第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定

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蛋白质修饰鉴定

蛋白质修饰鉴定

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蛋白质修饰鉴定
蛋白质修饰及蛋白质翻译后修饰,指蛋白质在翻译中或翻译后经历的一个共价加工过程,在该过程中,蛋白质的1个或几个氨基酸残基可以共价结合不同的修饰基团而改变原来蛋白质的性质和功能。

目前已发现300多种不同的翻译后修饰,主要形式包括磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化、泛素化、羟基化、核糖基化和二硫键的配对等。

蛋白质翻译后修饰对维持机体正常生命活动具有重要作用,调节着蛋白质的活性状态、定位、折叠以及蛋白质与蛋白质之间的交互作用等。

蛋白质翻译后修饰鉴定就是对修饰类型、位点以及修饰水平进行鉴定,其分析鉴定难度远高于蛋白质的鉴定,主要是因为发生翻译后修饰的蛋白质样本量相对较少、发生修饰时形成的共价键很不稳定且处于动态变化中、修饰与未修饰的或多种修饰形式的蛋白质常混合存在。

目前,翻译后修饰蛋白质的分析主要是利用现有的蛋白质组学技术体系,包括电泳、色谱、生物质谱以及生物信息学工具等。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台结合Nano-LC色谱,提供快速高效的蛋白质翻译后修饰鉴定服务技术包裹,您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的样品寄给我们,我们会负责项目后续所有事宜,包括蛋白提取、蛋白酶切、修饰肽段富集、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析,欢迎免费咨询。

第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定

第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定

04
抗体法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用
抗体法原理及技术流程
原理
抗体法利用特异性抗体与蛋白质翻译 后修饰位点结合的原理,通过免疫学 方法进行检测和鉴定。
技术流程
包括抗原制备、抗体生产、抗体纯化 和特异性验证等步骤。
抗体法鉴定蛋白质翻译后修饰的优势与局限性
优势
高特异性、高灵敏度、可定量分析等。
局限性
化学方法
质谱分析
通过质谱技术检测蛋白质分子的质量和化学 性质,从而鉴定蛋白质的翻译后修饰类型和 位点。
荧光标记
利用荧光标记技术标记特定的修饰位点,通过荧光 信号的强度和分布来鉴定蛋白质的翻译后修饰。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在芯片表面,利用特定的抗体 或配体检测蛋白质的翻译后修饰类型和位点 。
实例分析
第六章蛋白质翻译后 修饰的鉴定
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目录
• 蛋白质翻译后修饰概述 • 蛋白质翻译后修饰的鉴定方法 • 质谱法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用 • 抗体法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用 • 其他方法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应
用 • 蛋白质翻译后修饰鉴定的挑战与未来发展
01
蛋白质翻译后修饰概述
数据准备
收集已知的蛋白质乙酰化修饰位点数据,包括蛋白质序列、修饰位点 的位置和化学性质等。
特征提取
从蛋白质序列中提取与乙酰化修饰相关的特征,如氨基酸组成、序列 模体、结构域等。
模型训练
利用机器学习或深度学习算法,如支持向量机、神经网络等,训练预 测模型。
预测与验证
将新的蛋白质序列输入到训练好的模型中,预测潜在的乙酰化修饰位 点,并通过实验验证预测结果的准确性。
其他方法
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蛋白质翻译后修饰

