【米氏常数】 米氏常数测定实验报告.docx
米氏常数测定(精)
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
COOCH2 NH(CH2OH)2
试剂器材
试剂
1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。 2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制） 3. 0.25%酚酞乙醇溶液： 4. 标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液（已配好）
液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与 Km值。
注意事项
（1 ）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种， 如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速 逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研 究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精 氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解， 产生自由氨基端。
氨基的测定
甲醛滴定法
COOCH2 NH2
HCHO
实验十六
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求
（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。
（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验原理
Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时 所对应的底物浓度。
Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
米氏常数实验报告
米氏常数实验报告米氏常数实验报告引言：米氏常数是物理学中的一个重要常数，它描述了光在真空中的传播速度。
在本次实验中，我们将通过测量光的传播时间和光程差来确定米氏常数的数值。
通过这个实验，我们将更深入地了解光的性质和光在空间中的传播规律。
实验目的：本实验的目的是通过测量光的传播时间和光程差来确定米氏常数的数值，并验证光在真空中的传播速度是否恒定。
实验器材：本实验所需的器材包括：激光器、分光镜、反射镜、光电探测器、计时器等。
实验步骤：1. 首先，我们将激光器置于实验室的一端，并将其打开。
确保激光器产生的光束是稳定的。
2. 接下来，我们将分光镜放置在激光器的光路中，并调整其角度，使得光束被分光镜分为两束相等的光束。
3. 将两束光束分别引导至反射镜，并使其分别反射回来。
4. 在光束返回的路径上，我们将安装光电探测器，并将其与计时器相连。
5. 开始实验时，我们同时启动激光器和计时器，并记录下光束从激光器发出到光电探测器接收到的时间。
6. 重复实验多次，取平均值作为最终的测量结果。
实验结果：通过多次实验测量，我们得到了光的传播时间和光程差的数据。
根据这些数据，我们可以计算出米氏常数的数值。
讨论与分析：在本次实验中，我们得到了光的传播时间和光程差的数据，进而计算出了米氏常数的数值。
通过比较实验结果与已知的米氏常数数值，我们可以验证光在真空中的传播速度是否恒定。
此外，本实验还可以用于研究光在不同介质中的传播速度。
通过将光束传播到不同介质中，我们可以测量光的传播时间和光程差，并计算出不同介质中的米氏常数。
这有助于我们更深入地了解光在不同介质中的传播规律。
结论：通过本次实验，我们成功地测量了光的传播时间和光程差，并计算出了米氏常数的数值。
实验结果与已知的米氏常数数值相符，验证了光在真空中的传播速度是恒定的。
此外，本实验还为研究光在不同介质中的传播速度提供了一种方法。
总结：米氏常数实验是一项重要的实验，通过测量光的传播时间和光程差，我们可以确定光在真空中的传播速度。
米氏常数的测定
一、目的要求
1.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 Vm值。
二、原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
Vm [ S ] v K m [S ]
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数
0
0 0.8
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0.30
0.6 0.2
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1 表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。
（不做） 取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
3 0.3 0.5 4 0.4 0.4 5 0.5 0.3 6
pNP含量 (mol)
