酶抑制剂筛选的研究进展_唐章勇
酶抑制剂的筛选初1
Shi-Kun MA等人使用计算机虚拟筛选对HIV-1整 合酶的抑制剂进行了筛选。HIV-1整合酶（IN） 是一个用于HIV感染治疗和艾滋病预防的重要靶 酶。筛选流程如下：
酶的三维 结构测定 构建四聚体模型 和毒蛋白质的DNA 复合体模型 构建药效 基团模型 数据库中 筛选化合物
实验结果
分子动力 学模拟
4.为了更好的抑制合成产物的生成。可以用 两种或两种以上的抑制剂作用于一条酶反 应途径的不同环节。通过协同作用，使两 种抑制剂均在较低的浓度下得到更好的抑 制效果和临床疗效。 5.作用于体内与药物代谢有关的酶系。药物 代谢酶的作用是催化药物或外源性物质进 行生物转化并使其排泄出体外。为防止药 物被代谢失活，延长药物的作用时间，可 使用药物代谢酶的抑制剂来延长药物的半 衰期或减少给药次数。
活性化合物
Quality Leads
高通量药物筛选一般过程
复 深入筛选
先导化合物
Lead compounds
筛
活性样品
Hits
初
筛
活性化合物
Active Compounds
确证筛选
候选药物
酶抑制剂的分类
四，按与酶作用机制分类 1.不可逆抑制作用 这类抑制剂与酶的某些基团以共价的方式结合，一经结合后就很 难自发分解，不能用透析或超滤等物理方法解除抑制而使酶恢复 活性，它的抑制程度随着抑制剂的浓度以及抑制时间的增强而增 强。 2.可逆抑制作用 这类抑制剂与酶的结合是可逆的，结合后可以用透析，超滤等简 单的物理学方法去除抑制剂使酶全部恢复活性。这种结合往往是 非共价键的结合，这类抑制剂与酶分子的结合部位可以是酶的活 性中心，又可以是酶的非活性中心。由于这类抑制剂与游离态酶 之间存在着平衡关系，因此它的抑制程度是由酶和抑制剂之间的 亲和力的大小，抑制剂的浓度以及底物浓度所决定的，与作用时 间无关。
药物分析中的药物代谢酶抑制剂筛选
药物分析中的药物代谢酶抑制剂筛选随着药物研发的不断发展，药物代谢酶抑制剂在药物研究和开发过程中起着重要的作用。
药物代谢酶抑制剂是指在体内可以干扰药物的代谢过程，从而改变药物的代谢速率或降低药物的降解速度的一类物质。
正确筛选出药物代谢酶抑制剂对于药物开发的成功至关重要。
本文将探讨药物分析中药物代谢酶抑制剂的筛选方法和相关技术。
一、药物代谢酶抑制剂的作用机制药物代谢酶抑制剂通过与药物代谢酶互作，影响药物代谢酶的活性。
药物代谢酶一般通过氧化、还原、水解等方式对药物进行代谢。
药物代谢酶抑制剂可以与药物代谢酶结合，并使其活性受到干扰，从而改变药物的代谢过程。
药物代谢酶抑制剂可分为可逆抑制剂和不可逆抑制剂两种。
可逆抑制剂通过与药物代谢酶结合，与酶-底物互作的位点竞争，从而抑制酶的活性。
不可逆抑制剂则通过与酶共价键结合，永久地抑制酶的活性。
二、药物代谢酶抑制剂的筛选方法药物代谢酶抑制剂的筛选是药物研发过程中的重要环节。
下面将介绍几种常用的药物代谢酶抑制剂筛选方法。
1. 高通量筛选（HTS）高通量筛选是一种快速、高效的筛选方法，适用于大规模筛选药物代谢酶抑制剂。
该方法利用自动化设备，通过对大量候选化合物进行快速筛选，从中筛选出具有潜力的药物代谢酶抑制剂。
高通量筛选方法可以提高筛选效率，加速药物研发进程。
2. 酶活性测定法酶活性测定法是通过测定药物代谢酶的活性来筛选药物代谢酶抑制剂的方法。
常用的酶活性测定方法包括色谱法、光谱法、质谱法等。
通过测定药物代谢酶的酶活性变化，可以筛选出对药物代谢酶具有抑制作用的化合物。
