病毒载体概述ppt课件
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病毒包装与感染ppt课件
病毒包装与感染
基因载体系统
病毒载体系统
非病毒载体系统
DNA/RNA DNADNADNADNA
逆腺腺单慢
转病相纯病
录 病 毒 载
毒 载 体
关 病 毒 载
疱 疹 病 毒
毒 载 体
体
体载
体
裸
阳蛋 阳
离白 离
子质 脂复 质合 复物
子 多 聚 物
嵌 合 物
合
物
细胞内包装
细胞外包装
2
病毒载体系统
基本概念：即病毒载体介导基因技术，一种高效的基因转移工
➢ 将其包膜蛋白env基因换成鼠4070A病毒的双嗜性包膜蛋白，就产生
了能分泌双嗜性病毒的包装细胞。但这个细胞系所含的包装结构仅仅 缺失Ψ信号，只要它们与载体之间发生一次重组，就可以产生有复制 能力的野生型病毒，安全性很差。
➢ 第二代包装细胞
➢ 前病毒基因组除了包装信号缺失外，5’LTR的5’端顺序也缺失，病毒 剪接供体上游部位进一步缺失，3’LTR被SV40的转录终止多聚腺苷酸 信号取代。经过这样的改造，包装细胞与载体系列之间的共同顺序只 存在于紧接gag起始密码子上游53bp的区域。
1、体外细胞基因转导2、 全基因组插入失活突变筛 选3、功能基因库构建
腺病毒载体
➢ 无包膜的线状双链DNA病毒，宿主范围很广，适用于在分 裂或非分裂哺乳动物细胞中进行高效瞬时表达。
➢ 除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞，腺病毒系统可以在 任何哺乳动物细胞中高效瞬时表达，是可靠的基因递送平 台。它在感染宿主细胞时，病毒基因组及其携带的外源基 因独立于宿主基因组外游离表达，因此是无插入突变性， 安全性高。
➢ 第三代慢病毒载体系统由四质粒代 替原有的三质粒包装系统。
腺病毒载体构建精品PPT课件
无，病毒基因组游 有，病毒基因组整 有
离于宿主基因组之 合到宿主基因组，
外，瞬时表达外源 长时间、稳定表达
基因
外源基因
高水平表达
中
中
快（1-2天）
慢（2-4天）
快（1-2天）
分裂和不分裂细胞 1012
分裂和不分裂细胞，分裂cell，但在干 适用于难转染细胞 细胞中表达效率低
109
109
不可以
TET-ON,TET-OFF
1
腺病毒
• 腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分 离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微 米的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252 个。核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感 染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到 细胞核。
• 腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感 冒症状、呼吸系统不适等。
2
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它 通过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病 毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整 合进入宿主细胞基因组中.
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
5
腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
重组系统由2种质粒 构成：一、包含全 部（或右侧大部分） 腺病毒基因组DNA 的大质粒，即骨架 质粒
病毒载体-2014-10
Moloney murine leukaemia virus (Mo-MLV)
• amphotrophic virus • The essential regions include the 5' & 3' LTRs & the packaging sequence lying downstream of the 5' LTR. • Transgene expression can either be driven by the promoter/enhancer region in the 5' LTR, or by alternative viral (e.g. cytomegalovirus, Rous sarcoma virus) or cellular (e.g. beta actin, tyrosine) promoters
优点
• Broad range of infectivity and high titer • Infection does not require an actively dividing host cell • Expressed human proteins are properly folded and modified • Large insert size • AdEasy vector is non-insertional
