生物采油解堵剂中产蛋白酶菌株的筛选及培养条件优化

作者简介 ： 左佳敏（ ９ ３ ， ， １ ８ 一） 女 硕士研究生 ， 主要从 事天然 产物 资源化学方面 的研究
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９ ・ ６
第 ２ 期
左佳 敏 等 ： 物 采 油解 堵 剂 中 产 蛋 白 酶 菌株 的 筛选 及 培养 条 件 优 化 生
１ １ ２ 培养 基 ．＿
无 机 营养 液 （ ／ ） Ｎａ １ ． ； ｇ Ｌ ： Ｃ ０ ＮＨ４ １ ． ； Ｓ ． ２ Ｋ２ Ｏ ・Ｈ２ ． ； ＮＯ ． ； ３ Ｃ １ Ｍｇ Ｏ４ ０ ； ＨＰ ４ ３ Ｏ ０ ２ Ｎａ ３０ ２ ＫＨ２ Ｏ ０ ０ Ｐ ４
１ 材 料 与方 法
１ １ 材 料 ．
１ １ １ 菌株 ． ．
从 大 庆油 田原 油样 品 中筛选 得到 菌种 ， 经部 分生 理 生化实 验及 １ Ｓｒ ６ ＤＮＡ鉴 定 为铜绿 假单 胞菌 ．
收 稿 日期 ：０ ２—０ ２１ ２—２ ； ８ 编辑 ： 志平 任 基 金 项 目 ： 宁 省 工 业 攻 关 计划 项 目（０ ９２ ０ ３ 辽 ２０ ２ ３０ ）
酪素 培养 基［ （ ／ ： ｇ Ｌ） ＫＨ２ Ｏ４ ． ６ Ｍｇ Ｏ ． ； ｎ １ ０ ０ ４ Ｎ Ｃ ． ６ ＮａＨＰ ４ ７ Ｏ １ Ｏ ； Ｐ ３ ； Ｓ ４０ ５ Ｚ Ｃ ２ ． １ ； ａ １ １ ； ２ Ｏ ・ Ｈ２ ． ７ ０ ０ Ｃ Ｃ ２ ． ０ ； ｅ Ｏ ． ２ 干酪 素 ４ 琼 脂 ２ ． ； 离子 水 １０ ０ｍＬ ｐ ６ ５ ． ． ａ １００ ２ Ｆ Ｓ ４ ０ ； ０ ； ０ ０去 ０ ； Ｈ ． ～７ ０ 以上 培养 基使 用前 在 １ １℃ 、 ． ａ ２ ０ １ＭＰ 条件 下 灭菌 ３ ｉ． ０ｒ ｎ ａ
大
庆
石
油
学
院
学
报
第３ ６卷
Ｖｏ１ ３６ ．
第２ 期
Ｎｏ ２ ．
２１ ０ ２年 ４月
Ａ ｐ ． ２０ ｔ １２
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＤＡＱＩ ＮＧ ＰＥＴＲＯＬＥＵＭ ＮＳＴＩ Ｉ ＴＵＴＥ
生物 采 油 解 堵 剂 中产 蛋 白酶 菌株 的 筛 选 及 培 养 条 件 优 化
力” 使 原 油分 子发 生变形 和 活化 ， ， 形成 “ 酶一 原油 的契 合 物” 反应 后 释放 出原 油． 离释 放 的油滴 快 速 聚 ， 分
合 ， 成稀 释 油 流 ， 形 改善 原 油 的流 动性 ， 通被 堵 塞 的 油 、 通 道 ， 而实 现 油井及 管 道 的疏 通 解堵 ＿ ． 疏 水 从 】 国 引 外关 于蛋 白酶用 于 油井解 堵方 面 的报 道很 少 ． 海 防等 及李 道 山等 对 生 物 酶 驱油 解 堵 （ 盖 主要 成 分 是 蛋 白 酶） 行 研究 ， 明蛋 白酶在 生物 酶解 堵 中具有 一 定作 用口 ¨ ． 者从 耐受 石 油的 微生 物 中筛 选产 蛋 白酶 进 表 ］笔 菌株 ， 并对 其培 养基 及培 养条 件进行 优 化 ， 到 降解 降黏 原油 及 大 幅度 降低 表 面 张力 的效 果． 达 该研 究 在 降 解 降 黏原 油 ， 加原 油流 动性 ， 高原 油采 收率 等方 面有着 广 阔的发 展前 景． 增 提
