病毒载体概述

存在的问题：1、安全性
2、靶向性 3、有效性
细胞毒性 染色体毒性 免疫毒性 转导靶向性 转录靶向性 转导效率 靶向性 基因表达水平和持续时间 表达的可调控性
常用的病毒载体的特点：
病毒载体 反转录病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb 腺病毒载体 双链 DNA 病毒 3 6k b 生物学特性 可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 表达时间较长； 有致癌的危险； 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 免疫原性强； A AV 病 毒 载 体 单链 DNA 病毒 ~5kb 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、心肌、肝脏、视 网膜等组织中表达较高； H SV 病 毒 载 体 双链 DNA 病毒 1 5 2k b 具有嗜神经性；可逆轴突传 递； 可潜伏感染； 容量大； 可感染分裂和非分裂细胞； In 疗； E x v iv o 基 因 治 疗 ； 遗传病基因治疗； 获得性慢性疾病的 基因治疗。 神经系统疾病的基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。 v iv o 基 因 治 In v iv o 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗； 疫苗。 适用范围 E x v iv o 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗。
条 件 增 殖 型 病 毒 载 体 （ co n d itio n a lly rep lica tin g v ecto r ） ：
指可在某种特性的组织中产毒性复制，而在其它组织中不增殖的 病毒载体。这类病毒载体主要用于特异性裂解肿瘤细胞。如天然的腺 病 毒 突 变 株 O n yx -0 1 5 是 5 5 K d a l E 1 B 基 因 功 能 缺 失 的 腺 病 毒 突 变 株 ， 可 以 选 择 性 地 在 p53 基 因 突 变 的 肿 瘤 细 胞 中 增 殖 ， 而 在 正 常 组 织 细 胞 中 不 增 殖 。 用 这 种 突 变 株 联 合 化 疗 治 疗 恶 性 肿 瘤 II 期 临 床 结 果 令 人 鼓 舞 （ K irn D et a l. 1 9 9 8 ） 已 进 入 III 期 临 床 试 验 ， 从 此 ， 许 多 人 工 改 ， 造的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研究中。
LTR
gene
LTR
腺病毒载体：
ITR ITR
gene pA
单纯疱疹病毒载体：
gene gene gene gene gene
pac
ori
无辅助病毒包装系统
Helper plasmid:
E2a E4orf6 VA
adenovirus
E1a,b
aav vector plasmid
ITR ITR
293细胞
病毒载体研究进展
吴小兵 （‘863’计划生物领域病毒基因载体研发基地）
基因载体系统
病毒载体系统
非病毒载体系统
反 转 录 病 毒 载 体
腺 病 毒 载 体
腺 伴 随 病 毒 载 体
单 纯 疱 疹 病 毒 载 体
慢 病 毒 载 体
裸
DNA阳 离 子 脂 质 复 合 物
DNA-
DNA-
DNA/RNA
DNA
组成：1、病毒复制和包装元件
2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜
用途：基因转移和表达
1、基因治疗 2、疫苗 3、器官移植 4、组织工程 5、转基因动物 6、基因功能研究
病毒载体概述（2） 优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；
2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。
这 类 载 体 是 以 正 链 R N A 病 毒 S in d b is 病 毒 和 S em lik i F o res t 病 毒 为 基 础 的 。用 目 的 基 因 代 替 病 毒 的 外 壳 蛋 白 编 码 序 列 ，导 入 靶 细 胞 中 ， 病 毒 的 复 制 蛋 白 大 量 复 制 重 组 的 基 因 组 ， mRNA 水 平 的 大 量 增 加 导 致高水平的转导基因表达。自我扩增型载体的表现形式可以是 RNA， DNA 和 重 组 病 毒 。
2、基因表达系统 3、治疗基因
基因治疗产品的知识产权构成
1、治疗基因 2、调控元件 3、改造的外壳/外膜 4、靶向分子 5、包装系统 6、生产和纯化技术 7、制剂和保存技术
产业化的组织和实施：
1、合作开发 2、专业分工 3、政府支持和企业投资 4、利益分配
知识产权和基础研究
基因治疗领域的知识产权主要通过专利系统来保护
对于基因治疗公司最重要的专利是：
1、载体系统； 2、生产过程；3、整体治疗方案 治疗基因和表达系统可以从其它方购买使用权。
专利对学术研究的影响
1、无影响（对非常早期研究） 2、有影响（对临床试验和可能的商业开发）
政府支持对基因治疗产业化的重要作用
1、政策上促进基因治疗的科研、临床和商业开发
2、资助基因治疗核心技术研究和开发
gag pol env
LTR
LTR
图1 反转录病毒包装系统示意图