3. 组织切片法组织切片法是一种在活体组织中进行药物代谢酶抑制剂筛选的方法。
该方法通过将候选化合物封装在适当的载体中，并与组织切片共同培养，利用组织切片的酶活性变化来评估药物代谢酶抑制剂的效果。
三、药物代谢酶抑制剂的应用药物代谢酶抑制剂广泛应用于药物研发和临床治疗中。
下面将简要介绍几个常见的应用领域。
1. 药物研发药物代谢酶抑制剂在药物研发过程中起到了重要的作用。
药物代谢酶抑制剂的筛选及其药代动力学研究
药物代谢酶抑制剂的筛选及其药代动力学研究药物代谢酶抑制剂是一类能够抑制体内药物代谢酶活性的药物。
通过抑制药物代谢酶活性，可以提高体内药物的生物利用度，延长其血浆半衰期，从而增加疗效和减少副作用。
因此，药物代谢酶抑制剂的筛选及其药代动力学研究具有重要的临床意义。
一、药物代谢酶抑制剂筛选的方法和原理药物代谢酶抑制剂筛选的方法多种多样，主要包括体外筛选和体内筛选两种。
1. 体外筛选方法体外筛选方法主要利用酶促反应体系，通过测定药物代谢酶的底物转化率或产物生成速度的变化来评估药物的抑制活性。
常用的体外筛选方法包括酶抑制试验、酶活性测定、酶结合实验等。
酶抑制试验是最常用的体外筛选方法之一，它通过在反应体系中添加不同浓度的待测化合物，观察其对药物代谢酶催化作用的抑制程度。
常用的底物包括双氢可酮、非那根、苯妥英等。
酶抑制试验通常可以通过计算半抑制浓度（IC50）来评价药物的抑制活性。
2. 体内筛选方法体内筛选方法是基于动物模型进行的，常用的方法包括小鼠或大鼠系列、猪系列等。
在体内筛选中，通过给动物灌胃或静脉注射待测化合物，然后测定药物的药代动力学参数（如血浆浓度-时间曲线）来评估其抑制活性。
通过比较药物代谢酶抑制剂组与对照组的药代动力学参数，可以判断待测化合物是否具有抑制活性。
药物代谢酶抑制剂的筛选原理主要依据于药物在体内的药动学过程。
药物在体内经过吸收、分布、代谢和排泄等过程，其中代谢是药物被机体代谢酶转化为活性代谢产物或无活性代谢产物的关键环节。
如果能够通过抑制药物代谢酶的活性，减少或延长药物的代谢速度，就可以改变药物的药效和毒性。
二、药物代谢酶抑制剂的药代动力学研究药代动力学研究是对药物在体内代谢过程的定量分析和评估。
药物代谢酶抑制剂的药代动力学研究主要包括体内药物动力学参数的测定和药物相互作用的评估。
1. 体内药物动力学参数的测定体内药物动力学参数包括药物的血浆浓度-时间曲线、药物的消除半衰期、清除率等。
酶抑制剂筛选的研究进展
酶抑制剂筛选的研究进展20世纪60年代初，Umezawa提出了酶抑制的概念,从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。
酶抑制剂新药发现的途径：一是来源于天然化合物，包括动植物和各种微生物等，二是化学合成物。
在目前上市的药物中，以受体为作用靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。
因此，酶抑制剂的开发是新药来源的一个主要途径。
以酶为靶点开发新药存在巨大潜力，今后很长一段时间仍然是发现新药的重要着手点。
1 我国酶抑制剂筛选的进展我国对酶抑制剂的研究起步较晚，始于20世纪70年代末，但是我国进行有计划、有规模的筛选还不到10年，以前的工作没有成规模的化学合成作基础，筛选分散，随机性大。
只有最近一些年来，随着高通量筛选和组合化学及组合生物合成技术的结合，规模化筛选药物得到了极大的发展，国内许多单位相继开展了酶抑制剂的筛选工作，福建省微生物研究所、上海医药工业研究院、中国医学科学院医药生物技术研究所、四川抗生素研究所等对酶抑制剂进行了大量研究。