• selectable markers, such as neomycin & beta galactosidase, can be included • The available carrying capacity for retroviral vectors is approximately 7.5 kb • Altering the env gene or its product has proved a successful means of manipulating the cell range
细胞生物学作业 腺病毒载体介绍
具有共同或重叠序列的两种ＤＮＡ分 子，通过共转染转移到某一生物体内， 在一系列与同源重组有关的酶的作用 下，将一个DNA分子转移到另一个DNA 分子中去
腺病毒载体优势
宿主范围广，对人致病性低
在增值和非增值细胞中感染和表达色体中，无插入致突变性 能在悬浮液中扩增 能同时表达多个基因
基因E1a： 对其他基因的转录有阻遏作用，复制所必需的基因
早期基因
基因E2： 晚期基因表达的反式因子和病毒复制必需的因子 其他
晚期基因：产生病毒的结构蛋白
腺病毒侵染人体过程
腺病毒纤毛结 节区粘附到细 胞表面的柯萨 奇/腺病毒受体
→
五邻体基底部 的三肽（RGD） 与细胞表面整 合素结合，通 过内吞作用进 入细胞
→
外包装壳蛋白解 体，病毒粒子穿 过细胞质靠近细 胞核
↓
病毒粒子经细 胞质通过核孔 将遗传物质转 入细胞核，
腺病毒载体构建方法
体外连接法 同源重组法 ：在真核细胞中进行同源重组
在原核细胞中进行同源重组
体外连接法：将外源目的基因亚克隆 到腺病毒基因组的一个片段上，在体 外与腺病毒的基因组相连，重新构成 一个完整的腺病毒ＤＮＡ，转染敏感 细胞。 不足：腺病毒基因组上适用于克隆酶 切位点有限，限制了该法的利用。
腺病毒载体
腺病毒简介 腺病毒载体构建方法 腺病毒载体优势 腺病毒载体应用前景
腺病毒简介
腺病毒是一种没有包膜的直径为 70～90 nm的颗粒，由240个六邻体 和12个五邻体，其中五邻体位于顶 角处，从每个顶角壳粒的基底伸出 一根纤毛突起，末端有一个结节区， 衣壳里是线状双链DNA分子
DNA分子特点： 其两端各有一个100一165 ntLTR序列
腺病毒载体应用前景
病毒的分子生物学幻灯片PPT
• 腺病毒分布十分广泛， 从各种胎生哺乳动物、 鸟类和两栖类动物中都已分离到。
• 腺病毒科分两个属： 1、哺乳动物腺病毒属 (Mastadenovirus) 2、禽腺病毒属(Ariadenovirus)。
• 腺病毒感染细胞后可关闭宿主细胞某些 基因的表达，大量合成病毒蛋白质，致 使细胞的功能失常。
病毒的分子生物学幻灯片PPT
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12.1 病毒分子生物学研究的内容
• 病毒分子生物学是用现代分子生物学的 新理论、新技术和新方法对病毒基因组 的结构与功能，基因组的复制、表达和 调控，病毒与宿主的相互作用关系等进 行研究的一门学科。
• 人类对病毒的研究成果在现代分子生物 学的发展史上，做出了重大的贡献。许 多分子生物学上的重大突破都是以病毒 作为模式或研究材料而进行的。
• 病毒进入活的易感宿主细胞后，借助于 宿主细胞本身提供的原料、能量、酶等， 以自我复制的方式进行繁殖。
• 病毒基因的表达包括转录和翻译两个过程。
• 正链RNA病毒的基因组除了作为模板复制出 子代RNA之外，还有mRNA的作用。作为翻 译的模板，一般先翻译出单一的大分子肽链， 然后再由蛋白酶降解为不同功能的结构蛋白 等。
12.2 DNA病毒的分子生物学
• DNA病毒基因组有单链和双链两种结构， 并以线状或环状形式存在，大部分为单 一分子，也有的由数个片段的DNA分子 构成分段的基因组。
• 动物DNA病毒多为双链DNA基因组，腺病毒、 痘病毒、疱疹病毒都是双链线状DNA基因组， 末端有重复序列，经退火能形成环形分子。
• 腺病毒(Aflenovirus)是一种典型的双链DNA病 毒，下面以腺病毒的基因表达调控为例，简 要介绍DNA病毒的分子生物学。
杆状病毒载体-演示文稿
另外，昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能，能表达基因 组DNA；还有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到 细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外 等。
最后，杆状病毒对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其 启动子在N-％动物细胞中没有活性，因此在表达癌基因或有潜 在毒性的蛋白时可能优于其它系统。
④能容纳大分子的插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包 装大的基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因 长度的上限。
⑤能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内 同时表达多个基因的能力。既可采用不同的重组病毒同时感染 细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因， 表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。