蛋白质翻译后修饰

细胞应激反应
在应激条件下,如氧化应激和DNA损伤, 蛋白质翻译后修饰可以调控应激反应相关蛋 白的活性和功能,从而影响细胞的生存和凋
亡。
THANK YOU
泛素化作用
泛素化可以影响靶蛋白的稳定性、定位、活性以及与其他蛋白质的相互作用,从 而调控细胞内的多种生物学过程,如细胞周期、信号转导和自噬等。
泛素化可以标记受损或不需要的蛋白质,引导其被蛋白酶体降解,从而维持细胞 内蛋白质的平衡。
泛素化调控
泛素化过程受到严格的调控,涉及多种酶的协同作用。这些酶包括E1(泛素活化酶)、 E2(泛素结合酶)和E3(泛素连接酶)。
E3酶在泛素化过程中起着关键作用,它能够识别并结合特定的靶蛋白,将泛素分子准 确地连接到靶蛋白上。
此外,去泛素化酶能够逆转泛素化过程,去除已经结合在靶蛋白上的泛素分子,从而对 泛素化进行动态调控。
05
其他翻译后修饰
乙酰化
总结词
乙酰化是一种常见的蛋白质翻译后修饰,通过将乙酰基团连接到蛋白质的特定氨基酸残基上,可以调节蛋白质的 活性和功能。
翻译后修饰可以影响蛋白质的稳定性 ,通过增加或减少蛋白质的降解速率 ,从而影响细胞内蛋白质的水平和功 能。
蛋白质降解
某些翻译后修饰,如泛素化,可以标 记蛋白质进行降解,通过蛋白酶体途 径降解蛋白质,维持细胞内蛋白质的 动态平衡。
蛋白质功能调控
酶活性调节
亚细胞定位
许多蛋白质在翻译后被修饰以改变其酶活性, 例如,磷酸化可以激活或抑制酶的活性,从 而调控代谢过程和信号转导。
03
疾病与磷酸化
许多人类疾病与蛋白质磷酸化的异常有关。例如,一些癌症和神经退行
性疾病的发生与特定蛋白质的异常磷酸化有关。因此,对蛋白质磷酸化

蛋白质翻译后修饰与加工

蛋白质翻译后修饰与加工

VS
信号转导
在信号转导过程中,蛋白质的翻译后修饰 可以影响蛋白质与其他信号分子或受体的 结合,从而调控信号转导通路的激活或抑 制。
蛋白质构象变化
构象变化
某些蛋白质在翻译后经过特定的化学修饰, 如磷酸化、乙酰化等,这些修饰可以改变蛋 白质的构象,从而影响蛋白质的功能。
结构域运动
蛋白质的结构域之间可以发生相对运动,这 种运动可以影响蛋白质与其他分子的结合或 构象变化,从而调控蛋白质的功能。
糖基化
总结词
糖基化是一种在蛋白质翻译后发生的修饰,通过将糖链连接到蛋白质的特定氨基酸残基上,影响蛋白质的结构和 功能。
详细描述
糖基化分为两种类型:N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化发生在新生蛋白的N-端,而O-糖基化发生在丝氨酸或苏 氨酸残基上。糖基化可以影响蛋白质的稳定性、分泌和细胞间的相互作用,参与多种生物学过程,如细胞识别、 信号转导和免疫应答等。溶酶体途径Fra bibliotek溶酶体
是一种细胞器,内部含有多种水解酶,能够分解各种生物大分子。
溶酶体途径
是指通过溶酶体降解细胞内物质的过程。
04
蛋白质定位与转运
核定位信号
01
02
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04
核定位信号(NLS)
是一种特殊的氨基酸序列,能 够引导蛋白质进入细胞核。
核输出信号(NES)
存在于某些蛋白质中,能够将 蛋白质从细胞核输出到细胞质 。
酶的激活
某些蛋白质在翻译后经过特定的化学 修饰,如磷酸化、乙酰化或甲基化等, 这些修饰可以改变酶的构象或电荷分 布,从而激活酶的活性。
酶的失活
某些蛋白质经过特定的化学修饰后, 如泛素化或糖基化等,会导致酶的活 性降低或完全失活,从而调控蛋白质 的降解或功能。

蛋白质翻译和翻译后修饰的研究

蛋白质翻译和翻译后修饰的研究

蛋白质翻译和翻译后修饰的研究生物学中一个重要的领域是蛋白质翻译(protein translation)和翻译后修饰(post-translational modifications)的研究。

蛋白质是生物体内最重要的宏分子,它们在细胞内扮演着关键的功能和代谢角色。

因此,蛋白质翻译和修饰的过程非常复杂和精细,需要多个分子参与和精确协调。

本文将介绍一些最新的蛋白质翻译和修饰方面的研究进展。

1. 蛋白质翻译的基本过程蛋白质翻译是指从DNA模板转录出来的mRNA通过核糖体(ribosome)上的tRNA和氨基酸的匹配,合成具有特定氨基酸序列的蛋白质的过程。