℃和 ｐ ７ ０条件 下 ， ｒｉ Ｈ ． １ａ ｎ内水 解 酪蛋 白产 生 １ ｇ酪氨 酸为 １ 酶活 力单 位 （ ， Ｅ＝ｖ 个 ｕ） 即 ＝ ＮＡ／ ， 中 Ｅ ＝ ｔ其
为蛋 白酶 酶 活 ， 酶反 应液 总体 积 ， ４ｍＬ； 为酶 液稀 释倍 数 ； 为标 准 曲线对 应 的酪 氨 酸质 量浓 度 ； 为 取 Ｎ Ａ
关 键 词 ： 物 采 油 ； 白酶 ；菌 株 筛选 ； 养 条 件 ； 化 生 蛋 培 优 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ０ ８ １ ２ １ ） ２— ０ ６ ７ １ ０ —１ ９ （０ ２ ０ ０ ９ —０
中图 分 类 号 ： ３ ７ ９ ＴＥ ５ ．
０ 引 言
斜 面和 平板 培养 基 （ ／ ： Ｃ ． ； ｇ Ｌ） Ｎａ １ ０ ＮＨ４ １ ． ； ＮＯ ． ； ３ Ｃ １ Ｎａ ３０ ２ ＫＨ２ Ｏ ． ； ＨＰ ・ Ｈ２ ． ； ０ Ｐ ４０ １ Ｋ２ Ｏ４ ３ Ｏ ０ ２ Ｍｇ Ｏ ． ２ 原油 ３ ０ 蛋 白胨 ５ ０ 琼 脂 ２ ． ； Ｓ ０ ０ ； ．； ．； ０ ０ 去离 子水 １０ ０ｍＬ； Ｈ ７ ０ ０ ｐ ． ．
０ １ 蒸馏 水 １０ ０ｍＬ； Ｈ ７ ０ ．； ０ ｐ ． ． 原油 培养 基 （ 以原 油为 唯一 碳 源） ｇ Ｌ ： Ｃ ． ； １ ． ； ＮＯ ． ； （ ／ ） Ｎａ １ ０ ＮＨ Ｃ １ Ｎａ ３ ２ ＫＨ２ Ｏ ． ； Ｏ ・ ３ ０ ０ Ｐ ０ １ Ｋ２ ＨＰ ４ ３ ０ ０ ２ Ｍｇ Ｏ ． ２ 原油 ３ ０ 去 离 子水 １０ ０ｍＬ； Ｈ ７ ０ Ｈ２ ． ； Ｓ ４ ０ ； ０ ．； ０ ｐ ． ．
膏 为 ２ ／ Ｎａ １ １０ｇ Ｌ， ａ ２ ０ ０ ／ ＮａＨＰ ０ｇ Ｌ， Ｃ 为 ． ／ Ｃ Ｃ１为 ． ２ｇ Ｌ， ２ Ｏ４为 ０ ２ｇ Ｌ， Ｈ２ Ｏ４为 ０ １ｇ Ｌ； 初 始 ｐ 为 ６０ 接 种 ． ／ Ｎａ Ｐ ． ／ 在 Ｈ ．、
量为 ５ （ 积分数）温度为 ３ 体 、 ｌ℃ 、 床 转 速 为 １ ０ｒｍｉ 摇 ６ ／ ｎ的条 件 下 ， 养 ７ 培 ２ｈ后 ， 株 的 蛋 白 酶 酶 活 为 ５ １ ０Ｕ／ 菌 ５ ． ｍＬ， 为 复 筛 选 菌 株 的 蛋 白酶 酶 活 的 ２ ． ２ ， ２ ９ 倍 即为 菌 株 生 长 繁 殖 及 代 谢 的 最 佳 条 件 ， 够 获 得 更 高 的 蛋 白酶 酶 活 ， 利 于 后 续 能 有
种 子 培 养 基 （ ／ ） 葡 萄 糖 ２ ． ； 白 胨 ２ ０ Ｎａ １ ． ； ＨＰ ３ Ｏ ２ ０ ＮＨ １ ． ； Ｓ ４ ｇＬ ： ０ ０蛋 ． ； Ｃ ０ Ｋ２ Ｏ ・ Ｈ２ ． ； ２ Ｃ ５ Ｍｇ Ｏ ０ ｏ ０ ； 离子 水 １０ ０ｍＬ； Ｈ ７ ０ ． ２去 ０ ｐ ． ． 基础 发 酵培养 基 （ ／ ） 原 油 １ ； 白胨 ５ ０ Ｎａ １ ． ； ＨＰ ・Ｈ２ ． ； Ｓ ． ２ ＫＨ２ Ｏ ｇＬ ： ０蛋 ． ； Ｃ ０ Ｋ２ Ｏ ３ Ｏ ０ ２ Ｍｇ Ｏ４ ０ ； ３ ０ Ｐ ４ ０ １ 去 离子水 １０ ０ｍＬ； Ｈ ． ［］ ．； ０ Ｐ ７ ０“ ．
１ ２ １ ４ 斜 面保存 ．． ．
．
选 择 酪素平 板 中分 离得 到透 明 圈直径 与菌 落直 径 比值较 大 的单 菌落转 接斜 面 ， ３ 于 ７℃恒 温箱 内恒 温 培 养 ２ ， 斜 面保存 于冰 箱 中备用 ． ４ｈ 将