双因素生产系统 (two-component system)
Ad Shuttle
E1a,b
E1a,b
293 cell
293 cell
JM17
图2 腺病毒包装系统示意图
多因素生产系统 (multi-component system)
细胞特异性转录 细胞启动子 病毒启动子
albumin Tyrosinase or TRP-1 PSA MVM P4 B19 promoter HBV
四环素调控
P1
tTA
tetOp
gene
MBP
MCK GFAP NSE KDR/flt-1 AFP CEA erbB2
JCV
EBV
P1
tTA
tetOp
gene
gene
图5 重组AAV无辅毒包装系统
ITR
gene
ITR
cre
293-cre
Adenovirus with packaging signal flanked by loxP 图6 mini-adnovirus无辅毒包装系统
靶向性病毒载体
转导靶向性
改造病毒外壳/外膜
连接靶向性结合分子
cell
Modified adenovirus
Helper virus
rep cap Helper plasmid
host cell
Vector plasmid
图3 腺病毒伴随病毒包装系统示意图
多因素系统
双因素系统
Helper virus +helper plasmid
Host cell +vector DNA
rep cap
Recombinant helper virus (rHSV-repcap)
proviral cell
图4 双因素系统生产重组AAV病毒示意图
无病毒基因的病毒载体
被包装的DNA/RNA中不含任何病毒编码基因，只保留其复制和 包装所必需的顺式作用元件。获得的重组病毒颗粒具有野生型病 毒的外壳/外膜和感染性，但不表达病毒蛋白。
腺伴随病毒载体：
ITR ITR
gene pA
反转录病毒载体：
3、资助建立能规模化生产临床级基因载体的中心或基地 4、支持从事基因治疗的公司发展新技术、新产品 5、促进新的基因治疗公司建立。 6、制定规范、高效且符合国情的审批程序。
重组病毒的生产和纯化
小量制备和纯化
场所
大量制备和纯化
中试车间
实验室
细胞培养
培养瓶 反复冻融 离心 密度梯度超速离心 缓冲液 低温
转瓶、细胞工厂、发酵罐 机械法或化学法裂解 离心、超滤、萃取 浓缩、柱层析 配方
细胞裂解
病毒分离
病毒纯化
制剂
保存
病毒载体与基因治疗产业化
基因治疗的三个核心部分
1、基因载体系统
HRE
MDR1
tetOp
tTA
tetOp
gene
合成的转录因子
ESTRADIOL
GAL4
ER
RU486
VP16
RXR
EcR
VP16
muristerone VP16
GAL4
PR
Hale Waihona Puke Baidu
ZFHD-1 FKB12
p65
FRAP P65
Diphenol indene
rapamycin
GAL4
ER
自 我 扩 增 型 载 体 （ self-a m p lify in g v ecto r ） ：
蛋 白 质 复 合 物
阳 离 子 多 聚 物
嵌 合 物
细胞内包装
细胞外包装
病毒载体概述（1） 要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒
2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病
容量：自身基因组大小的105%~110%
类型：1、重组型病毒载体
可复制型 复制缺陷型
2、无病毒基因的病毒载体
复制缺陷型
病毒载体研究方向
1、病毒包装系统
2、无病毒基因的病毒载体
3、靶向性病毒载体 4、可调控表达的病毒载体 5、嵌合型病毒载体 6、自我扩增型病毒载体
7、条件增殖型病毒载体
8、新病毒载体
病毒载体包装系统 组成：1、宿主细胞
2、辅助元件（辅助质粒、辅助病毒） 3、被包装的DNA/RNA 包含顺式作用元件 单因素生产系统（one-component system)
嵌 合 型 病 毒 载 体 （ h y b rid v ira l v ecto r ） ：
指将不同病毒的基因元件进行组合，形成的重组杂合病毒。如腺 病 毒 与 A AV 病 毒 的 杂 合 体 病 毒 ， 既 具 有 腺 病 毒 的 感 染 性 和 基 因 组 特 性 （ 双 链 线 状 D N A ） 又 具 有 A AV 病 毒 的 染 色 体 整 合 性 （ L ieb er A et a l. ， 1999） 各 种 病 毒 基 因 元 件 组 合 形 成 新 的 杂 合 载 体 的 报 道 层 出 不 穷 ， 如 。 单 纯 疱 疹 病 毒 扩 增 子 与 A AV 病 毒 杂 合 载 体 （ J oh n ston K M e t a l. 1 9 9 7 ） 、 腺 病 毒 与 E B 病 毒 复 制 子 杂 合 载 体 （ Ta n B T et a l. 1 9 9 9 ） 腺 病 毒 与 反 转 录 病 毒 杂 合 载 体 （ C a p len N J et a l. 1 9 9 9 ） 等 ， 不 一 而 足 。 这 些 杂 合 载 体 使重组病毒的特性多样化，以适应不同基因转移目的的需要。
转录靶向性（特异性）
组 织 特 异 性 启 动 子
肿 瘤 选 择 性 启 动 子
细 胞 周 期 调 控 启 动 子
肿 瘤 血 管 内 皮 导 向 启 动 子
双 特 异 性 启 动 子
病 毒 增 殖 的 特 异 性 转 录 调 控
可调控表达的病毒载体
细胞的调控元件 病毒的调控元件 人工合成的调控元件