毒载体在基因工程中的优势与应用案例
病毒载体在基因工程中的优势与应用案例基因工程是一门通过DNA分子的重组技术来改变或者改造生物体基因结构的科学技术。
它不仅可以用于基础研究，还可以应用于医学、农业和工业领域。
在基因工程中，病毒载体作为一种重要的工具，具有许多独特的优势和广泛的应用。
本文将介绍病毒载体在基因工程中的优势，并举几个应用案例进行讨论。
病毒载体在基因工程中的优势之一是其高度选择性，可以将外源基因有效地嵌入到宿主细胞的基因组中。
病毒载体的基因组通常很小，可以携带和传递较长的DNA序列。
此外，病毒载体经过长时间的进化，已经具备了高度有效的侵染宿主细胞的能力。
利用这些特性，科学家可以使用病毒载体来将目标基因传递到特定类型的细胞中，从而实现基因工程的目的。
其次，病毒载体在插入目标基因时具有高效性。
病毒载体可以很容易地与外源基因重组，使得目标基因在宿主细胞中高效表达。
病毒侵染细胞的过程中，目标基因会被病毒载体运输并插入宿主细胞的基因组中，从而可以在细胞内产生目标蛋白。
这种高效的表达方式使得病毒载体在基因工程中得到了广泛应用。
病毒载体还具有广泛的宿主范围，可以感染多种类型的细胞。
这一特性使得病毒载体在基因工程中的应用更加灵活多样。
不同的病毒载体适用于不同类型的细胞，科学家可以根据需求选择合适的病毒载体进行基因传递。
例如，腺病毒载体可以感染多种哺乳动物细胞，而慢病毒载体则可以感染较广泛范围的细胞类型。
下面，我们将介绍两个病毒载体在基因工程中的应用案例。
第一个应用案例是利用腺病毒载体进行基因治疗。
腺病毒载体具有高度感染人体细胞的能力，被广泛应用于基因治疗领域。
基因治疗是一种将正常基因导入病人体内，以纠正遗传性基因缺陷或者改善疾病症状的方法。
例如，在严重联免疫缺陷病患者中，科学家使用腺病毒载体将正常的免疫系统基因导入患者的造血干细胞中，以恢复其免疫功能。
第二个应用案例是利用慢病毒载体进行基因敲除。
慢病毒载体具有稳定的遗传物质传递能力，被广泛应用于基因组编辑和基因敲除中。
分子生物学 总结---病毒载体
基因工程与基因治疗的比较：1、概念：基因工程是将具有价值的目的基因，装配在具有表达元件的特定载体中，导入相应的宿主如细菌、酵母或哺乳动物细胞中，在体外进行扩增，经分离、纯化后获得其表达的蛋白产物。
基因治疗是将具有治疗价值的基因，即“治疗基因”装配于带有在人体细胞中表达所必备元件的载体中，导入人体细胞，直接进行表达。
2、进行基因治疗时无需对表达产物进行分离纯化，因为人细胞本身可以完成这个过程。
3、基因工程的“目的基因”主要是可分泌蛋白，如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体等。
基因治疗不受以上限制，几乎所有的基因，只要其具有治疗作用，均可应用于基因治疗。
4、基因工程的操作全部在体外完成，基因治疗则必须将基因直接导入人体细胞。
途径：1、ex vivo：将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体（异种）细胞，这种细胞被称为基因工程化的细胞，经体外细胞扩增后输回人体。
2、in vivo：将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体上，直接导入人体内。
基因治疗中的病毒载体应具备的条件：1、携带外源基因并能装配成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体没有致病力。
（使其成为复制缺陷型病毒并删除致癌基因）分类：1、重组型病毒载体：以完整的病毒基因组作为改造对象，在不改变病毒复制和包装所需的顺式作用元件的情况下，有选择性地删除病毒的某些必须基因，尤其是前早期或早期基因以控制其表达，所缺失的必需基因的功能由同时导入细胞中的外源基因表达单元提供，一般通过同源重组方法将目的基因插入到病毒基因组中。
2、无病毒基因的病毒载体：重组载体+辅助系统重组载体主要由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必须的顺式作用元件及载体骨架组成。
辅助系统包括病毒复制和包装所必须的所有反式作用元件。
在辅助系统的作用下，重组载体以特定形式（单链或双链DNA或RNA）被包装到不含有任何病毒基因组的病毒颗粒中。
优点：载体病毒本身安全性好，容量大。
病毒载体的构建1
病毒载体实验
DNA提取 商品化病毒 载体
各种试剂
PCR扩增
扩增产物与病 毒载体结合
DNA提取 试剂盒
感染细菌、 真菌或细胞 表达成蛋白 检测（WB
PCR试剂盒 结合试剂盒
，电泳比较 大小，免疫 组化）
联接试剂盒
Smad6、7基因腺相关病毒（AAV）载体的构建及表达
1、Smad6、7基因质粒的提取和片段回收： 把含Smad6、7基因pcDNA3经电穿孔法转 入E.coli，LB培养后用质粒提取试剂盒提取质 粒。 用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切Smad6、7，凝 胶电泳鉴定，切胶回收试剂盒回收。
dna提取pcr扩增扩增产物与病毒载体结合感染细菌真菌或细胞表达成蛋白检测wb电泳比较大小免疫dna提取试剂盒pcr试剂盒商品化病毒载体联接试剂盒结合试剂盒各种试剂smad67基因腺相关病毒aav载体的构建及表达1smad67基因质粒的提取和片段回收
病毒载体的构建
市场部：曹磊
病毒
病毒(virus)是由一 个核酸分子（DNA 或RNA）与蛋白质 构成的非细胞形态 的营寄生生活的生 命体。不具细胞结 构，具有遗传、复 制等生命特征。
病毒载体概述