１ ２ １ ５ 种子 液制 备 ．． ．
取 两环 活化 的菌 种 ， 人 盛有 １ ０ｍＬ种 子培 养基 的三角 瓶 中 ，７℃、 ６ ／ ｎ摇 床 培养 １ ． 接 ０ ３ １ ０ｒｍｉ ６ｈ
人们 广泛 兴趣［ １ ． ８ ０ －］
生物 酶主要 含 有蛋 白酶 、 纤维 素酶 、 半纤 维 素酶 以及表 面活 性剂 类物 质 等 ， 中蛋 白酶在 生物 酶 采 其 油解堵 中起 着一 定 的作用 ． 当原油靠 近 蛋 白酶等 生 物 酶 活性 中 心 时 ， 白 酶发 生 构 象 变化 ， 蛋 产生 “ 电子 张
１ ２ １ ６ 发酵 培养 ． ．．
分 别 取 ３ｍＬ种 子 液 ， 人 盛 有 １ ０ｍＬ发 酵 培 养 基 的 三 角 瓶 中 ，７ ℃ 、６ ／ ｎ摇 床 培 养 ７ ． 接 ０ ３ １ ０ｒｍｉ ２ｈ
１ ２ ２ 测定 方法 ．．
参照 文献 ［ ０ 的方法测 定 蛋 白酶 活力． ２］ 发酵 液离 心上 清液 作为 粗 酶液 ． 白酶活 力 单位 定义 为 ： ４ 蛋 在 ０
水 解 酪 素 的透 明 圈 实 验 及 福 林 酚 测 蛋 白 酶 酶 活 的方 法 进 行 菌 株 的 初 、 筛 选 ； 复 以蛋 白 酶 酶 活 为 优 化 指 标 ， 用 单 因 素 实 采 验 对 筛 选 的 产 蛋 白酶 菌 株 的 培养 基 及 培 养 条 件 进 行 优 化 ， 化 最 适 培 养 基 ： 溶性 淀 粉 为 １ ／ 蛋 白胨 为 ２ ／ 酵 母 优 可 ５ｇ Ｌ， ０ｇ Ｌ，
生物 酶采 油是 近年来 发 展起来 的具 有较 好油 田开 发 效果 和较 高采 收率 的一 项新 技 术 ． 生物 酶 应 用 将 于油 井驱 油采 油 ， 以改变 岩石润 湿性 、 可 降低 油水 界 面 张力 、 降低 原 油 黏度 等［ 具 有增 产 、 注 、 水 、 ， 增 控 堵 水、 剖、 调 防砂 等效 果 ＿ ， 物 酶 解 堵 剂 作 为 采 油 解 堵 新 技 术 受 到 国 内 外 关 注． 国 Ａｐ ｌ ｅ ａａｉｎ ２生 ］ 美 ｏｌ Ｓ ｐ ｒｔ ｏ ｏ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｎ 研 发 的新 型 、 ｅｈ ｏｏ ｙＩｃ 高效 生物 酶稠 油解 堵剂 Ａｐ ｌ ｏｌ 保酶 ， ｏ环 在美 国、 墨西 哥 、 内瑞 拉 、 尼等 国 委 印 以及 我 国中原桥 口油 田 、 百色 油 田等 油井 上 的应 用取 得 较好 的效 果［ ４． 国东 营盛 世 公 司 开 发 的 Ｓ ３ ］中 － ＵＮ 生物 酶 ， 在胜利 油 田 、 律宾 卡尔塔 油 田应用 效果 也很 明显 ［ ７ 围绕高 效 、 保生 物酶 解 堵 剂 的研究 引起 菲 ５］ －． 环
３ ． 次
１ ２ １ ２ 菌种 分离 纯化 ．． ．
将 富 集培 养好 的菌 液划 平板 ， 置于 ３ 倒 ７℃恒温 箱 内恒温 培养 ７ ． 复 ３次 ． ２ｈ 重 １ ２ １ ３ 菌种 初筛 选 ．． ． 挑 取 平板 上 的单 菌 落进 行 梯 度稀 释 ， 后 将 每个 稀 释度 的菌 液涂 布 于酪 素 培养 基 平板 中， 置于 ３ 然 倒 ７ 。 温箱 内恒 温培 养 ， 察透 明圈与菌 株 直径 大小 ， Ｃ恒 观 进行 初筛