❖ 杆状病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同源重 组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。 由于多角体基因启动子在感染后18~24h开始转录和翻译， 一直持续到70 h。外源基因置换掉多角体基因后，并不影响 后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的 功能。
重组杆状病毒表达载体的结构
达产物，将其致敏原性降到最低限度是值得重视和探讨的问题。 (4)由于该系统独特的性质，使其被广泛地应用于基因工程、药 物开发、疫苗生产、表达免疫活性分子和某些致瘤病毒蛋白以及 基因表达调控研究等多个领域中。迄今为止，已有数百个基因在 昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达，为获得大量的类原型蛋白及 其功能研究提供了可能。
家蚕核型多角体病毒粒子模式图
❖ 杆状病毒粒子呈杆状， 大小为330×80nm。由 膜及核髓组成。膜为三 片层状，外层பைடு நூலகம்由蛋白 质白质及脂质组成的套 膜，现代病毒学称为囊 膜，内层是由蛋白质构 成的衣壳，中间为胶粘 层。衣壳内为髓核，是 呈螺旋型的双链脱氧核 糖核酸分子。衣壳和髓 核构成核衣壳。在一个 套膜中，包裹的核衣壳 数目因寄生的部位不同 而异。
最后，杆状病毒对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其 启动子在N-％动物细胞中没有活性，因此在表达癌基因或有潜 在毒性的蛋白时可能优于其它系统。
④能容纳大分子的插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包 装大的基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因 长度的上限。
⑤能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内 同时表达多个基因的能力。既可采用不同的重组病毒同时感染 细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因， 表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。
❖ 杆状病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同源重 组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。 由于多角体基因启动子在感染后18~24h开始转录和翻译， 一直持续到70 h。外源基因置换掉多角体基因后，并不影响 后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的 功能。
重组杆状病毒表达载体的结构
达产物，将其致敏原性降到最低限度是值得重视和探讨的问题。 (4)由于该系统独特的性质，使其被广泛地应用于基因工程、药 物开发、疫苗生产、表达免疫活性分子和某些致瘤病毒蛋白以及 基因表达调控研究等多个领域中。迄今为止，已有数百个基因在 昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达，为获得大量的类原型蛋白及 其功能研究提供了可能。
家蚕核型多角体病毒粒子模式图
❖ 杆状病毒粒子呈杆状， 大小为330×80nm。由 膜及核髓组成。膜为三 片层状，外层பைடு நூலகம்由蛋白 质白质及脂质组成的套 膜，现代病毒学称为囊 膜，内层是由蛋白质构 成的衣壳，中间为胶粘 层。衣壳内为髓核，是 呈螺旋型的双链脱氧核 糖核酸分子。衣壳和髓 核构成核衣壳。在一个 套膜中，包裹的核衣壳 数目因寄生的部位不同 而异。
病毒运用到实例ppt课件
3
疫苗的临床应用
病毒作为载体的疫苗已经在一些传染病预防和治 疗中得到应用，如埃博拉出血热、登革热等。
05
未来展望与挑战
未来病毒研究的展望
病毒基因编辑技术
随着CRISPR等基因编辑技术的发展，未来可能实现对病毒基因的 精确编辑，为抗病毒治疗和疫苗研发提供新途径。
病毒进化研究
深入探究病毒的进化历程和变异机制，有助于预测病毒的传播趋势 和制定有效的防控策略。
病毒的生命周期
总结词
病毒的生命周期包括吸附、侵入、复制、释放等阶段，对宿主细胞具有破坏作 用。
详细描述
病毒通过吸附和侵入宿主细胞，利用宿主细胞的资源进行复制和繁殖，最终释 放出新的病毒粒子。在这个过程中，宿主细胞会受到不同程度的破坏，严重时 可能导致细胞死亡或疾病发生。
02
病毒的传播方式与影响
病毒的传播方式
以防数据被病毒感染或损坏时 能及时恢复。
提高网络安全意识
不轻信陌生链接、邮件附件， 不随意下载不明来源的文件。
限制网络访问权限
对计算机的网络访问权限进行 合理配置，以减少病毒入侵的
风险。
检测和清除病毒的方法
定期全盘扫描
使用防病毒软件的全盘 扫描功能，检测和清除
病毒。
隔离受感染文件
对于疑似受感染的文件 ，可以使用防病毒软件 的隔离功能，防止病毒
加强疫苗和药物研发
加大投入力度，加速疫苗和抗病毒药物的研发进程，提高应对新 发、突发病毒威胁的能力。
THANKS
感谢观看
病毒与宿主相互作用机制
研究病毒与宿主细胞之间的相互作用机制，有助于发现新的药物靶 点，为抗病毒药物研发提供理论支持。
新兴技术对病毒研究的影响
