流式细胞基本知识
流式细胞术的基本原理
流式细胞术的基本原理流式细胞术是一种广泛使用的细胞分析技术，可以用于分离、鉴定和计数单个细胞，同时可以对细胞的形态、大小、表面分子、细胞器和细胞活性等方面进行分析。
这项技术已经成为生物医学研究和临床诊断的重要工具之一。
流式细胞术的基本原理是将细胞悬浮液通过一根细长的玻璃管，使细胞单个地通过一束激光束，利用光学和电子学技术分析细胞的特性。
这个过程可以分为样本制备、细胞计数和细胞分析三个步骤。
样本制备在进行流式细胞术之前，需要对样品进行一系列的处理，以便得到单个、均匀分布的细胞悬浮液。
样品处理的方法包括细胞分离、细胞培养和细胞染色等。
通常使用的染色剂有荧光素、荧光素同工异构体、荧光素酯和荧光素类核酸探针等。
这些染色剂能够与细胞特定的分子结合，从而标记细胞并使其在流式细胞术中被检测到。
细胞计数细胞计数是流式细胞术的重要步骤之一。
在流式细胞术中，使用一种称为细胞计数器的设备，可以精确地计算细胞的数量。
细胞计数器通常由一个光源、一个流式细胞术仪和一个计算机组成。
在进行细胞计数时，将细胞悬浮液置于流式细胞术仪中，通过一束激光束照射细胞，从而产生荧光信号。
计算机会根据荧光信号的数量和强度来确定细胞的数量。
细胞分析在细胞计数后，可以对细胞进行分析。
流式细胞术中常用的分析方法包括细胞分类、细胞分选和细胞表面分析等。
细胞分类是将细胞根据其形态、大小和荧光特性分为不同的亚群。
细胞分选是将目标细胞从混合的细胞群中分离出来。
细胞表面分析是通过标记细胞表面分子，然后利用流式细胞术检测这些标记物，以确定细胞的特殊表面分子。
总结流式细胞术作为一种高效的细胞分析技术，已经广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
其基本原理是利用激光束对单个细胞进行分析，以确定细胞的特殊特性。
在进行流式细胞术前需要进行样品制备和细胞计数，然后可以对细胞进行分类、分选和表面分析等分析方法。
流式细胞术的应用范围广泛，可以用于癌症诊断、药物筛选和免疫学研究等领域。
【基础医学】第十七章 流式细胞术
第一节 基本原理
一、流式细胞仪的主要组件
1．液流系统 包括各种管道、压力调节 开关、液体流动室和超声振荡器喷嘴。单 个细胞悬液在狭窄的管道中流动，由于细 胞受流体力学的作用，极易形成贴边、堆 积,从而造成阻塞。为克服此种现象，利用 流体聚焦的原理，在不同的压力作用下使 鞘液〔通常用PBS〕和细胞悬液在喷嘴内 形成层流液束，通过细胞测量区。
〔2〕180g离心5min，小心吸出上清，然后 把沉淀的白细胞用细胞洗涤缓冲液洗两次， 80g离心5min。吸出上清，再把细胞悬浮在冷 的缓冲介质中备用。
〔二〕梯度-密度离心分离法 该方法可离出单个核细胞〔淋巴细胞和单
核细胞〕。 1．材料 淋巴细胞分离液；PBS缓冲液。
2．方法 〔1〕所用试剂预热到25℃以获得正确的密
二、组织
从新鲜组织制备单个细胞悬液，有的
比较容易，例如淋巴结组织用注射器反复 抽吸几次即可得到足够量的细胞；有的就 比较困难，常要用机械分散和酶消化相结 合的方法处理，如肝、睾丸用酶消化处理 很容易得到单个细胞。但睾丸生殖细胞胞 质之间桥接引起相邻细胞溶解，形成人为 的称为合胞体的多核假象。很难与DNA含 量和体积上相似的单个细胞区分开。神经 细胞的处理参见细胞培养。
〔3〕染色：离心10min去掉固定液，并再 悬浮细胞，加入ml染液，室温下染30min，上 机分析。
注意：使用激发波长457nm，发射波长约 大于515nm，使用515 Long Pass滤片。该方法 优点是不需RNA酶处理。
3．双间二氮茚〔Hoechst〕类染色法
Hoechst33258及Hoechst33342均为此类 染料，特异性与核酸的A-T键结合，但在的环境 条件下优先与RNA结合。测定DNA的染液配制， 需先以蒸馏水溶解后再以PBS稀释成1mmo1/L 的浓度，原液可在冰箱中避光保存，这种染液对 乙醇固定的细胞或死细胞可立即着色，对活细胞 需经20min左右才能达到饱和性着色。
流式细胞术基础知识
讲者：***
目录
1、流式细胞术基本定义 2、流式细胞仪介绍 3、荧光染料介绍 4、不同型号流式细胞仪简介 5、流式细胞仪应用
流式细胞术定义
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、 准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多 项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选
淋巴细胞亚群分析可以了解机体在不同条件下的免疫功能 状态，主要包括细胞免疫功能和体液免疫功能。在临床上，主要用 于对免疫系统造成明显干扰的相关疾病的辅助诊断，分析疾病的发 病机理，监控疾病的病程进展，观测疗效及监测预后等等。
流式细胞仪临床应用
临床意义 CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD8+ CD4+ / CD8+ B细胞 NK细胞
FITC, PE,ECD,PC5 or PECy5.5,PE-Cy7
APC, APC-Cy7
国食药监械(进)字 2014第2403463号
FITC, PE,ECD,PC5 or PC5.5,PC7
红光:638nm 紫光：405nm
APC，APC-Cy5 or APCAlexa Fluor 700, APC-Cy7 or APCAlexa Fluor
谢谢！
部分演示内容来源于网络，如有侵权，请联系删除！谢谢！
APC, APC-Cy7
浙械注准 20192220121
流式细胞仪应用
临床研究
血液，肿瘤， 药理，免疫…
环境研究
湖泊，海洋 生态研究…
生物学研究
遗传，生殖， 微生物，细胞 生物，毒理， 分子生物…
