食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 PPT课件
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食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
附件食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。
2 檢驗方法〆2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。
每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。
2.2 器具及材料〆2.2.1 乾熱滅菌器。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。
2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。
2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。
2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。
2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其他缺點。
2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。
2.2.11 pH測定儀。
2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。
2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
2.2.15 接種針及接種環（直徑約3 mm）〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。
2.2.16 曲玻棒〆可滅菌者，直徑3～4 mm，塗抹區域45～55 mm。
2.2.17 試管〆10 ×100 mm，13 ×100 mm，13 ×120 mm，15 ×150 mm，16 ×150 mm試管，或其他適用者。
阪崎肠杆菌检验技术
食品中阪崎肠杆菌检验
生态分类
一、阪崎肠杆菌概况
阪崎肠杆菌属肠杆菌科，是人和动物肠道中寄生的一种革 兰阴性无芽胞杆菌。是肠道正常菌群的一种，在一定条件 下可引起人和动物致病。1980年以前命名为黄色阴沟肠 杆菌，1980年更名为阪崎肠杆菌。
一、阪崎肠杆菌概况
生态分布 家庭、温泉、鼠、苍蝇、植物根围、沉积物，沼泽地、土壤、食品等均有检出阪 崎肠杆菌的报导。有报导推测，昆虫可能是阪崎肠杆菌的环境宿主。 婴儿配方粉的污染： 内在污染：--由加工环境中微生物的存在；加工装置内表面微生物的存在；热处理 后，与干燥基粉混合的加入成分中存在的微生物造成。 外源性污染：--受阪崎肠杆菌污染的配方粉或调制好的配方奶在较高温度下存放， 食用前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长等都可导致阪崎肠杆菌有机会生长繁 殖，增加患病的危险性。
三、阪崎肠杆菌菌定量检测
1g(mL)×3
取样量 10g(mL)×3
100g(mL)×3
BPW 1：10 稀释
mLST-Vm
DFI、TSA
生化鉴定
报告 （MPN值）
操作规程
前增菌 选择性增菌 显色培养基 验证试验 结果报告
三、阪崎肠杆菌菌定量检测
各100ml（g)
各10ml（g)
各900ml（g) 各移1ml
900 ml BPW
样品
100mL（g） 溶解 预热
44℃
36±1℃ 18h±2h
选择性增菌 44±0.5℃
24h±2h
10mL mLST-Vm肉汤
挑取蓝绿色菌落
操作规程 API20E鉴定系统
二、阪崎肠杆菌菌定性检测
TSA平板上直接挑取黄色菌 落进行鉴定
结果鉴定
二、阪崎肠杆菌菌定性检测
生态分类
一、阪崎肠杆菌概况
阪崎肠杆菌属肠杆菌科，是人和动物肠道中寄生的一种革 兰阴性无芽胞杆菌。是肠道正常菌群的一种，在一定条件 下可引起人和动物致病。1980年以前命名为黄色阴沟肠 杆菌，1980年更名为阪崎肠杆菌。
一、阪崎肠杆菌概况
生态分布 家庭、温泉、鼠、苍蝇、植物根围、沉积物，沼泽地、土壤、食品等均有检出阪 崎肠杆菌的报导。有报导推测，昆虫可能是阪崎肠杆菌的环境宿主。 婴儿配方粉的污染： 内在污染：--由加工环境中微生物的存在；加工装置内表面微生物的存在；热处理 后，与干燥基粉混合的加入成分中存在的微生物造成。 外源性污染：--受阪崎肠杆菌污染的配方粉或调制好的配方奶在较高温度下存放， 食用前不加热，或加热不彻底，喂食时间较长等都可导致阪崎肠杆菌有机会生长繁 殖，增加患病的危险性。
三、阪崎肠杆菌菌定量检测
1g(mL)×3
取样量 10g(mL)×3
100g(mL)×3
BPW 1：10 稀释
mLST-Vm
DFI、TSA
生化鉴定
报告 （MPN值）
操作规程
前增菌 选择性增菌 显色培养基 验证试验 结果报告
三、阪崎肠杆菌菌定量检测
各100ml（g)
各10ml（g)
各900ml（g) 各移1ml
900 ml BPW
样品
100mL（g） 溶解 预热
44℃
36±1℃ 18h±2h
选择性增菌 44±0.5℃
24h±2h
10mL mLST-Vm肉汤
挑取蓝绿色菌落
操作规程 API20E鉴定系统
二、阪崎肠杆菌菌定性检测
TSA平板上直接挑取黄色菌 落进行鉴定
结果鉴定
二、阪崎肠杆菌菌定性检测
阪崎肠杆菌_ppt课件
※氧化酶阴性
※过氧化氢酶阳性，并生成黄色菌落
营养成分表
样品
美赞臣 安婴儿婴儿配方奶粉
罐装
配料表： 100%进口奶源配料：乳糖、精炼植物油、浓缩 乳清蛋白、脱脂奶粉、低聚半乳糖（GOS）、 花生四烯酸（ARA）和二十二碳六烯酸（DHA） （来源于单细胞油）、矿物质（碳酸钙、氯化钙、 柠檬酸钾、氯化钾、氯化镁、硫酸亚铁、硫酸锌、 硫酸铜、硫酸锰、亚硒酸钠、碘化钾）、玉米糖 浆固体、维生素（维生素A、维生素D3、维生素 E、维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、 维生素B12、维生素K1、胆碱、肌醇、烟酰胺、 叶酸、泛酸、生物素）、牛磺酸、核苷酸、食品 添加剂：磷脂、抗坏血酸棕榈酸酯、氢氧化钙、 碳酸氢钾。