病毒载体概述培训课件
嵌 合 型 病 毒 载 体 （ h y b r id v ir a l v e c to r ）： 指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺 病 毒 与 A AV 病 毒 的 杂 合 体 病 毒 ， 既 具 有 腺 病 毒 的 感 染 性 和 基 因 组 特 性 （ 双 链 线 状 D N A ）， 又 具 有 A A V 病 毒 的 染 色 体 整 合 性 （ L ie b e r A e t a l. 1 9 9 9 ）。 各 种 病 毒 基 因 元 件 组 合 形 成 新 的 杂 合 载 体 的 报 道 层 出 不 穷 ， 如 单 纯 疱 疹 病 毒 扩 增 子 与 A A V 病 毒 杂 合 载 体 （ J o h n s to n K M e t a l. 1 9 9 7 ）、 腺 病 毒 与 E B 病 毒 复 制 子 杂 合 载 体 （ T a n B T e t a l. 1 9 9 9 ） 腺 病 毒 与 反 转 录 病 毒 杂 合 载 体 （ C a p le n N J e t a l. 1 9 9 9 ） 等 ， 不 一 而 足 。 这 些 杂 合 载 体 使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。
神经系统疾病的基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。
病毒载体研究方向
1、病毒包装系统 2、无病毒基因的病毒载体 3、靶向性病毒载体 4、可调控表达的病毒载体 5、嵌合型病毒载体 6、自我扩增型病毒载体 7、条件增殖型病毒载体 8、新病毒载体
病毒载体包装系统
组成：1、宿主细胞
2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒）
生物学特性
适用范围
可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 表达时间较长； 有致癌的危险； 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 免疫原性强； 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、心肌、肝脏、视 网膜等组织中表达较高；
神经系统疾病的基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。
病毒载体研究方向
1、病毒包装系统 2、无病毒基因的病毒载体 3、靶向性病毒载体 4、可调控表达的病毒载体 5、嵌合型病毒载体 6、自我扩增型病毒载体 7、条件增殖型病毒载体 8、新病毒载体
病毒载体包装系统
组成：1、宿主细胞
2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒）
生物学特性
适用范围
可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 表达时间较长； 有致癌的危险； 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 免疫原性强； 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、心肌、肝脏、视 网膜等组织中表达较高；
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用途：基因转移和表达
1、基因治疗 2、疫苗 3、器官移植 4、组织工程 5、转基因动物 6、基因功能研究
病毒载体概述（2） 优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；
2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。
存在的问题：1、安全性
2、靶向性 3、有效性
细胞毒性 染色体毒性 免疫毒性 转导靶向性 转录靶向性 转导效率 靶向性 基因表达水平和持续时间 表达的可调控性
HRE
MDR1
tetOp
tTA
tetOp
gene
合成的转录因子
ESTRADIOL
GAL4
ER
RU486
VP16
RXR
EcR
VP16
muristerone VP16
GAL4
PR
ZFHD-1 FKB12
FRAP P65
Diphenol indene
rapamycin
GAL4
ER
p65
自 我 扩 增 型 载 体 （ s e l f - a m p l i f y i n g v e c t o r ）：
常用的病毒载体的特点：
病毒载体 反转录病毒载体 单 链 RNA 病 毒 8~10kb 腺病毒载体 双 链 DNA 病 毒 36kb 生物学特性 可 整 表 有 可 不 外 表 免 可 整 无 可 在 网 具 递 可 容 可 感染分裂细胞； 合到染色体中； 达时间较长； 致癌的危险； 感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 源基因表达水平高； 达时间较短； 疫原性强； 感染分裂和非分裂细胞； 合到染色体中； 致病性；免疫原性弱； 长期表达外源基因； 骨 骼 肌 、 心 肌 、 肝 脏 、 视 膜等组织中表达较高； 有 嗜 神 经 性 ； 可 逆 轴 突 传 ； 潜伏感染； 量大； 感染分裂和非分裂细胞； 适用范围 E x v iv o 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗。