国内最为显著的是对血脂调节剂HMG-CoA还原酶抑制剂的研究。
高通量筛选技术的发展，是我国筛选酶抑制新药的重大突破，1998年，中国医学科学院药物研究所引进了国内第一台微量闪烁计数器（microplate scintillation & lurminescense counter）对96孔板进行快速的放射性活性测定，使放射免疫实验及放射配基实验自动化、微量化，实现了从整体动物模型向高通量筛选模型的转化，为酶抑制剂的大规模筛选奠定了基础。
目前，国内利用高通量筛选每周可筛选数万个化合物。
2 酶抑制剂源目前，酶抑制剂主要来源于植物、微生物和化学合成。
微生物产生酶抑制剂是来源于微生物的初级代谢产物和次级代谢产物，研究最多的是放线菌，也是产生微生物药物最多的类群，其中最重要的是链霉菌属（streptomyces）；细菌、真菌也是酶抑制剂的重要药源微生物。
高校生物化学专业酶抑制剂筛选实验方案
高校生物化学专业酶抑制剂筛选实验方案为了研究酶抑制剂在生物化学领域的应用，本实验旨在筛选具有抑制特定酶活性的化合物，以便深入了解其生物活性和可能的药理效应。
以下是本实验的详细方案：实验材料：1. 目标酶：选择具有明确酶活性的酶作为目标，如乙酰胆碱酯酶（AChE）或蛋白酪氨酸激酶（PTK）等。
2. 酶底物：适合目标酶反应的底物，如乙酰胆碱对于AChE活性的检测。
3. 酶抑制剂样本：准备一系列有机化合物作为潜在的酶抑制剂，如天然产物或化学合成物。
4. 阳性对照组：包含已知具有抑制目标酶活性的化合物作为阳性对照，用于验证实验方法和设定阈值。
5. 阴性对照组：包含不具有抑制目标酶活性的化合物或溶剂，用于验证实验方法和排除假阳性结果。
6. 试剂：如缓冲液、底物浓度递增液、酶抑制剂稀释液等。
实验步骤：1. 预处理：根据实验需要，将目标酶、底物、酶抑制剂样本以及阳性、阴性对照组等准备好。
2. 负对照组实验：a. 在微量试管中加入适量缓冲液作为空白对照组，并记录酶活性测定结果。
b. 加入适量目标酶，使其达到最佳反应条件，并记录酶活性测定结果。
3. 阳性对照组实验：a. 在微量试管中加入适量缓冲液、阳性对照组样本和目标酶，使其达到最佳反应条件。
b. 加入适量底物，启动酶反应，并根据实验方法测定酶活性，作为阳性对照组结果。
4. 酶抑制剂筛选：a. 在微量试管中加入适量缓冲液、酶抑制剂样本和目标酶，使其达到最佳反应条件。
b. 加入适量底物，启动酶反应，并根据实验方法测定酶活性。
c. 比较各个酶抑制剂样本组的酶活性与负对照组的差异，确定是否具有抑制目标酶活性的效果。
5. 数据分析：a. 将实验结果转化为定量数据，如化合物浓度与酶活性的相关性。
b. 统计和分析每个酶抑制剂样本与目标酶的抑制作用，确定有效的化合物。
实验注意事项：1. 严格遵循实验操作规程，使用个人防护装备，如实验手套和防护眼镜等。
2. 每个实验步骤都要准确记录实验条件、操作过程和结果，以备后续分析。
天然产物中酶抑制剂的快速筛选方法研究进展
天然产物中酶抑制剂的快速筛选方法研究进展近年来，随着生物技术的不断发展，人们对于天然产物中的酶抑制剂的研究日益深入。
酶抑制剂是一类能够抑制酶活性的化合物，对于研究和开发新药物具有重要意义。
然而，由于天然产物复杂多样的特点，如何快速筛选出具有酶抑制活性的潜在候选化合物一直是一个挑战。
本文将对天然产物中酶抑制剂的快速筛选方法研究进展进行探讨。
一、酶抑制剂的筛选方法在天然产物中筛选出具有酶抑制活性的化合物需要经过一系列的实验步骤。
