临床生化检验 第四章 脂蛋白的测定

评价：
➢优点：本法灵敏度高、准确度高、精密度好，线性范围宽。
➢主要缺点是：
①某些胆固醇酯酶对胆固醇酯的水解不完全，不能用纯胆固醇结晶以有机 溶剂配制的溶液作为TC分析的校准液，而应以准确定值的血清作为标准， 此校准液（品）相当于三级标准。 ②表面活性剂，如吐温-40可以干扰胆固醇酯酶的作用，而聚乙烯醇6000 可使结果提高1％～2％；
2.比色
加入物 血清上清液(ml) 标准液上清液(ml) 异丙醇(ml) 显色剂(ml)
空白管 － － 1.0 3.0
标准管 － 1.0 － 3.0
测定管 1.0 － － 3.0
充分混匀后继续60℃水浴15min，然后置室温冷却后530～ 550nm比色。
计算
血清
TG(mmol/L)＝
测定管吸光度 标准管吸光度
【临床意义】
TC除了作为高胆固醇血症的诊断指标之外，不能作为其它任何疾病的诊断 指标，对于动脉粥样硬化和冠心病而言，TC是一个明确的危险因子，与冠心 病的发病率呈正相关。
影响TC水平的因素
①年龄与性别； ②长期的高胆固醇、高饱和脂肪酸和高热量饮食可使TC增高； ③遗传因素； ④其它：如缺少运动、脑力劳动、精神紧张等可能使TC升高。
× 标准液浓度
参考值 犬：3.50-
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意义 。?
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评价
本法测定范围较宽，干扰因素多，准确测定有赖于 从标本中抽提、皂化、纯化过程，操作较繁，不适于 大批量标本分析及自动分析，一般很少用。
二、磷酸甘油氧化酶法（GPO-PAP法）
原理
试剂
1. 甘油三酯液体稳定酶试剂组成
GOODs缓冲液(pH7.2) 50mmol/L
一、高铁——硫酸显色法测TC （理解）
原理
操作
加入物 血清(ml) 标准液(ml) 蒸馏水(ml) 抽提剂(ml) 40mmol/L H2SO4(ml)
上清液(ml) 皂化剂(ml)
氧化剂(ml) 显色剂(ml)
空白管 － － 0.2 2.5 0.5
标准管 － 0.2 － 2.5 0.5
采用酶反应原理的干化学法颇为实用，其缺点是价格高， 精密度差。胆固醇的酶测定法始于70年代。由于操作简便，试 剂无腐蚀性，特别适用于自动生化分析，目前已成为测定胆固 醇的主要方法。
CEH-COD-PAP法
原理：
胆固醇酶测定法的试剂中，除了上述三种酶、酚和4-氨基安替比林 外，还有维持pH恒定的缓冲液、胆酸钠、表面活性剂以及稳定剂等。 胆酸钠是为了提高胆固醇酯酶的活性，表面活性剂的作用是促进胆固醇 从脂蛋白中释放出来
计算
血清
TG(mmol/L)＝
测定管吸光度 标准管吸光度
× 标准液浓度
参考值
评价
本法测定范围较宽，干扰因素多，准确测定有赖于 从标本中抽提、皂化、纯化过程，操作较繁，不适于 大批量标本分析及自动分析，一般很少用。
（一）化学测定法
特点：
化学测定法通常需抽提纯化。显色剂主要有两类： ①醋酸-醋酐-硫酸 ②高铁硫酸。
操作
加入物 血清(μl) 标准液(μl) 蒸馏水(μl) 酶试剂(μl)
空白管 － － 10
1000
标准管 － 10 －
1000
测定管 10 － －
1000
混匀后37℃水浴5 min，用分光光度计比色，以空白管调 零，于500 nm波长处测各管的吸光度。
评价
具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点，适用于手工 和自动化测定；其主要缺点是所测TG值包括了血清中游离 的甘油。
2．Zak反应
1953年Zak提出用硫酸、醋酸和Fe3+等与胆固醇作用 生成紫红色化合物来测定胆固醇，称为Zak反应。
(二)酶测定法
特点：
常规测定中现已广泛应用酶法，酶法具有特异性好，精密度 和灵敏度都能很好地满足临床实验室的要求，既可以手工操作， 也适合自动分析，但酶法测定中出现了不同程度的基质效应。
操作
加入物 血清(ml) 标准液(ml) 蒸馏水(ml) 抽提剂(ml) 40mmol/L H2SO4(ml)
上清液(ml) 皂化剂(ml)
氧化剂(ml) 显色剂(ml)
空白管 － － 0.2 2.5 0.5
标准管 － 0.2 － 2.5 0.5
测定管 0.2 － － 2.5 0.5
边加边摇，使之充分混匀，静置分层后，
种类：
分为ApoA、B、C、D、E、F、G、H、J等。
（四）脂蛋白受体
主要有LDL受体、残粒受体（remnant receptor）及清道 夫受体（scavenger receptor）。
（五）胆固醇酯转运蛋白