这个过程分为三个主要的步骤:启动(initiation)、延伸(elongation)和终止(termination)。

在翻译的过程中,参与的分子有mRNA、核糖体、tRNA、氨基酸、同工酶(synthetase)、转录因子和辅因子。

最近的研究表明,这个过程包含很多的调控机制。

例如,启动因子eIF4F可以增加mRNA对核糖体的结合,从而促进翻译的开始。

而RNA结合蛋白eIF4B和eIF3则可以减慢或抑制翻译的速度。

此外,tRNA的修饰也可以影响翻译的精度和效率。

这些发现表明,蛋白质翻译不再是一个被动的过程,而是受到多种因素的调节和控制。

2. 翻译后修饰的多样性蛋白质合成完毕后,通常需要进一步的翻译后修饰,包括磷酸化、甲基化、丙酮化、酰化、酰胺化、硫醇化和二硫键形成。

这些修饰可以影响蛋白质的稳定性、活性、定位和相互作用性。

最近的研究发现,不同的修饰方式可以形成不同的修饰模式。

例如,在血管生成和肿瘤转移中,TNFα诱导的几种修饰模式(磷酸化、泛素化、SUMO化)共同参与了细胞内信号传导和基质蛋白的降解。

另外,细胞内内源性和外源性分子也可以参与修饰过程。

例如,在肝胰素调节和炎性应答中,白细胞介素-6通过抑制修饰酶PP2A的磷酸化来调控炎性基因的表达。

3. 研究的应用前景随着高通量测序和蛋白质组学技术的发展,我们可以对蛋白质合成和修饰的网络进行全面、系统的分析。

蛋白翻译后修饰

蛋白翻译后修饰

凋亡,从而最终发展成为癌细胞 .
2.5 磷酸化
DNA新陈代谢的研究中:细胞中DNA损伤可导致人的复制蛋 白 A(RPA)32 kD 亚基 N 端的过度磷酸化, 这有助于调控 DNA 的新陈代谢, 促进DNA 修复. 有数据显示, 过度磷酸化会 导致 RPA 构象改变 , 降低 DNA 复制的活性 , 但不会影响
泛素-蛋白酶系统是存在于所有真核生物细胞的调控
系统。降解过程中需要三种酶的参与: 泛素激活酶(E1)、
泛素结合酶(E2)和泛素蛋白质连接酶(E3)。泛素化降解
蛋白的过程中对蛋白的特异性识别依赖 E3. 由 E2s 和 E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶(DUBs)逆转.。
2.4 泛素化
目前发现的 DUBs 可分为两大类 : 泛素碳端水解酶 (ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)和泛素特异性
DNA 的修复。
2.6 SUMO 化
SUMO为小泛素相关修饰物 (small ubiquitin- related modifier,SUMO)分子,是一种近年发现的泛素样分子,也参与 蛋白质翻译后修饰,但是不介导靶蛋白的蛋白酶体降解, 而 是可逆性修饰靶蛋白,参与靶蛋白的定位及功能调节过程。
3 研究方法及关键技术
蛋白酶 (ubiquitin-spicific processing proteases,
UBPs) ,两者都是半胱氨酸水解酶。泛素化降解蛋白 的过程中对蛋白的特异性识别依赖E3. 由E2s 和E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶 (DUBs)逆转通常 情况下, UCHs 主要水解羰基端的酯和泛素的氨基键,
2.3 糖基化
发生在高尔基体上:起始于丝氨酸和苏氨酸羟基 上连接N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖及

翻译后修饰和蛋白质表达这篇文章将介绍翻译后修饰对蛋白质表达的影响包括如何改变蛋白质功能

翻译后修饰和蛋白质表达这篇文章将介绍翻译后修饰对蛋白质表达的影响包括如何改变蛋白质功能

翻译后修饰和蛋白质表达这篇文章将介绍翻译后修饰对蛋白质表达的影响包括如何改变蛋白质功能翻译后修饰和蛋白质表达蛋白质是生物体内最基本的分子之一,扮演着许多生命活动中重要角色。

蛋白质表达是指蛋白质合成和功能的产生过程,而翻译后修饰则在蛋白质合成后对其进行改变,进一步调节其功能和稳定性。

本文将介绍翻译后修饰对蛋白质表达的影响,以及如何改变蛋白质功能。

一、翻译后修饰对蛋白质表达的影响1. 磷酸化修饰磷酸化是最常见的翻译后修饰方式之一,通过在蛋白质上添加磷酸基团来改变其结构和功能。

磷酸化修饰可以调节蛋白质的活性、稳定性以及与其他分子的相互作用。

磷酸化修饰还参与细胞信号传导、细胞周期调控等生物学过程。

2. 甲基化修饰甲基化修饰是通过在蛋白质上添加甲基基团来改变其功能。

甲基化修饰在染色质结构的调控中扮演重要角色,可以影响基因的转录和表达。

甲基化修饰还参与细胞分化、胚胎发育以及人类疾病的发生发展等过程。

3. 乙酰化修饰乙酰化修饰是指通过在蛋白质上添加乙酰基团来改变其功能。

乙酰化修饰可以调节蛋白质的稳定性、亲和力和活性。

乙酰化修饰还参与细胞代谢、基因转录调控以及细胞衰老等生命过程。

4. 糖基化修饰糖基化修饰是在蛋白质上附加糖分子来改变其功能。

糖基化修饰可以影响蛋白质的稳定性、折叠和识别。

糖基化修饰还参与细胞黏附、免疫应答以及疾病的发生发展等过程。

二、翻译后修饰如何改变蛋白质功能1. 调节蛋白质活性翻译后修饰可以通过改变蛋白质的结构和环境来调节其活性。

例如,磷酸化修饰可以激活或抑制蛋白质的酶活性。

2. 调控蛋白质-蛋白质相互作用翻译后修饰可以改变蛋白质与其他分子之间的相互作用。

例如,乙酰化修饰可以增强蛋白质与DNA之间的亲和力,从而影响转录调控。

3. 调整蛋白质稳定性翻译后修饰可以影响蛋白质的稳定性。

例如,甲基化修饰可以增强蛋白质的稳定性,延长其寿命。

4. 蛋白质定位和转运翻译后修饰可以调整蛋白质在细胞内的定位和转运。

蛋白质的翻译和翻译后修饰

蛋白质的翻译和翻译后修饰

蛋白质的翻译和翻译后修饰生命是由许许多多的分子组成的,而蛋白质是其中最为重要的一种。

蛋白质是由一串氨基酸组成的长链,这一长链需要经过翻译才能够转化为具有生物学功能的分子。

蛋白质的翻译和翻译后修饰是生命过程中最为重要的一环。

一、蛋白质的翻译大多数蛋白质翻译是在细胞的核内进行的,当DNA信息需要被转录成RNA信息时,核糖核酸(RNA)由RNA聚合酶开始合成。

生物体内细胞所合成的蛋白质大多是由核内DNA转录所得到的信息指令,它们之间的转化是通过RNA来实现的。

RNA只能单链存在,而DNA是双链的,因此DNA需要转录为RNA。

RNA与DNA之间的差别在于它们的碱基和糖分子不同,RNA的糖分子是核糖糖,而DNA的糖分子是脱氧核糖糖。

RNA分为mRNA、tRNA、rRNA三种类型。

其中,mRNA是单链的,又称为信使RNA,它携带着从DNA中转录来的信息,将这些信息传递到细胞质中的核糖体。

tRNA是转运RNA,它具有一定的三维结构,能够识别对应的氨基酸并将其运输到正在合成蛋白质的核糖体处。

rRNA是核糖体RNA,是组成核糖体的重要组成部分。

mRNA的翻译是通过核糖体完成的。

核糖体是由rRNA和蛋白质组成的复合物,每个核糖体可以同时合成一条蛋白质链。

当mRNA被核糖体识别后,它将被解码以便识别并对应一个氨基酸,这一过程是由tRNA完成的。

tRNA上有一个“反密码子”,它与mRNA相对应的“密码子”匹配,从而指示该tRNA上的氨基酸在蛋白质链的什么位置插入。

每次合成一个氨基酸后,核糖体会相对移动一个密码子,并等待下一个tRNA的到来。

这样反复进行直到整个蛋白质链合成完成。

在蛋白质链合成的过程中,核糖体会自动将一条完整的蛋白质链连在一起。

经过长时间的重复,整个蛋白质链就被合成出来了。

二、蛋白质翻译后修饰在蛋白质合成完成后,蛋白质还需要一些修饰才能够发挥其生物学功能。

蛋白质的修饰分为多种类型,包括切割、糖基化、磷酸化、酰化等,都是通过进一步地化学反应来修改已合成的蛋白质分子结构。

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二、磷酸化蛋白质分析的概述
双相磷酸多肽谱图 2D—PP
多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相,在同一 块板上进行薄层色谱(TCL)为第二相,分离得到的 磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测
此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷 酸化状态的重要信息
(1)磷酸化位点的最大数目 (2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸
第六章 蛋白质翻译后修饰的鉴定
蛋白质翻译后修饰
蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的 作用,它使蛋白质的结构更为复杂,功能更为 完善,调节更为精细,作用更为专一 N-端fMet或Met的切除 二硫键的形成 化学修饰 剪切
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫 应答和应激反应等生理过程起着重要作用
方法
反相液相色谱(PR-HPLC) 免疫沉淀 固相金属亲和色谱 金属氧化物/氢氧化物亲和色谱 离子交换和等电聚焦
免疫沉淀
原理
当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞 内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用 被保留了下来
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X 在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来
样品制备(细胞、组织、体液提取蛋白质)
制备型2D胶电泳
分析型2D胶电泳
考马斯亮蓝染色
转印到膜
磷酸氨基酸抗体免疫检测—得到磷酸化蛋白质
图谱比较
找出相应的磷酸化蛋白质
染色—得到全部蛋白质点
磷酸化蛋白质鉴定
四、蛋白质磷酸化位点的分析
1、磷酸肽的分离和富集
分离浓缩分析物,提高信噪比 如果磷酸肽被放射性标记,并具有相同的比活度,那
和谷氨酸的酰化 丝氨酸磷酸化:苏氨酸磷酸化:酪氨酸磷酸化
=1800:200:1
被磷酸化修饰的蛋白
改变所带的电荷 改变催化基团的性质 改变蛋白质的构象 改变蛋白质的亚细胞分步 蛋白质功能变化的多样性
蛋白质磷酸化研究有三个主要目的
(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白 质在体内的磷酸化氨基酸残基定位
一、生物体内的蛋白质磷酸化修饰及其功能
蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团 从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生 物体内存在的一种普遍的调节方式,在细胞信号的 传递过程中占有极其重要的地位
蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移 到底物蛋白质氨基酸残基上的过程
蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用
(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶 (3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋 白质组学研究的关键技术之一
细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的 表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部 分的分析也很困难, 一般一个发生磷酸化的蛋白 质其磷酸化的部分仅占其总量的10%
么每一个被分离的肽段相应的活度计数就表明这一组 分中磷酸肽的相对量,如果已知所用放射性标记物的 比活,就能容易算出磷酸肽的绝对量 放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同 时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态的变化 肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质,更有利检测 和分析低丰度磷酸肽
1、磷酸肽的分离和富集
磷酸化蛋白质含量少,化学计量值低,磷酸化的肽段 很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸氨基酸 分析
体外 pmol 32p蛋白标记
蛋白质分离 蛋白酶切 2DPP作图
体内 fmol 32p细胞标记
相关分析
蛋白酶切 2DPP作图
μHPLC
μLC-ESI-MS或 MALDI-MS
化的相对化学计量 (3)电泳和TCL的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性
的相对状态
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式 的质谱分析中信号受到抑制,在MALDI源的质 谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化 肽段的信号强度要低很多
磷酰键较肽键容易断裂,使磷酸化蛋白比非磷 酸化蛋白鉴定要困难的多
在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点 胞内信使,cAMP,Ca2+,DG(二酰甘油)
蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的 酶“活性”
对外界信号具有级联放大作用 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信
号的持续反应
磷酸化类型
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化 精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化,天冬氨酸
已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗 体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好,磷酸化丝 氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有 空间障碍,所以抗体的结合力较差
免疫印迹法与免疫沉淀相结合,可以在电泳之前先富集 目的蛋白质,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋 白质,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高,抗磷酸酪氨 酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验
磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收 缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过 程
糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的 复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作 用
脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常 关键的作用
组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关
第一节 蛋白质翻译后修饰的鉴定
局限性
磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质 不能标记组织样本 放射性污染
2、抗体免疫印迹检测法
通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反 应(Western blotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用 的方法
在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨 酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化
三、磷酸化蛋白质的检测
32P放射性标记法 抗体免疫2 P 放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测 方法
放射性32P标记的ATP处理细胞,使32P掺入磷酸化 蛋白质
培养待标记的细胞至适当的生长期,在生长旺盛的 细胞中磷酸盐的转运达到最高峰,用不含磷酸盐的 标记培养液替换原来的细胞培养液,并加入32P标 记磷酸盐共培养,使细胞ATP库与32P平衡,蛋白激 酶利用被放射标记的ATP使底物磷酸化
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