目前，常用的筛选方法包括分离、纯化、鉴定和评价。
1. 分离和纯化：首先，需要从天然产物中分离出具有潜在酶抑制活性的化合物。
这可以通过常规的分离技术，如层析和萃取等来实现。
分离后，需要对所得化合物进行纯化，以获得高纯度的样品。
2. 鉴定：分离和纯化后的化合物需要经过结构鉴定，以确定其化学结构和组成。
这可以通过波谱学、色谱质谱等技术进行。
3. 评价：最后，需要对已知化合物进行酶抑制活性的评价。
目前常用的方法有体外酶活性测定、酶动力学研究等。
二、快速筛选方法的研究进展为了提高天然产物中酶抑制剂的筛选效率，科研人员不断探索和研究各种快速筛选方法。
以下是几种经典的研究进展：1. 高通量筛选技术：高通量筛选技术是一种能够在短时间内对大量样品进行酶抑制活性测试的方法。
其核心是建立自动化实验平台和高效的样品处理系统，以快速筛选出具有活性的化合物。
2. 转基因酵母筛选系统：转基因酵母筛选系统是一种利用酵母细胞作为基础的快速筛选方法。
通过在酵母细胞中表达目标酶蛋白，然后加入天然产物样品，观察酵母细胞生长或荧光表达等指标变化，以筛选出具有酶抑制活性的化合物。
3. 胶体金颗粒法：胶体金颗粒法是一种通过胶体金纳米颗粒的变色反应快速筛选出具有酶抑制活性的化合物的方法。
其原理是当酶抑制剂存在时，酶活性会发生变化，导致胶体金颗粒的颜色发生可见变化。
三、进一步发展与应用酶抑制剂在新药物研发、疾病治疗等领域具有广阔的应用前景。
酶抑制剂筛选模型研究进展
合， 更 要观 察药 物对 酶 活性 的影 响 。 根 据酶 的特点 ， 酶 的反 应底 物 和产 物 都可 作 为检 测指 标［ ２ １ 。以酶 为 作用 靶 点 的 高
通量 检 测 方 法 ， 绝 大 多数 是 直 接 检测 酶 的活 性 ， 主 要 有 基
酶 的专 ＿ 二 抑制 剂 作 为药 物 ， 来调 节体 内的异 常代 谢 。 酶 抑 制剂 作 为药 物 的治 疗 基 础 是 通 过 限制 酶 催 化底 物 的 反 应 能力 ， 使 底 物 浓 度增 高 或 代 谢 产 物 浓度 降 低 ， 以 达 到 改善 症状 的 目的 。在一 系列 酶 促 反应 中 ， 以抑 制 限速 酶 或 关键 酶 的效 果 最好 。在 目前 上市 的 药物 中 ， 以受 体 为
靶 点 的药 物 占 ５ ２ ％， 以酶 为靶 点 的药 物 占 ２ ２ ％， 以离 子 通 道 为靶 点 的药 物 占 ６ ％， 以核酸 为靶 点 的 药物 占 ３ ％。酶 抑 制 剂 的开 发是 新药 的 重要 来源 。随 着现 代 生物科 学技 术 的
于放 射性 的方法 和基 于 比色 、 荧 光 的方 法 两大 类［ ３ １ 。 曹鸿 鹏 等 采 用荧 光 分 析法 建立 了流 感 病 毒 神经 氨 酸 酶抑 制 剂 的高 通量 筛选 模 型 ， 从 甲型及 乙 型流 感 病 毒 中制 备 出神 经氨 酸酶 ， 以有荧 光 特性 的化合 物为 酶 的底 物 ， 利 用
为分 子水 平 的筛 选模 型 ，也 有 少量 细胞 水 平 的筛 选 模 型 。
筛选 以酶 为 作 用靶 点 的药 物 ，不 仅 要 观 察 酶 与 药 物 的 结
域 。随着 酶学 研究 的深 入 ， 对 酶结 构 的认 识 ， 已能在 分 子水
α-淀粉酶抑制剂的研究进展剖析