44 ℃±0.5 ℃ 培养24h±2h 。
10 mL mLST-Vm 肉汤
36 ℃±1 ℃培 养24 h±2 h。
各取增菌培养物1 环，分 别划线接种于两个阪崎肠 杆菌显色培养基平板
①前增菌和 增菌
②分离
挑取1 个～5 个可疑菌落，划 线接种于TSA 平板。 25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。
③鉴定
阪崎肠杆菌显色培养基DFI
微生物
菌落颜色
• 阪崎肠杆菌 • 大肠杆菌 • 金黄色葡萄球菌
蓝绿色 无色菌落 被抑制不生长
培养基和试剂
• 4 、胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar， TSA）：见附录A 中A.3。
• 5 、生化鉴定试剂盒。 • 6、 氧化酶试剂：见附录A 中A.4。 • 7、 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.5。 • 8 、L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.6。 • 9 、L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A 中A.7
阪崎肠杆菌
发生在
小肠结肠炎 成人菌血症
成年人
局部感染
3 致病机制
动物实验表明阪崎肠杆菌致病机制可能与侵入 及肠毒素作用有关。
Pagotto
3.1 实验一
108CFU/鼠
经口注射
经腹腔注射
2株死
乳鼠全死，4株产肠毒素
Tonwsand
3.2 实验二
大肠埃希菌注射小鼠
原因： 阪崎肠杆菌增强 阪崎肠杆菌注射 了肠道与血脑屏 障通透性
阪崎肠杆菌的致病机制
引言
新闻： 2002 年Dennison 从1 名64 岁的外周 血管患者的伤口上分离到阪崎肠杆菌。 2002年Ongradi 等报道了阪崎肠杆菌 引起匈牙利1 名26 岁女患者阴道感染
一、简介
二、易感染人群
三、 致病机理
四、控制方法
1、阪崎肠杆菌的简介
1.1 细菌简介：
(1).宿主部位：人和动 物肠道内 (2).0.6~1.1μm×1.2 ~3.0μm (3).菌落形态：不同琼 脂其菌落形态不同 (4).细菌特点：革兰氏 阴性无芽孢杆菌
从其他部位提取到
3.3 破坏细胞过程
1
粘附
2
侵入与诱 导凋亡
3
免疫逃避
3.3.1 粘附 弥散性粘附
最大粘附 所在时期
粘附性
细胞表面局部 定植菌群粘附
生长对 数期后 期
混合型
3.3.2 侵入和诱导凋亡
前期
①细菌结合 中期
①PI3-激酶和APKC被激活, ② 表达的未激活 PI3-激酶和APKC抑制其侵入 HBMEC
1) 科学地喂养适 宜的母乳代用品 2）提出警示 3）用开水冲调配 方食品 4）剩余的液体调 配食品→冰箱保存 5）食用前加热。
食品卫生微生物学检验培训课件
食品卫生微生物学检验
甲 乙甲 乙
4
5
丙 丁丙 丁
甲 乙甲 乙
9
10
丙 丁丙 丁
2
食品卫生微生物学检验一 实验准备
❖ 培养基制备 ❖ 高压蒸汽灭菌 ❖ 器材预算 ❖ 刻度吸管的无菌操作方法
食品卫生微生物学检验
3
培养基的制备（40人份）
组号
1+2 +3+4
5
培养基
乳糖胆盐 发酵培养基
营养琼脂
称量g 水量ml
❖ 大肠菌群并非细菌学分类命名, 而是卫生细菌领域的 用语, 它不代表某一个或某一属细菌, 而是指具有某 些特性的一组与粪便污染有关的细菌, 是评价食品卫 生质量的重要指标之一。
❖ 大肠菌群在生化及血清学方面并非完全一致, 其定义 为: 需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的 革兰阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大 肠埃希菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属和肠杆菌属 等四个属的细菌。
食品卫生微生物学检验
13
器材准备
❖ 1.冰箱: 0～4℃ ❖ 2.恒温培养箱: 35～37℃ ❖ 3.恒温水浴箱: 45～47℃ ❖ 4.灭菌1ml刻度吸管: 3支×10组×2倍 ❖ 5.灭菌10ml刻度吸管: 2支×10组×2倍 ❖ 6.灭菌90mm平皿: 7个×10组×2倍 ❖ 7.灭菌70mm平皿: 4个×2×10组×2倍 ❖ 8.灭菌中试管: 2支×10组×2倍
条包住吸管向前转动几圈, 将吸管尖退入纸筒内约3～4 厘米, 把纸筒起始端压平, 打折180度 （折3～4 厘米长、纸筒壁厚度约三层纸, 不容易被管尖扎破）, 转动并压住起始端打折部分, 继 续转动。转动时, 右手将纸条向前推平, 左手将吸管向后拉紧, 同时向前转动, 吸管就能够包得 很紧。纸筒形成以后, 把末端空心纸筒压平固定, 打折, 系牢, 多余的纸撕掉。 ❖ 每10支用1/2版（宽 20cm）的报纸包成1包。 ❖ 高压蒸汽灭菌, 烤干备用。
食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 ppt课件
（三）神经系统症状：烦躁、哭声尖直、嗜睡甚至昏迷，可出现凝视、 惊厥，查体可有头围增大、颅缝裂开、前囟张力增高、脑膜刺激征阳 性。
阪崎肠杆菌介绍
易感人群:
免疫力低下者和婴幼儿、新生儿， 尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感 染来源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉， 人与人之间无传染性。
阪崎肠杆菌介绍
1、阪崎肠杆菌在自然界分布广泛，在水、土壤、食 物、排泄物等中都能够检出。细菌不耐热，加热到 72℃持续15秒就可以杀灭。细菌不在人与人之间传播。 2、阪崎肠杆菌在一般情况下不对人体健康产生危害， 但对于新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。 3、绝大多数患者为轻症病例，表现为轻微的消化道 症状，恢复良好；重症病例罕见但病死率高。对于发 现的病例应及时报告。