病毒载体是一种常使用于分子生物学的工具，可 将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其 基因组进入其他细胞，进行感染的分子机制。可发 生于完整活体或是细胞培养中。可应用于基础研究、 基因疗法或疫苗。 可供利用的病毒可分为逆转录病毒、慢病毒与腺病 毒。
病毒基因组可分为编码区和 非编码区。编码区基因产生病 毒的结构蛋白和非结构蛋白； 非编码区中含有病毒进行复制 和包装等功能所必需的顺式作 用元件。基因重组技术的发展 使病毒载体的产生成为可能。 最简单的做法是，将适当长度 的外源DNA插入病毒基因组 的非必需区，包装成重组病毒 颗粒。
三种病毒转染的异同点
三种病毒转染的异同点一、病毒表达系统简介病毒载体是指以病毒为基础的载体，也是目前最常用的基因导入方式之一.通过对病毒基因组的遗传改造,使之能够携带外源目的基因和相关的病毒元件,并被包装成病毒颗粒。
病毒进而侵染宿主，使携带的外源基因在宿主体内表达.病毒的基因组可分为编码区和非编码区.其中，编码区包含病毒的必需基因和非必需基因，可分别表达产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；非编码区则含有病毒复制和包装所需的全部顺式作用元件。
由于野生型病毒常常具有致病性，为了避免实验或治疗中使用的病毒恢复成野生型，必须对病毒载体进行一系列的遗传改造。
譬如删除病毒基因组的非必需区，将顺式作用元件和反式作用元件分开连接至不同的载体上，或结合利用不同种病毒的必需蛋白等,最大程度地保证实验的安全性.哺乳动物病毒表达系统常常包含一到多个载体，将所需的载体转染包装细胞后,在反式因子的作用下,病毒复制、包装所需的顺式作用元件和外源基因表达盒即可被包装,最终产生带有外源基因的病毒颗粒。
经浓缩和纯化后的病毒液即可用于侵染目标宿主细胞或动物体，实现外源目的基因在宿主体内的表达。
二、病毒表达系统的优势病毒的转导效率比常规真核表达载体高很多，因此特别适合于介导外源基因在难转染甚至无法转染的哺乳动物细胞中表达。
三、辉骏生物病毒服务简介辉骏生物的病毒产品包括慢病毒、腺病毒和逆转录病毒，服务项目包括:各类病毒载体的构建和病毒包装，以及慢病毒介导的稳定表达株建立等。
慢病毒表达系统：一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中,实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究。
图1 慢病毒感染宿主细胞原理图腺病毒表达系统：一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；但与慢病毒不同的是，腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合入宿主细胞的基因组中，而是游离于宿主基因组外独立表达，因此可实现目的基因瞬时、高丰度的表达，同时还避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性高。
基因载体名词解释
基因载体名词解释基因载体是指能够携带外源DNA进入细胞并使其复制繁殖的分子，通常是一种圆形、线性或环形的DNA分子。
基因载体在基因工程和生物技术中扮演着非常重要的角色，可以被用于DNA序列的克隆、表达和传递等方面。
下面是一些常见的基因载体名词解释：1.质粒（Plasmid）质粒是一种环形DNA分子，通常存在于细菌和酵母等微生物细胞内。
质粒可以被用作基因工程的载体，通过插入外源DNA序列来实现基因克隆和表达。
2.噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌细胞内的病毒，可以感染并复制繁殖在细菌细胞内。
噬菌体可以被用作基因工程的载体，通过插入外源DNA 序列来实现基因克隆和表达。
3.表达载体（Expression Vector）表达载体是一种专门用于外源基因表达的基因载体，通常包含有启动子、转录终止子、选择标记等功能元件，可以实现对外源基因的高效表达。
4.病毒载体（Viral Vector）病毒载体是一种基因载体，可以将外源基因导入宿主细胞中，并利用病毒的自身复制机制实现外源基因的表达。
病毒载体可以用于基因治疗、基因疫苗等方面。
5.贝壳素粒子（Shell Vial Particle）贝壳素粒子是一种基于病毒样颗粒（VLP）的基因载体，可以用于疫苗研究和制备。
贝壳素粒子在疫苗制备中具有很高的应用价值，可以实现对多种病原体的有效预防和控制。
6.人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是一种基因载体，可以模拟自然染色体的结构和功能，用于基因治疗、基因修复等方面。
人工染色体可以携带大量的外源DNA序列，并实现稳定的遗传转移和表达。
7.负载（Payload）负载是指基因载体中携带的外源DNA序列，通常包括了目标基因、选择标记、报告基因等。
负载的设计和选择对于基因工程的成功非常关键，需要考虑到载体的适应性、表达效率、稳定性等因素。
8.选择标记（Selection Marker）选择标记是指基因载体中用于筛选转化细胞的标记基因，通常包括了抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
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基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。
本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。