目录摘要 (1)关键词 (1)Abstract (1)Key words (1)引言 (2)1 α-淀粉酶抑制剂的介绍 (2)1.1 α-淀粉酶抑制剂的来源 (2)1.2 α-淀粉酶抑制剂的特性研究 (3)2 α-淀粉酶抑制剂的制备 (4)2.1 来源于天然植物的α-淀粉酶抑制剂 (4)2.11 豆类植物 (5)2.12 麦类植物 (5)2.13 齿苋类植物 (6)2.14 其他植物 (7)2.2 来源于微生物的α-淀粉酶抑制剂 (7)3 α-淀粉酶抑制剂的分离纯化 (8)4 α-淀粉酶抑制剂的检测方法 (9)4.1 碘比色法 (9)4.2 3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法 (9)5 α-淀粉酶抑制剂的筛选方法 (10)6 α-淀粉酶抑制剂的研究进展 (11)6.1 国内外研究概况 (11)α淀粉酶抑制剂的研究进展摘要：α-淀粉酶抑制剂是一种糖苷水解酶抑制剂。
抑制糖类消化吸收药物，减少糖分的摄取，降低血糖和血脂含量，还可作为抗虫基因。
目前在医学和农业上具有广泛的用途。
本文对α-淀粉酶抑制剂的制备、检测、筛选方法、特性以及发展进行了综述，并对其前景作了展望。
关键词：α-淀粉酶抑制剂，制备，检测，筛选方法，特性Research progress of α-amylase inhibitor Abstract:α-amylase inhibitor is a kind of glycoside hydrolase inhibitor, It can be potentially use as medicines of diabetes owing to inhibiting glucose from being absorbed in the digestive tracts. Which can reduce ingestion of sugar and blood fat contet and has hypoglycemic activity, and its gene can be used as insect-resistant genes in crops breeding. There is comprehensive, application in agriculture and medicine . The preparation、detection、screening methods、characteristics and development of the α-amylase inhibitors were reviwed in this paper, and the prospects were forecasted. Key words:α-amylase inhibitor, preparation, detection, screening methods, characteristics .引言α-淀粉酶抑制剂属于糖苷酶抑制剂的一种，是一种纯天然生物活性物质，主要存在于植物种子、胚乳和微生物代谢产物中，目前在医药和农业上具有广泛的用途。
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体内水 平。 ( 1) 无 细 胞 水 平 的 筛 选。 即 直 接 用 纯 化 的 FTase在 人 工反 应 体系 中 测 定化 合 物对 它 活性 的 抑制 作 用。 FTase活 性 测 定 方 法 有 多 种, 最 常 用 的 一 种 是 测 定 [ 3H ] 法呢基从 [ 3H ] FPP 转到 R as蛋白的 数量。 