0.5mol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.1 mol/L NaOH (mL) OD 405 nm
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
米氏常数的测定
底物浓度对酶促反应速度的影响——米氏常数的测定一．目的要求1.1了解底物浓度对酶促反应的影响。
1.2掌握测定米氏常数K m 的原理和方法。
二．实验原理酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：式中：v ——反应初速度（微摩尔浓度变化/min ）；V ——最大反应速度（微摩尔浓度变化/min ）； [s]——底物浓度（mol/L ）； K m ——米氏常数（mol/L ）。
这个方程表明当已知K m 及V 时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。
K m 值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。
不同的酶，K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似地反应酶与底物的亲和力大小：K m 值越大，表明亲和力小；K m 值小，表明亲和力大。
则测K m 值是酶学研究的一个重要方法。
大多数纯酶的K m 值在0.01～100mmol/L 。
Linewaeaver-Burk 作图法（双倒数作图法）是用实验方法测K m 值的最常用的简便方法：实验时可选择不同的[s]，测定对应的v ，以 对 作图，得到一个斜率为V Km的直线，其截距][1s 则为mK 1，由此可求出K m 的值（截距的负倒数）。
本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Linewaeaver-Burk 双倒数作图法测定双倒数作图法。
胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。
水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。
][][s K s V v m +=V s V K v m 1][1.1+=v 1][1s三．试剂和器材3.1 试剂A.10～30g/L的酪蛋白溶液（pH8.5）：分别取10、20、25、30g酪蛋白溶于约900mL水中，加20mL 1mol/L NaOH 连续振荡，微热直至溶解，以1mol/L HCl 或1mol/L NaOH调pH至8.5，定容1L，即生成四种不同[s]的酪蛋白标准溶液。
米氏常数测定方法
酶活米氏常数实验一、实验前准备1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。
2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL 或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。
TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200µL和10µL移液枪、50µL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL 左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。
4、记录本上提前写好实验的加样顺序：催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液②10µL催化剂③底物TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10µL) ④32µLH2O2（排枪加）催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液②10µL催化剂③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64µL）④10µL底物TMB（ABTS）（排枪加）数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。
Code 1 2 3 4 5 6 7TimeTMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10V01Code 1 2 3 4 5 6 7TimeH2O2 2 4 6 8 10 16 32 64V01二、实验1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个0，按Enter键进入系统。
2012_完成(米氏常数)
---- Km值的测定
【实验目的】
了解底物浓度与酶反应速度间的关系
了解酶的Km值测定原理和方法
学习求蔗糖酶米氏常数的方法
酶反应速度与底物浓度的关系曲线
米氏方程:
Vmax S v K m S
当V=Vmax/2时，则Km=[s]
米氏常数的测定—
双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）
各管混匀，沸水浴5min，取出后立即用冷水冷却至室温，以蒸
馏水定容至25ml，摇匀。测540nm处A值。以葡萄糖含量（mg） 为横坐标，A值为纵坐标作出标准曲线。
2．不同底物浓度时反应速度υ的测定