食品制药工业
食品检测、药物筛 选，疫苗研究…
流式细胞技术原理
流式细胞技术原理
流式细胞技术是一种高效的细胞分析方法，它可以对单个细胞进行快速、准确的分析。
该技术主要基于细胞在流动状态下通过激光束时所
产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，可以获得有
关细胞形态、大小、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
流式细胞技术基本原理如下：
1. 细胞样品制备：将待检测的细胞样品进行处理，如离心、洗涤等操作，使其达到单个细胞状态，并加入荧光染料或抗体等标记物，以便
在流式仪中进行检测。
2. 细胞在流式仪中流动：将制备好的样品注入到流式仪中，在高速液
体流动中被逐个单独地通过激光束。
3. 激光束照射：当细胞通过激光束时，会发生散射和荧光现象。
散射
现象包括前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），前者与细胞大小相关，后者与细胞复杂程度和内部结构相关。
荧光现象则是标记物受激发后
发出的荧光信号，可以用于检测细胞表面标记物或内部结构。
4. 信号检测：流式仪会收集细胞产生的散射和荧光信号，并将其转化
为电信号，通过光电倍增管等装置进行放大和转换。
同时，流式仪还
会记录细胞通过激光束的时间和位置信息。
5. 数据分析：通过对上述收集到的信息进行分析，可以得到有关样品
中细胞数量、大小、形态、表面标记物、内部结构和功能等方面的信息。
这些数据可以用于研究细胞生理学、病理学、药理学等领域。
总之，流式细胞技术利用了细胞在流动状态下产生的散射和荧光信号，通过对这些信号的测量和分析，实现了对单个细胞的快速、准确分析。
该技术在生命科学研究中有着广泛应用，在临床诊断、药物筛选等方
面也有着重要作用。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
流式细胞术简介及应用进展课件
流式细胞术简介及应用进展
15
▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其 它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
11
BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
12
BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
13
BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
14
三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
17
2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技 术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检 测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用 已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。 这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多 项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
FL1
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）；
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
临床免疫学：流式细胞术
荧光染料的选择
仪器所配置的激光光源的 波长，即荧光素的激发光 谱；
荧光素的发射光谱与检测 器的接收光谱；
染色细胞的抗原表达的相 对密度；
液相芯片技术（liquid chip tech，LP） 及原理
将流式检测技术和芯片技术 相结合，实现对可溶性物质 的分析；
以不同颜色的荧光微球作为 反应载体，将不同的生物探 针标记在微球上，将结合不 同探针的不同颜色的荧光微 球与被测标本反应，利用FCM 进行分析和定量。
✓ 流式微球阵列技术 （cytometric beads array, CBA）
阴性细胞上的Fc受体情况； 使用同一波长激发光的荧
光素时，其发射波长应不 相同；
荧光补偿
在做多色分析时纠 正荧光素发射光谱 重叠的过程，即从 一个被检测的荧光 信号中去除其他来 源的干扰信号。
荧光补偿调节
1、先将所有补偿和电压 调为“0”；
2、用同型对照或阴性对 照管调节电压使阴性群位 于“左下角”；
3、用单阳性管依次调节 相关通道荧光之间的补偿， 如FL1-%FL2， FL2-%FL1
阴性对照：未染色的待分析标本；
同型对照（抗体）：与荧光标记抗体相同 来源、相同标记、相同剂量、相同类、亚 类和型的未免疫的免疫球蛋白，用于消除 由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生 的背景染色。
阳性对照：
2. 淋巴细胞功能分析：CD25/CD69/CD71；胞内细胞 因子的检测
3.免疫系统疾病的诊断：免疫缺陷病；AIDS， CD4/CD8比值; 强直，HLA-B27;
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1、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度，FL2-H是指脉冲高度。