一个 酶活 力单位定义为: 1 h 内在标 准反应 条件下 ( 37 e , pH 7. 4 ) 把 l pmol法呢基转移到 R as蛋白上去的酶量。这种方法的 关键是要能够完全分离 标记的 反应产物, 分离的 方法 主要 有: 凝胶电泳 法、过 滤法、免疫 沉淀 法。 ( 2 ) 细胞 水平 的筛 选。目前人们 已 采用 各 种细 胞 模型 包 括 GPAL 酵 母突 变 株、R as细胞、H eLa细胞、蛙卵母 细胞 及人肿 瘤细胞 等。其 中 GPAL 酵母突变株应用较广, 手霉素 ( m anum ycin) 族抗生 素类的三种抑制剂 UCF- A、U CF- B、UCF - C就 是用这种 方法从链霉菌属中筛选 出来的; 利用 R as细胞筛 选是 以抑 制 Ras转化细胞的停泊非依赖性生长和单层培养生 长作为 合适指标; H eLa细胞模型是通过检 测 FT ase抑制剂引 起前 核纤层蛋白 A 在 H eL a细胞 中积 累的 数量, 来评 价抑 制剂 的活性。 ( 3 ) 体内 水平 筛选。可 利用 线虫、裸鼠 等进 行筛 选, 利用线虫筛选 FTase抑 制剂可 以通 过抑 制法 呢基 化抑 制 Let- 60 R as蛋白功能, 从而抑制发生了 gf突变的 C. e-l egans幼虫 M uv表型的发生, 并且具有 剂量依 赖关系, 可以 用来评价 FT ase抑制剂的活 性, 不过 线虫的 结构和生 理功 能毕竟远不及哺乳动物 复杂, 因 此这个模 型的实 用意 义还 有待于进一步研究。 4. 3 醛糖还原酶抑制剂的筛选
上海医药 2007年 第 28卷 第 3期
筛选酶抑制剂存在巨大 的潜力, 在未来相 当长时 间内 仍是 酶抑制剂新药的主要来源。植物源酶抑制剂筛选的难点就 在于植物粗提物中 / 假阳性 0结果 太多, 干扰 真正有效 成分 的筛选, 目前, 国外对此采 取了一 系列措 施, 筛选 前先 通过 纯化, 采用提取物 通过 H PLC 或固相 萃取后 结合 质谱 作出 化合物指纹图谱库, 与已有的经验数据库进行比较, 有新成 分的粗提物再进 一步进 行药 理活性 筛选, 再者, 他们 还可 以先将粗提物通过 HPLC来鉴别出是否存在吸收光 谱有特 征的化合物, 这样可以 减少筛 选的盲 目性 [ 2]。新 药筛 选的 化合物库中有 70% 左 右为 有机 化学 产物, 因此, 合成 药是 新药的主要来源, 将高通 量筛选 技术与组 合化学 和组 合生 物合成技术的结合, 实现了酶抑制剂大规模筛选, 是世界许 多大制药公司筛选酶抑制剂新药的主要渠道。
醛糖还原酶 ( AR )是多元醇通路中的关键限速酶, 抑制 它的活性能减少山梨醇 在细胞 内的堆积, 防止一 系列 糖尿 病并发症的发生, 因此, 筛选醛糖还原酶抑制剂是糖尿病新 药来源的重要途径。其筛 选也分 为体外 筛选 和体内 筛选: ( 1) 体外筛选。目前醛糖还原酶抑制 剂的体 外筛选主 要利 用高通量筛选, 即 直接用 纯化 的 AR 在 人工 反应 体系 中测 定化合物对 AR 活性的抑制作用。其 筛选方法 为: 以 DL甘油醛为底物, 还原型辅酶 Ò ( NADPH ) 为辅 酶, 建立 AR IS 的高通量筛 选模 型, 杨 喆 [ 10] , 彭 剑 等人 [ 11] 应 用 96 孔石 英 板, 建立了 AR 的 微量高通量筛选模型, 一个 酶活单位定义 为: 反应体系在 37 e , pH 6. 2下, 在 340 nm 处吸光度 每分 钟下降 0. 001为一个单位, 以不含底物的样品为 空白对照, 测试样品对 AR 的抑制活性, AR 粗酶抑制率按以下 公式计 算: I = ( $A对照 - $A样品 ) /( $A对照 - $A空白 ) 。 ( 2 ) 体 内 筛 选。主要采用动物模型向 动物给 药, 提取 分离血 浆中 的红 细胞, 体外测定红 细胞中 AR 的 活性。 目前 测定 红细 胞中 AR 活性的方法有: 柱层析法、荧光法和 EL ISA[ 12~ 。 14]