用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病。
然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。
因此需要对其进行改造后才能用于人体。
原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。
但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。
近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。
第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。
研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。
病毒基因组可分为编码区和非编码区。
编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。
非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。
一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。
最简单的做法是，将适当长度的外源DNA 插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。
比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。
由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染是非必需的，因此，该重组病毒可以在细胞中增殖传代。
用这种重组病毒感染细胞，能将lacZ基因带入细胞并高效表达。
用同样的方法，将AAV-2病毒的rep和cap基因片段（4.3kb）插入HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中，构建成具有提供重组AAV载体复制和包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc（伍志坚等，1999）。
然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。
首先，许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡；或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。
因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。
其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒（AAV，4.7kb）、反转录病毒（8～10kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。
因此，必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。
为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，除了可以删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。
病毒载体大体上可分为两种类型：重组型病毒载体：这类载体是以完整的病毒基因组为改造对象。
一般的步骤是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是立早基因或早期基因，或控制其表达；缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供；用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区；病毒复制和包装所需的顺式作用元件不变。
这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。
如在传统的重组腺病毒构建方法中，将外源基因表达盒（exogenous gene expression cassette）插入穿梭质粒（如pXCX2或pFGdX1）的腺病毒同源序列中，与辅助质粒（含有腺病毒基因组的质粒如JM17或pBHG）共转染293细胞，通过细胞内的同源重组获得含有外源基因的重组腺病毒（Graham FL and Prevec L1995）。
无病毒基因的病毒载体（gutless vectors）：这类载体在不同的病毒载体系统中的称谓不同。
对于腺病毒，一般称为mini-Ad；在HSV载体系统，一般称为扩增子（amplicon）载体或质粒型载体。
重组AAV载体也属于无病毒基因的病毒载体。
这类载体系统往往由载体质粒和辅助系统组成。
重组载体质粒主要由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成。
辅助系统包括病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件。
在辅助系统的作用下，重组载体质粒（包含或不包含质粒骨架）以特定形式（单链或双链，DNA或RNA）被包装到病毒壳粒中，其中不含有任何病毒基因。
这类病毒载体的优点在于载体病毒本身安全性好，容量大。