反应物
管 蔗糖 号 (ml) 醋酸缓 冲液 (ml) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5
1.25
将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再 用作图法求出Km。 1 Km 1 1 — = —— . — + —— v Vmax [S] Vmax
还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：
【仪器与试剂】
•仪器：
分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表、 坐标纸
•试剂：
标准葡萄糖溶液（1 mg/ml）、
0.01 mol／L 蔗糖溶液、 0.2 mol／L NaAc缓冲溶液(pH4.6)、 1mol／L NaOH溶液， 3，5一二硝基水杨酸试剂。
【操作步骤】
1．葡萄糖标准曲线的制定
管号 葡萄糖标准液/ml 蒸馏水/ml 3,5—二硝基水杨酸/ml 0 0 2.0 3.0 1 0.2 1.8 3.0 2 0.4 1.6 3.0 3 0.6 1.4 3.0 4 0.8 1.2 3.0 5 1.0 1.0 3.0
【米氏常数】 米氏常数测定实验的报告.docx
【米氏常数】米氏常数测定实验的报告.docx米氏常数是一个经验参数，它是用于测量基质和溶质之间相互作用的重要参数。
米氏常数的测定涉及到溶质和基质的相互作用，主要是通过溶解度进行测定。
下面就是本实验的报告。
实验背景米氏常数是用来描述溶质在溶液中浓度度量的非线性关系的参数。
米氏方程如下：Ksp = [A+]^m [B-]^n其中Ksp是溶解度积常数，[A+]和[B-]分别表示电离度为1的正离子和负离子的浓度，m和n分别为正离子和负离子在配位物中的摩尔数。
溶解度积（或离解平衡常数）是可以直接从溶解度数据中获得的参数，这些参数是根据溶解度测量推导出来的，通常采用天平法或者滴定法进行测量。
实验目的本实验的目的是测定铅酸盐的米氏常数，用溶解度法测定铅酸盐的溶度积常数，并根据米氏方程计算米氏常数。
实验原理铅酸盐在水溶液中的离解方程式：PbSO4(s) ⇆ Pb2+(aq) + SO42-(aq)溶解度积常数是根据溶解度求出的：对于低溶度度超取6.5，我们软件系统一压根对孔直接忽略其离子反应方程中的y。
实验流程1. 准备1 L的稀铅酸溶液（2 × 10-5 mol/L）2. 取0.2 mL的稀铅酸热解，目测重量大概是0.03 g左右。
3. 将稀铅酸加入100 mL的无铅纯水溶液中，然后调整pH值，使稀铅酸与水达到最大的平衡浓度。
4. 记录溶解度数值，并计算铅酸盐的溶解度积常数。
实验结果1. 初始重量为0.03 g的铅酸盐溶解后，其溶解度为5.5 × 10-5 mol/L。
2. 根据铅酸盐的溶解度计算溶解度积常数Ksp为3.025 × 10-9。
3. 根据米氏方程Ksp = [Pb2+][SO42-]，计算出米氏常数为1.79。
米氏常数测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握米氏常数（Km）及其与最大反应速度（Vmax）的关系。
2. 通过实验测定酶的米氏常数，了解酶与底物之间的亲和力。
3. 学习并掌握酶促反应动力学的基本原理和实验方法。
二、实验原理米氏常数（Km）是酶的特征性常数，表示酶与底物结合的亲和力。
在一定的实验条件下，酶促反应的初速度（v）与底物浓度（[S]）之间的关系可用米氏方程表示：\[ v = \frac{V_{max} [S]}{Km + [S]} \]当底物浓度很低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，随着底物浓度的增加，反应速度逐渐加快，但增速逐渐减慢。
当底物浓度增加到一定程度时，反应速度达到最大值（Vmax），此时酶已全部被底物饱和。
本实验采用分光光度法测定酶的米氏常数。
实验中，通过改变底物浓度，测定不同浓度下酶促反应的初速度，根据米氏方程绘制v/[S]对1/[S]的曲线，通过线性回归分析求出曲线的斜率和截距，进而计算出Km和Vmax。
三、实验材料与仪器材料：1. 酶制剂（如蔗糖酶、淀粉酶等）2. 底物溶液（如葡萄糖溶液、淀粉溶液等）3. 碳酸盐缓冲液4. 4-氨基安替比林5. 铁氰化钾6. 0.1 mol/L NaOH溶液7. 葡萄糖标准溶液仪器：1. 分光光度计2. 移液管3. 移液器4. 恒温水浴5. 试管6. 比色皿四、实验步骤1. 制备酶溶液：将酶制剂溶解于适量的碳酸盐缓冲液中，调节pH值至最适值，稀释至一定浓度。
2. 制备底物溶液：将底物溶液稀释至不同浓度，备用。
3. 测定酶促反应初速度：a. 将不同浓度的底物溶液分别加入试管中，加入适量的酶溶液。
b. 将试管放入恒温水浴中保温一段时间。
c. 取出试管，立即加入适量的4-氨基安替比林和铁氰化钾，充分混匀。
d. 在分光光度计上测定溶液的吸光度，记录数据。
4. 数据处理：a. 以底物浓度[S]为横坐标，酶促反应速度v为纵坐标，绘制v/[S]对1/[S]的曲线。
b. 对曲线进行线性回归分析，求出曲线的斜率和截距。
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【米氏常数】米氏常数测定实验报告
此人姓米，单名兰，却没有米兰那种碧绿盎然，幽香沁人的素雅。
她的身高同十几年前参军时，相差无几—1.55米。
3号军装穿在身上，仍旧如长袍加身，宽大得令人忍俊不禁。