LTR
gene
LTR
腺病毒载体：
ITR
gene pA
ITR
单纯疱疹病毒载体：
gene gene gene gene gene
pac
ori
无辅助病毒包装系统
Helper plasmid:
E2a E4orf6 VA
adenovirus
E1a,b
aav vector plasmid
ITR
293细胞
ITR
gene
图5 重组AAV无辅毒包装系统
ITR
gene
ITR
cre
293-cre
Adenovirus with packaging signal flanked by loxP 图6 mini-adnovirus无辅毒包装系统
靶向性病毒载体
转导靶向性
改造病毒外壳/外膜
连接靶向性结合分子
cell
Modified adenovirus
gag pol env
LTR
LTR
图1 反转录病毒包装系统示意图
双因素生产系统 (two-component system)
Ad Shuttle
E1a,b
E1a,b
293 cell
293 cell
JM17
图2 腺病毒包装系统示意图
多因素生产系统 (multi-component system)
转录靶向性（特异性）
组 织 特 异 性 启 动 子
肿 瘤 选 择 性 启 动 子
细 胞 周 期 调 控 启 动 子
肿 瘤 血 管 内 皮 导 向 启 动 子
双 特 异 性 启 动 子
病 毒 增 殖 的 特 异 性 转 录 调 控
可调控表达的病毒载体
细胞的调控元件 病毒的调控元件 人工合成的调控元件
H SV 病 毒 载 体 双 链 DNA 病 毒 152kb
病毒载体研究方向
1、病毒包装系统
2、无病毒基因的病毒载体
3、靶向性病毒载体 4、可调控表达的病毒载体 5、嵌合型病毒载体 6、自我扩增型病毒载体
7、条件增殖型病毒载体
8、新病毒载体
病毒载体包装系统 组成：1、宿主细胞
2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒） 3、被包装的DNA/RNA 包含顺式作用元件 单因素生产系统（one-component system)
Helper virus
rep cap Helper plasmid
host cell
Vector plasmid
图3 腺病毒伴随病毒包装系统示意图
多因素系统
双因素系统
Helper virus +helper plasmid
Host cell +vector DNA
rep cap
Recombinant helper virus (rHSV-repcap)
这 类 载 体 是 以 正 链 R N A 病 毒 S in d b is 病 毒 和 S e m lik i F o r e s t 病 毒 为 基 础 的 。 用 目 的 基 因 代 替 病 毒 的 外 壳 蛋 白 编 码 序 列 ， 导 入 靶 细 胞 中 ， 病 毒 的 复 制 蛋 白 大 量 复 制 重 组 的 基 因 组 ， m R N A 水 平 的 大 量 增 加 导 致 高 水 平 的 转 导 基 因 表 达 。 自 我 扩 增 型 载 体 的 表 现 形 式 可 以 是 R N A ， D N A 和 重 组 病 毒 。
细胞特异性转录 细胞启动子 病毒启动子
albumin Tyrosinase or TRP-1 PSA MVM P4 B19 promoter HBV
四环素调控
P1
tTA
tetOp
gene
MBP
MCK GFAP NSE KDR/flt-1 AFP CEA erbB2
JCV
EBV
P1
tTA
tetOp
gene
proviral cell
图4 双因素系统生产重组AAV病毒示意图
无病毒基因的病毒载体
被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和 包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病 毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒
ITR
反转录病毒载体：
I n v iv o 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗； 疫苗。
A AV 病 毒 载 体 单 链 DNA 病 毒 ~5kb
I n v iv o 基 因 治 疗； E x v iv o 基 因 治 疗 ； 遗传病基因治疗； 获 得 性 慢 性 疾 病 的 基因治疗。 神 经 系 统 疾 病 的 基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。
病毒载体概述
病毒载体概述（1） 要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒
2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病
容量：自身基因组大小的105%~110%
类型：1、重组型病毒载体
可复制型 复制缺陷型
2、无病毒基因的病毒载体
复制缺陷型
组成：1、病毒复制和包装元件
2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