酶抑制剂筛选的研究进展
唐章勇 唐灿 ( 西华大学生物工程学院 成都 610039)
中图分类号: R 97Fra bibliotek文献标识码: A
文章编号: 1006- 1533( 2007 ) 03- 0117 - 03
20世纪 60年代 初, Um ezawa提出 了酶抑 制的概 念, 从 而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。酶抑制剂新 药发现的途径: 一是来源于天然化合物, 包括动植物和各种 微生物等, 二是化学合成物。在目前上市的药物中, 以受体 为作用 靶点的 药物占 52% , 以酶 为靶点的 药物占 22% , 以 离子通道 为 靶 点 的 药 物 占 6% , 以 核 酸 为 靶 点 的 药 物 占 3% 。因此, 酶抑制剂的开 发是新 药来 源的一 个主要 途径。 以酶为靶点开发新药 存在巨大 潜力, 今 后很长 一段时 间仍 然是发现新药的重要着手点。
2 酶抑制剂源 目前, 酶抑制剂主要 来源于 植物、微生物 和化学 合成。
微生物产生酶抑制剂是来源于微生物的初级代谢产物和次 级代谢产物, 研究最多的是放线菌, 也是产生微生物药物最 多的类群, 其中最 重要的是 链霉菌 属 ( strep tom yces) ; 细菌、 真菌也是酶抑制剂的重要药源微生物。除了传统的药源菌 筛选分离外, 研究人员 的注意力 更集中 到了各 种新的 微生 物类群中, 如海洋微生物、极端微生物 [1] 。自然界植物种类 丰富, 但仅有不 到 10% 被测 定过 某种 生物 活性, 从植 物中
1 我国酶抑制剂筛选的进展 我国对 酶抑制 剂的研究 起步较 晚, 始于 20世 纪 70 年
代末, 但是我国进行有计划、有规模的筛选还不到 10年, 以 前的工作没有成规模的化学合成作基础, 筛选分散, 随机性 大。只有最近一些年来, 随着高通 量筛选 和组 合化学 及组 合生物合成技术的结 合, 规模化 筛选药 物得到 了极大 的发 展, 国内许多单位相继开展了酶抑制剂的筛选工作, 福建省 微生物研究所、上海医药工业研究院、中国医学科学院医药 生物技术研究所、四川 抗生素研 究所等 对酶抑 制剂进 行了 大量研究。国 内最 为显 著 的是 对血 脂 调节 剂 HMG - CoA 还原酶抑制剂的研 究。高通量筛 选技 术的发 展, 是我 国筛 选酶 抑制 新药的 重大突 破, 1998 年, 中国 医学 科学院 药物 研究所引进了国内第一台微量闪烁计数 器 ( m icrop late scint illat ion & lu rm inescen se coun ter)对 96孔板进行快速的放射 性活性测定, 使放射免疫实验及放射配基实验自动化、微量 化, 实现了从整体动物模型向高通量筛选模型的转化, 为酶 抑制剂的大规模筛 选奠定了 基础。目 前, 国内 利用高 通量 筛选每周可筛选数万个化合物。
4 筛选方法 酶抑制剂筛选的方 法主要分 为体 内和体 外筛选, 体内