阪崎肠杆菌介绍
阪崎肠杆菌（Enterobater sakazakii）属肠杆菌科肠杆 菌属，革兰染色阴性杆菌。阪崎肠杆菌在自然界分布 广泛，繁殖迅速，但不耐热，可通过巴斯德消毒法杀 灭。阪崎肠杆菌属条件致病菌，在一般情况下，不对 人体健康产生危害，但对于免疫力低下者和婴幼儿、 新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感染来 源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉，人与人之间无传
食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 ppt课件
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
一、采标情况
二、适用范围 三、操作过程 1 第一法 阪崎肠杆菌的检验 2 第二法 阪崎肠杆菌的计数
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
二、适用范围
适用于婴幼儿配方奶粉、乳和乳制品及 其原料中阪崎肠杆菌的检验
挑取绿色菌落
接种TSA平板
25℃±1 ℃ 48 h ± 4 h 挑取黄色菌落
生化鉴定
阪崎肠杆菌介绍
易感人群:
免疫力低下者和婴幼儿、新生儿， 尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感 染来源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉， 人与人之间无传染性。
阪崎肠杆菌介绍
1、阪崎肠杆菌在自然界分布广泛，在水、土壤、食 物、排泄物等中都能够检出。细菌不耐热，加热到 72℃持续15秒就可以杀灭。细菌不在人与人之间传播。 2、阪崎肠杆菌在一般情况下不对人体健康产生危害， 但对于新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。 3、绝大多数患者为轻症病例，表现为轻微的消化道 症状，恢复良好；重症病例罕见但病死率高。对于发 现的病例应及时报告。
阪崎肠杆菌介绍
阪崎肠杆菌（Enterobater sakazakii）属肠杆菌科肠杆 菌属，革兰染色阴性杆菌。阪崎肠杆菌在自然界分布 广泛，繁殖迅速，但不耐热，可通过巴斯德消毒法杀 灭。阪崎肠杆菌属条件致病菌，在一般情况下，不对 人体健康产生危害，但对于免疫力低下者和婴幼儿、 新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感染来 源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉，人与人之间无传
食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 ppt课件
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
一、采标情况
二、适用范围 三、操作过程 1 第一法 阪崎肠杆菌的检验 2 第二法 阪崎肠杆菌的计数
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
二、适用范围
适用于婴幼儿配方奶粉、乳和乳制品及 其原料中阪崎肠杆菌的检验
挑取绿色菌落
接种TSA平板
25℃±1 ℃ 48 h ± 4 h 挑取黄色菌落
生化鉴定
阪崎肠杆菌检验
第一部分：一般特征
一．培养特征 二．生化反应 三．抵抗力 四．增殖能力
与其他常见肠杆菌相似
5
一、培养特征
阪崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、 血平板、麦康凯(MacConkey，MAC)琼脂、伊红美蓝 琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。
ES在VRBGA平板上首次划线分离时，37℃培养24h可生成2种不同 的形态学特征： 1. 干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时 可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落 可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。 2. 光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。
阪崎肠杆菌检验
GB 4789.40--2010
Enterobacter sakazakii(ES)
2
内
容
第一部分：一般特征 第二部分：致病性 第三部分E．sakazakii)是人和动物肠道内 寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，属肠杆 菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种 ，在一定条件下可引起人和动物致病。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小 肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50% 以上 。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌 的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配 方粉是目前发现的主要感染渠道。
7
二、生化反应
8
• DNASE-脱氧核糖核酸酶
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
10
三、抵抗力
• 耐热性 • 渗透压 • 干燥