通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。
2、流式同型对照怎样选择？同型对照（Isotype Control）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
如果一抗是多抗，可以用an normal serum（与一抗相同的正常血清）（must be the same species as primary antibody）。
This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。
同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。
由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。
举个例子：比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a，所以可以用purified（纯化的）mouse IgG2a来做OX-42的同型对照（Isotype Control）。
一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。
同型对照：是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。
主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。
此外，同型对照与MoAb 所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。
3、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙.在文献及其他专业网站中都有测定游离钙的方法，具体如下：（1）钙荧光探针负载；（2）随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为F值。
（3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化钙，（问题所在），吹打均匀，孵育1~10min，测定荧光即Fmax值。
（4）加入EGTA，20μl（钙螯合剂），孵育1~10min，激发波长488nm测定荧光，即Fmin值。
这个过程中的氯化钙的作用如何，请高人指点，谢谢。
因为正常血浆中Ca2＋浓度是1mM，细胞外液的Ca2＋对细胞内Ca2＋有影响。
加0.1%triton 是增加膜通透性，使细胞外Ca2＋进入细胞内，作为最大值。
加EGTA是为了螯合Ca2＋，作为最小值.生理环境中细胞内钙离子浓度远低于细胞外液（大约1：10000），细胞膜对钙的通透性变化对细胞内钙影响很大。
4、流式与werstern的区别，知道一些，不足之处请大家补充：（1）Western 是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白，虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白，但对于分泌蛋白却是无能为力的；（2）Western测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般1：1000左右，而流式对抗体的需要量很大，一般1：50（很浪费抗体）；（3）采用Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参，而流式一般要把每个样品分为两份，同时都做只加二抗（FITC标记的）的对照，这样平均到每个细胞的发光就不用内参了；（4）就个人经验而言，流式用多抗不好，单抗标出来不错。
不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用western（尤其是化学发光底物更佳）和免疫组化更好。
当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比），如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。
5、FL1，FL2，FL3 的区别是什么? 是指在不同位置测得的荧光?还是不同波长的荧光?这3个参数到底测的是什么?有什么意义?你的理解是正确的，其实FL1，FL2，FL3 是指不同的荧光通道.举个例子来说吧.我们用FITC/PE双标记的细胞，在488nm的激光激发下，这两种荧光染料分别发出波长不同的绿色和橙色荧光，然后这发出的荧光再通过滤光片分开，对应的是不同的波长的滤光片，一般在fl1那的是530nm的滤光片，在FL2那的是575nm的滤光片，这样就可以把在一起的荧光分开了。
6、用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式细胞术？看你说明书上是怎么说的了，如果没有说就不可以做流式，需要另外买了。
7、MFI和GFI的意义？Geo Mean，叫做几何均数（geometric mean），常用于等级资料和对数正态分布资料，和常用的算数均数（mean）的计算方法不同。
“ %total或者%gate的结果”代表的是百分率，即细胞占总体细胞或者是门内细胞的百分比；用百分比作为统计指标，适用于荧光表达较强的指标。
我看到你的流式图上，检测样本的荧光强度不是很强，属于弱表达的指标，若用百分率统计，就是会失去一部分弱阳性的数据。
我建议可以用平均荧光强度（也就是mean值）作为统计指标，比较荧光强度的变化。
8、流式技术中的APC，pure 标记是什么意思呢?荧光物质通常是指那些在受到一个波长激发后，处于一个能量不稳定的状态，能发射一个波长比激发波长长的光的一类物质。