筛选即利用动物进行 筛选, 体外 筛选包 括体外 试管筛 选和 体外细胞筛选, 以下介绍几种酶抑制剂的筛选方法。 4. 1 HMG- CoA 还原酶抑制剂的筛选
HM G - CoA 还原酶是合成胆 固醇 过程的 限速酶, 抑制 其活性即可抑制胆 固醇的合 成, 从而 起降血 脂作 用。其筛 选方法为: ( 1 )固醇 脂质 合 成的 同位 素掺 入 法 [ 8] 。用 鼠肝 微粒体或胞浆酶作为 粗酶制剂, 在反应 体系中 加入同 位素 标记的 合 成 前 体 如 [ 14 C] - 乙 酸 或 D, L - [ 14 C ] HMG CoA, 或 D, L[ 14 C ] - 甲羟 戊酸 作为 底物, 反应 后测 定 形成 的固醇中同位素的掺 入率, 样品 抑制固 醇脂质 合成能 力可 以通过与对照组数据对比求 得。 ( 2) 利用对 某些真 菌的抑 制活性及其用加酶催化产物 抵消试验 来筛选。 ( 3) 应用酶 联免疫吸附测定法将已知的 B- 羟 - B - 甲基戊 二酰辅酶 A (HM G- CoA ) 还原酶 抑制剂 com pactin 与蛋 白质交 联, 其 交联物免疫动物获得抗体。酶标抗体作为探针在发酵液中 定向寻找目标物。采用双抗体 法进行筛 选 [ 9] 。 ( 4 ) 动物实 验。用于进一步的活性测定, 方法是从大鼠尾静脉注射 tr-i tonW R - 1339盐水溶液, 注射后立即停止喂食, 并 持续使其 处于饥饿状态, 被检测 的大鼠 在注射 triton后 分几次 给药, 在注射 triton 24 h 后取 肝和 血浆 测总 胆固 醇和 甘油 酯, 评 价样品降血脂的效果 [ 8]。 4. 2 法呢基转移酶抑制剂的筛选
3 筛选模型 酶抑制剂的筛选模型分为三类: 整体动物水平模型、组
织器官水平模型和细胞分子水平模型。整体动物模型通常 效率低、耗费多, 筛选 的 样品 量多 而筛 选 出的 化合 物却 很 少, 并不适合作为药物 初筛的模 型。而组 织器官 模型 是药 物筛选的一大进步, 它在 一定程 度上克服 了整体 动物 模型 的不足, 减少了筛选样 品量, 降低 了劳动 强度, 扩 大了 筛选 规模, 减少了动物用量, 提高了筛选效率, 降低了筛选成本, 但是尽管这样, 还是存 在规模小、效率低、样品量 较大 等缺 点, 不易实现一药多筛。随 着酶和 受体作 为靶分 子的 阐明 及分子生物学和细胞生 物学技 术的发展, 分子药 理学 的不 断深入, 细胞分子水平药物筛选模型应运而生, 此模型克服 了前两者的缺点, 实现了大样本量的筛选和一药多筛, 已成 为目前药物筛选的主要 方法, 使 传统的手 工筛选 形式 转变 为由计算机控制的自动 化大规 模筛选的 新技 术体系, 从而 产生了高通量筛选 [ 3, 4] 。高通 量筛选 始于 20 世纪 80 年代 后期, 在 20 世纪 90年代后期得到极大发展, 已成为 酶抑制 剂新药发现的主要手段, 筛选快速、高效, 其筛选的过程为: 粗筛 y 复筛 y 深入筛选 y 确证筛选。其先进的检测方法使 每周筛选数万个化合物 成为可 能, 对酶抑 制剂的 筛选 大多 数情况测定酶活性即可检测, 其检测方法主要为: 放射免疫 检测 ( R IA )、荧光检测 ( FA )、闪 烁接近 检测 ( SPA )、比 色法 检测等。 F lotow 通过 放射 法已 成功 建立 了 P56kk激 酶抑 制 剂的高通量筛选模型。 Taft等 [ 5] 也 利用此 法建 立了 ( 1. 3 )