第一个对米兰发表看法的，是化验科的金云。
金云姑娘，确如行于天穹的云霞，轻盈高挑的身材，朗若明月的脸庞，使她这只“鹤”，高立于我们这所医院的所有兵姑娘之中。
姑娘对自己的美都是敏感的，“大兵”也不例外。
更何况金云的仰慕者不计其数。
不知何故，却一概吃了闭门羹，落得个没趣。
这个金云啊，美丽使她的嘴变得尖酸起来。
于是乎，米兰也逃不出她那双带着讥讽的笑盈盈的大眼睛。
从医校毕业分到化验科的第2周，金云在医学论文宣读会上，见到了比讲台高不了多少的米兰。
“米兰？嘻嘻！”她一眨黑白分明的眸子，咬着身边另一位护士的耳朵，“米氏常数。
嗯？”“米氏常数？”“酶的底物浓度取决于米氏常数。
它在同等条件下是恒定的。
你瞧，她多恒定，永远只比讲台高半尺。
咯咯！”周围的姑娘们八成听见了。
否则，各种无法揣测的眼神，为什么都聚向站在讲台后面，涨红了脸的米兰？金云矜持地向周围扫了一眼，她为自己的想象力而暗暗自得。
这位以全优成绩毕业的姑娘，连头发梢都是高傲的。
“……是个沉痛的教训。
”米兰颤动着嘴角，向幻灯投影机插进一张照片。
金云低呼了一声，礼堂里那些抄录笔记的大夫们，也交头接耳起来—幕布上一张奇丑无比的脸。
严重烧伤使患者分不清男女，辨不全五官。
变形的脸上爬满了蚯蚓似的斑痕。
又是一张照片，仍旧是一张奇丑的脸。
“手术没有获得预期效果。
主要教训是……”金云无心去关心那位没有恢复容貌的患者，也不再留神米兰那些专科术语了。
她痴呆呆地盯住米兰—“真是太一般啦！”五官似乎是符合解剖位置，但安在米兰宽大的脸庞上，总那么别扭。
又黑又硬的头发从无沿帽下“炸”开来，象一道狭窄的帽檐。
金云下意识地拂拂自己额前那蓬微微弯曲、浓密地偏向一侧的刘海。
她的天生的卷发，足以使她在那些煞费苦心，用塑料发筒修饰发型的姑娘面前，不以为然地眯上眼睛。
“是个整型外科大夫，她怎么不替自己整整？起码割个双眼皮吧？”金云注意地瞧了一眼米兰有点搭下的眼皮，“谢天谢地，我可是永远不会去找她的。
”她庆幸地一笑，悄悄从口袋里掏出一本装潢精美的外语单词本，不再注意米兰说什么了。
“小金，到我宿舍坐会儿？”金云带着几分惊诧，小心翼翼地跨进米兰的屋子。
那是个光怪陆离的迷宫。
我的妈呀！肖像陈列室么？当今中国影坛上红极一时的影星们，几乎都被米兰请到这儿了。
还有那些金发碧眼的欧美人，顶着一头螺蛳似的卷发的黑人，眉间挂着钻石披着头巾的阿拉伯人。
神态各异，维妙维肖。
金云黑亮的眉毛堆了起来，小嘴撅得高高：“她不知道美对她是多么大的揶揄？”她开始可怜米兰，甚至有些懊悔“米氏常数”的绰号，起得太损了。
米兰知道么？这几天，她似乎很注意金云，那双小眼睛，一遇到金云便熠熠发光。
似乎要吞食金云脸上那片动人的红晕。
“喜欢么？”“嗯。
”“我能为你画一幅肖像么？”“啊？！”那些水粉，油画，炭条的人物肖像，真的出自米兰的手么？金云注意到屋角的油画箱和写生板，还有一大瓶松节油。
难怪一进屋便嗅到了一股姑娘屋里少有的怪味，原来是它！“你不相信我的艺术造诣？”米兰不等金云回话，拖过一张靠椅笑嘻嘻地说，“坐啊！”自己朝后退几步，眯起细小的眼睛，“我不是外光派。
”她迅速地铺开“家伙”，往小马扎上一坐，“你脸上的色彩很丰富，线条很好。
”太诱惑人了！一幅油画肖像！金云有3册厚厚的粘胶影集。
有些姑娘翻起她的像册，总是喷嘴，露出羡慕又妒嫉的神色。
尽管都是清一色的国防绿军装，清一色的“2块5”，可穿在金云身上，却使她越发象雨后新竹般秀丽挺拔。
但金云却腻了。
横竖就那样，没什么艺术价值。
她端坐在椅子上，乜斜着米兰：“这个怪人。
试试吧。
”她想：只要米兰的笔稍有不忠实的描写，她立刻逃离这个肖像陈列馆。
“你不要紧张。
拿出平时最轻松的姿态，比方说，去见你的妈妈、爱人、朋友。
你可以随意走动，和我交谈。
”米兰滔滔不绝地说着。
金云发觉，她射向自己的眼神那么怪。
似乎金云不是一位漂亮的姑娘，
而是一件什么东西，米兰下决心要里里外外地把它研究个透彻。
金云盯住米兰身后的那面镜子。
淡褐色的线条在油画纸上很快地勾勒出来了。
金云清晰地看到自己的模样，是怎样被移到那张粗得象麻袋片的油画纸上。
“白种人和黄种人的脸部造型差异很大。
我们中华民族的人种，基本上是蒙古人种和马来人种。
你的脸型基本是蒙古人种。
你看，颧骨、鼻梁、下颏。
但你也有马来人种的特点。
你看，眼睛有些内陷，双眼皮儿，你看……”“颅相学者？麻衣相士？”金云不安地扭着身子。
米兰的眼神，总使她怀疑自己脸上是不是长了什么怪物，或是被人出其不意地抹了一把黑油。
“小金，你简直是个无可挑剔的姑娘……下巴稍低点儿……对。
现在是关键，熬几分钟好吗？……好。
小金，你的耳廓不太理想，耳垂吊上去了……当然，如果是烧伤患者，我可以考虑加一个耳垂……”金云白皙的脸涨得通红。
她觉得自己成了一只被牵到农畜产品交流会上的小牛。
而米兰是个刻薄饶舌的买主，一会儿摸摸耳朵，一会儿看看牙齿，一会儿拍拍脊背……够了! “米军医，我还要去整理一份临床生化汇编。
主任催了几天了。
”“小金，这画……”“再说吧!”高跟皮鞋敲打着梧桐树下的石路，齐膝长的藏青制服裙瞬间消失在密密的女贞树后……“真是捉弄人！”金云对同宿舍的姑娘说，“我再也不会去找她了！米氏常数!”命运之神却同金云开了一个严酷的玩笑。
金云捂着覆满纱布的脸，打摆子似地躺在米兰跟前。
下午，新来的卫生员在清洗试管烧杯时，稀里糊涂地把水倒进盛着硫酸的烧瓶。
剧烈的化学反应，使烧瓶爆炸了。
眼疾手快的金云，抓起一件工作服猛地扑过去，挡住了惊慌失措的新兵，自己的脸却不幸被硫酸溅上了。
手忙脚乱的人们，用一大块纱布蒙住了金云的脸，谁也说不清，她脸上的烧伤面积是百分之几。