当然荧光并不都是受激发后发射的，如一些生物可以发射荧光，如荧火虫，发光细菌等，他们发出的光是通过体内的酶促反应而产生的，这个酶通常被称为荧光素酶.EB是一种荧光物质，它在受到紫外线照射后可以发出一可见光，常用于DNA、RNA电泳中。
APC英文全名：allophycocyanin；中文名：别藻青蛋白；最大吸收峰：650nm，最大发射荧光峰：660nm，适用于双激光流式仪，可被600-640nm波长的激光激发。
PerCP英文全名：peridinin chlorophyll protein，中文名：多甲藻叶绿素蛋白；最大激发波峰490nm，被488nm的氩离子激光激发后，发射光峰值约为677nm，与FITC、PE进行多色荧光染色补偿重叠较少，非特异性结合也较少。
虽然较易使用，但量子产量不高，多用于检测表达较高的抗原。
9、怎样用流式细胞仪来鉴定小鼠BMDC？检测小鼠BMDC主要是从形态学和细胞表面分子两方面来鉴定我做的时候就做了普通光镜下形态、电镜（扫描和透射），另外检测了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86 、CD11、CD80。
还做了MHC II类分子的检测，还有MHCI类分子的检测，这些分子在DC表面都不是特异存在的，在巨噬细胞、淋巴细胞表面也有表达，所以目前并没有非常特异性的方法检测你的细胞一定就是DC，但是从形态和表面分子的检测结合来看，效果就比较好了.一般在幼稚的DC上述分子表达水平较低，DC成熟过程中，上述分子表达呈上调趋势，你可以在不同的培养时间分别检测。
10、请问流式细胞术单抗直接荧光需要几种对照？首先确认你用的直标抗体的荧光染料是什么，再确定该抗体的来源种属，选择相应的同型对照。
如：你现在想检测小鼠淋巴细胞表面的CD4抗原，荧光染料为FITC，抗体来源为大鼠的IgG1亚型，即Rat anti Mouse CD4-FITC （IgG1），你所需要的同型对照就应该是Rat IgG1-FITC，一般的抗体说明上都会写清。
11、6孔板的细胞量能否做流式呀？对于6孔板而言，每孔的表面积为10 cm2，依细胞种类不同在长满时达到的数量从5*10的5次方到5*10的6次方不等。
6孔板绝对没问题的！甚至24孔板也可以正常做。
不过用于调试仪器参数的正常细胞要多准备一些。
12、血液里的mononuclear cell（除外红细胞，血小板和破碎的细胞碎片），能不能用细胞大小来gating，只看我关心的细胞？（1）红细胞还是小一些，无法100%区分，但还是可用把大部分红细胞gate掉。
（2）溶血也很重要，如果你的红细胞多的话。
（我猜不少，如果用ficol的话）。
可以用氯化铵溶液，如ACK（Lonzo），（3）CD45是所有白细胞都表达的，可以用来区分RBC vs. WBC13、细胞膜蛋白变化是用流氏检测好，还是要做western?膜蛋白的提取，好像很费功夫，提取的不好，western结果也就不可信。
流式需要的抗体很少，流式能够检测阳性表达细胞的比例，western能对总的表达定量，各有有缺点。
14、FCM检测表达结果到底是用百分比还是MFI。
我作出是单峰，原本我觉得用MFI表示较好。
但我做的2个蛋白很奇怪，一个表达率高，但MFI值低；另一个表达率低，但MFI 值高。
我又作了SYBR GREEN 定量PCR，发现mRNA 的表达基本与百分比相符，而与MFI 值不太一致。
个人认为如果有明显阴性细胞群和阳性细胞群，应计算百分比；无明显分群，仅荧光强度发生变化的应该用MFI。
如果是整体峰移（或者叫单峰），那么根本不存在MFI之外的任何合理的指标，不管MFI跟其它指标吻合度如何，这就是客观数据、客观事实。
15、培养细胞的bcl-2及Bax蛋白的检测？首先制成单细胞悬液，PBS洗涤后用胞内染色试剂盒（很多公司都有，其实就是固定剂加增透/打孔剂）进行处理，再进行抗体孵育标记染色，洗涤后上样。
16、流式检测胞内抗原时打孔液的配方？打孔液有很多种，方法也有很多。
与你的实验方法相关。
我用过酒精固定或Triton X-100（我做的都是培养的细胞）：（1）70%的酒精固定24小时即可，不再需要再打孔。
如在PI染色测细胞周期或凋亡。
（2）Triton X-100是比较强烈的穿孔剂。
0.1% Triton X-100/PBS（再加0.1%BSA）是比较温和一点。
浓度可适当提高。
作用时间以几分钟为宜。
这个时间必须要自己试。
时间长了细胞易破裂，短了则打孔不够。
如果你要染胞浆，则时间适当短些，如果要染内质网或核内等，由于要对两层膜性结构打孔，时间当然会长一些（3）可以试试0.1% saponin（皂素）17、标本必须在抗体染色后30分内检测吗？SOP是这么说的：（1）Keep samples after staining covered with aluminum foil and at 4 0C （in the refrigerator）until they are run for flow analysis. The samples should be analyzed within 48 hours. Fluorescence loses its brightness if cells are not kept properly：not at 4 0C，or are exposed to light（2）If cells are not fixed with paraformaldehyde，keep the samples on ice and run them immediately after staining is accomplished因此，如果你没有用PBS洗的话，可以用paraformaldehyde固定，放置48小时。