缺点在于往往需要辅助病毒参与载体DNA的包装，而辅助病毒又难以同载体病毒分离开来，造成最终产品中辅助病毒污染，从而影响其应用。
实际上，无病毒基因的病毒载体可以看作是重组病毒载体的一种极端减毒情况。
表1列举了几种常见的病毒载体的顺式作用元件和经典的包装方式。
载体顺式作用元件经典包装方式反转录病毒载体1）两个长末端重复序列（LTR）：含有整合和调节转录的必需序列；含有转录增强子和启动子；2）tRNA引物结合位点p；3）包装信号序列ψ。
载体质粒转染整合了所有必需基因（gag,pol,env）的包装细胞系如PA317，经选择培养获得产病毒细胞系（VPC）；细胞不裂解，病毒不断分泌至培养上清中。
腺病毒载体两个末端倒转重复序列（ITR）；包装信号序列。
载体质粒与辅助质粒共转染293细胞获得重组腺病毒。
重组腺病毒感染293细胞而扩增；细胞每次被感染后发生裂解。
腺病毒伴随病毒载体两个末端倒转重复序列（ITR）；其中包括了病毒复制起点、包装信号及整合和拯救所必需的顺式元件。
AAV载体质粒和辅助质粒共转染293细胞，并加辅助病毒（腺病毒或单纯疱疹病毒）感染。
单纯疱疹病毒载体HSV病毒复制起点ori；病毒包装信号pac。
PTCA重组病毒在互补细胞上传代；扩增子病毒在辅助病毒存在下传代。
第二节病毒载体的包装系统将外源基因包装到病毒壳粒中，是病毒载体生产的核心技术。
一般地，病毒载体的制备包括以下要素：宿主细胞虽然现在已有可能对有些病毒载体（如AAV载体）进行体外（无细胞）包装（Zhou XH et al. 1998;Ding L et al.1997），但是这种包装系统仍然需要细胞提取物，并且包装效率相当低，远远达不到可生产水平。
至今为止，病毒载体的包装主要是在对该病毒敏感的宿主细胞中进行的。
宿主细胞不但提供了病毒复制和包装的环境条件，许多细胞成分还直接参与了病毒复制和包装的过程。
病毒复制和包装所必需的顺式作用元件和外源基因的表达盒一般地，病毒复制和包装所必需的顺式作用元件和外源基因的表达盒由细菌质粒携带，组成病毒载体质粒，是被包装的对象。
由于病毒复制方式的不同，有些病毒载体如单纯疱疹病毒扩增子（HSV amplicon）载体在包装时，整个载体质粒都被包装进入病毒颗粒中；而有些病毒载体如反转录病毒、腺病毒伴随病毒载体的质粒骨架部分并不被包装到病毒颗粒中，只有病毒复制和包装所必需的顺式作用元件和外源基因表达盒被包装到病毒颗粒中。
构建重组型病毒载体时，病毒复制和包装所需的顺式作用元件存在于病毒基因组中（病毒基因组可以由具有感染性的病毒颗粒提供，也可以质粒形式提供）。
先将外源基因表达盒插入穿梭质粒携带的病毒同源序列中；将重组穿梭质粒转染至细胞中，再用辅助病毒超感染；或将重组穿梭质粒与病毒基因组质粒共转染细胞；重组质粒与病毒基因组在细胞中进行同源重组而产生表达外源基因的重组病毒。
重组腺病毒（Graham FL and Prevec L1995）和重组单纯疱疹病毒（Pyles RB et al.1997；Kramm CM et al.1997）的传统制备方法都是采用这种方式。
为了使病毒载体的生产更为方便，病毒复制和包装所必需的顺式作用元件和外源基因的表达盒除了可以用质粒携带以外，也可以用另一种病毒（往往是辅助病毒）或生产细胞来携带。
辅助元件包括病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件。
这些元件一般包括病毒基因转录调控基因、病毒DNA合成和包装所需的各种酶类的基因、病毒的外壳蛋白基因等。
辅助元件的表现形式可以多种多样。
常用的形式有：①辅助质粒（helper plasmid），如用于产生重组腺病毒的质粒JM17，用于重组AAV包装的辅助质粒pAAV/Ad（Rolling F and Samulski J1995）等；②辅助病毒（helper virus），如用于HSV扩增子载体包装的辅助病毒HSV1tsK株；③包装细胞系如用于反转录病毒载体包装的PA317细胞。
这些表现形式之间可以相互转化或合并。
例如，辅助病毒可以转化为辅助质粒：传统的AA V 载体生产系统常用腺病毒作为辅助病毒。
研究发现，并非腺病毒的所有基因对AAV病毒的产生都是必需的，只需要腺病毒E1a,E1b,E2a,E4和VA RNA5种基因就行了。
因此，将这5种基因置于同一个质粒中，构建成的这种新的辅助质粒就完全可以替代原来的辅助病毒（Xiao X et al.1998;Grimm D et al.1998），不但提高了包装效率，而且避免了产品中腺病毒污染的问题。
上述几种要素的不同组合，便产生了各种各样的病毒载体包装策略。
根据病毒载体生产系统的组成因素的多少，可将其分成以下几种：单组成因素生产系统（one-component system）：所有的组成成分都集中在生产细胞中。
经典的反转录病毒生产系统就是由产病毒细胞（VPC）组成，重组反转录病毒由VPC细胞不断分泌至培养上清中。
这种生产系统操作最为简单，但是往往产量不高或不稳定。
采用这种策略，需要将重组病毒产生所需要的所有元件都稳定地置于生产细胞中。
由于许多病毒基因产物本身对细胞有破坏作用或不能在细胞中稳定表达，因此这种策略在许多病毒载体的生产中难以实施。
双组成因素生产系统（two-component system）这种生产系统一般由"一株病毒/一株细胞"组成。
典型的例子是重组腺病毒生产系统。
先用共转染的方法获得重组腺病毒毒种，再由该毒种和生产细胞（如293细胞）组成一个双组成因素的生产系统使病毒大量扩增。
多组成因素生产系统（multi-component system）是由两种以上的组成因素组成的生产系统。
传统的AAV载体生产系统就是由载体质粒，辅助质粒，辅助病毒和生产细胞4种因素组成。