组成：
胆固醇酯转运蛋白（CETP） 磷脂转运蛋白（PTP） 甘油三酯转运蛋白（TTP）
第四章 脂蛋白的测定
概述
一、血脂及血浆脂蛋白
定义： 血脂：是血浆中的中性脂肪和类脂的总称
脂蛋白：脂类难溶于水，正常血浆脂类物质 与蛋白质结合成脂蛋白的形式存在。
（一）血浆脂蛋白的分类
乳糜微粒（chylomicron,CM）
极低密度脂蛋白（VLDL)
超速离心
中间密度脂蛋白（IDL) 低密度脂蛋白（LDL）
（六）脂代谢有关酶
脂蛋白脂肪酶 (lipoprotein lipase, LPL) 卵磷脂-胆固醇酰基转移酶 (LCAT) HMG CoA还原酶(HMGCoA reductase)
(七)血浆脂蛋白代谢
外源性代谢
L
CM代谢：饮食摄入的Ch和TG 在小肠中合成CM及其代谢过程
P
代 谢
VLDL-IDL-LDL代谢：由肝合成 VLDL, 再转变为IDL和LDL,并被肝 或其它器官代谢的过程
常规方法:
1．磷钨酸-镁法
2．HDL直接测定法
HDL直接测定法大致分三类，分别是: 聚乙二醇/抗体包裹法 酶修饰法 选择性抑制法，又称掩蔽法，
【参考值】
HDL-C合适范围： ≥1.04mmol/L (40mg/dl), ＜0.91mmol/L (35mg/dl)为减低。
【临床意义】
流行病学与临床研究证明，HDL-C与冠心病发病呈负相关， HDL-C低于0.9 mmol/L 是冠心病危险因素。HDL-C大于 1.55mmol/L被认为是冠心病的“负”危险因素。 HDL-C下降 还多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化病人。高TG血症往 往伴以低HDL-C，肥胖者的HDL-C也多偏低。吸烟可使HDLC下降，适量饮酒、长期体力劳动和运动会使HDL-C升高。
分别准确吸取上清液于另外 3 支试管中
0.3
0.3
0.3
1.0
1.0
1.0
加入皂化剂后，充分混匀各管，56℃水浴保温
5min，然后再分别加入下列试剂
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
混匀，56℃水浴保温25 min，冷却，于415 nm波长 处，以空白管调零，测出各管的吸光度。
计算
血清
TG(mmol/L)＝
1. 甘油三酯液体稳定酶试剂组成
GOODs缓冲液(pH7.2) 50mmol/L
脂蛋白脂酶
≥4 000U/L
甘油激酶
≥40 U/L
磷酸甘油氧化酶
≥500 U/L
过氧化物酶
≥2 000U/L
ATP
2.0mmol/L
硫酸镁
15mmol/L
4-AAP
0.4mmol/L
4-氯酚
4.0mmol/L
2. 三油酸甘油酯标准液
③本法具有氧化酶反应途径的共同缺陷，易受到一些还原性物质如尿酸、 胆红素、维生素C和谷胱甘肽等的干扰。
【参考值】
血清总胆固醇合适范围： ≤5.20mmol/L (200mg/dl)，
边缘升高：5.23～5.69mmol/L(201～219mg/dl)，
升高：≥5.72mmol/L (220mg/dl)。
第二节 血清总胆固醇（TC）的测法
一、异丙醇抽提，高铁——硫酸显色法测TC （理解） 原理
试剂
1.异丙醇 2.氧化铝 3.三氯化铁贮存液 4.显色剂 FeCl3贮存液与浓硫酸混合 5.胆固醇标准液
操作
1.制备上清：吸取血清及标准液200ul，放入离心管，向吹 入异丙醇5．0ml，冲散血清，使蛋白沉淀成细颗粒，加塞混 匀后放在60℃水浴中1min，加入氧化铝1g，加塞，将试管横 卧固定在震荡器上摇10min，离心。
脂蛋 白的
脂蛋白（a）[Lp(a)] 高密度脂蛋白（HDL)
分类
乳糜微粒
电泳法
前- -脂蛋白 -脂蛋白

CM
前
♁
-脂蛋白
（二）血浆脂蛋白的组成与结构
结构：
TG－rich Lipoprotein
CM
TG
90~95%
50~65%
2~4%
2~6% ~1% 1~2%
CE
8~14%
PL
高TC血症：原发和继发
低TC血症：原发和继发
四、血清（浆）脂蛋白测定
(一)血清脂蛋白电泳
脂蛋白电泳分析可分为预染法和电泳后染色法两大类。
预染法的操作比较简单，分离效果直观。其操作过程是先 将待测血清和苏丹黑染料按一定比例混合进行预染处理，离心后 取上清液进行电泳分析。
电泳后染色法为用电泳方法先将血浆脂蛋白各成份分开，再 用苏丹黑或油红O进行染色。
测定管 0.2 － － 2.5 0.5
边加边摇，使之充分混匀，静置分层后，
分别准确吸取上清液于另外 3 支试管中
0.3
0.3
0.3
1.0
1.0
1.0
加入皂化剂后，充分混匀各管，56℃水浴保温
5min，然后再分别加入下列试剂