不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消 毒过程能有效的灭活ES。 ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株， 增加PIF（婴儿配方奶）加工后污染的危险性，使其在PIF （婴儿配方奶） 中长期存活。
66食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
培养基和试剂
A.1 缓冲蛋白胨水（BPW）
A.1.1.1 成分 蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 磷酸二氢钾 蒸馏水
pH 7.2 A.1.1.2 制法
加热搅拌至溶解,调节 pH，121 ℃高压灭菌 15 min。
10.0g 5.0 g 9.0 g 1.5 g 1 000 mL
A.7 L-精氨酸双水解酶培养基
A.7.1 成分
L-精氨酸盐酸盐（L-arginine monohydrochloride）
5.0 g
酵母浸膏 葡萄糖 溴甲酚紫
3.0 g 1.0 g 0.015 g
蒸馏水
1 000 mL
pH 6.8±0.2 A.7.2 制法
将各成分加热溶解，必要时调节 pH。每管分装 5 mL。121 ℃高压 15 min。
A.8.4 实验方法
挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h， 观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。
8
A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基
GB 4789.40—2010
A.9.1 成分
柠檬酸钠
2.0 g
氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢铵
I
GB 4789.40—2010
食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
1 范围
本标准规定了食品中阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）的检验方法。 本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱：25 ℃±1 ℃，36 ℃±1 ℃，44 ℃±0.5 ℃。 2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 2.3 恒温水浴箱：44 ℃±0.5 ℃。 2.4 天平：感量 0.1 g。 2.5 均质器。 2.6 振荡器。 2.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌锥形瓶：容量 100 mL、200 mL、2000 mL。 2.9 无菌培养皿：直径 90 mm。 2.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 2.11 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）：见附录 A 中 A.1。 3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin
A.1 缓冲蛋白胨水（BPW）
A.1.1.1 成分 蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 磷酸二氢钾 蒸馏水
pH 7.2 A.1.1.2 制法
加热搅拌至溶解,调节 pH，121 ℃高压灭菌 15 min。
10.0g 5.0 g 9.0 g 1.5 g 1 000 mL
A.7 L-精氨酸双水解酶培养基
A.7.1 成分
L-精氨酸盐酸盐（L-arginine monohydrochloride）
5.0 g
酵母浸膏 葡萄糖 溴甲酚紫
3.0 g 1.0 g 0.015 g
蒸馏水
1 000 mL
pH 6.8±0.2 A.7.2 制法
将各成分加热溶解，必要时调节 pH。每管分装 5 mL。121 ℃高压 15 min。
A.8.4 实验方法
挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h， 观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。
8
A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基
GB 4789.40—2010
A.9.1 成分
柠檬酸钠
2.0 g
氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢铵
I
GB 4789.40—2010
食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
1 范围
本标准规定了食品中阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）的检验方法。 本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱：25 ℃±1 ℃，36 ℃±1 ℃，44 ℃±0.5 ℃。 2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 2.3 恒温水浴箱：44 ℃±0.5 ℃。 2.4 天平：感量 0.1 g。 2.5 均质器。 2.6 振荡器。 2.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌锥形瓶：容量 100 mL、200 mL、2000 mL。 2.9 无菌培养皿：直径 90 mm。 2.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 2.11 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）：见附录 A 中 A.1。 3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin