基因工程实验设计
如何设计有效的基因工程实验方案
如何设计有效的基因工程实验方案设计有效的基因工程实验方案在生物技术领域起着关键作用。
本文将从选择合适的研究目标、确定实验所需材料和方法，以及数据分析与解释等方面介绍如何设计有效的基因工程实验方案。
首先，选择合适的研究目标是设计有效实验方案的首要任务。
研究目标应该具有一定的科学意义和实用价值，同时，应确保该目标在现有技术条件下可以实现。
确定一个明确而具体的研究问题，有助于确定设计实验所需的基因工程工具和方法。
其次，确定实验所需材料和方法是进行有效实验的关键步骤。
基因工程实验所需的材料主要包括目标基因、载体、宿主细胞和筛选标记。
目标基因应具有和研究目标相关的功能，载体应具有合适的复制起源和选择性标记，宿主细胞应具有高效的转化效率和适合的生长条件。
在选择筛选标记时，需要考虑与目标基因不相互干扰且能够可靠辨识的特性。
在方法选择方面，常用的基因工程技术包括PCR扩增、限制性核酸内切酶消化、DNA连接、电转化和化学转化等。
根据实验目标和条件，选择合适的方法对于实验的成功与否至关重要。
在进行基因编辑方面，CRISPR-Cas9系统已成为最常用的方法之一。
然而，不同的技术会存在一些优缺点，设计实验方案时需评估并选择合适的技术组合。
另外，在进行实验之前，需要充分了解实验步骤和操作要求。
实验步骤应尽可能详细，以保证实验的再现性和可靠性。
同时，确保实验操作符合生物安全规范，减少实验风险和致误的可能性。
实验方案的设计也需要考虑数据分析与解释。
有效的数据分析可以为研究结果提供科学依据，并帮助解释实验结果。
在设计实验方案时，应考虑如何收集、处理和分析实验数据。
例如，基因表达水平的分析可以通过定量PCR、Western Blot和荧光素酶报告基因等方法进行。
正确选择合适的实验设计和数据分析方法，将有助于得出可靠且有解释力的研究结论。
最后，实验方案的设计也需要考虑时间和资源的限制。
在实验设计过程中，必须合理规划每个实验步骤的时间，并评估所需材料和设备的成本与可获得性。
基因工程实验-biochemlab
实验二 基因组总ＤＮＡ提取
一、实验目的
掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。
生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。
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五、思考题
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如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？
01
实验目的
02
掌握重组质粒的转化方法
03
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实验六 重组质粒的转化
转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。
化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。
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ＤＮＡ重组、转化 ＭＨＣ与pMD18-T连接 DH5a感受态细胞制备
转化、平板涂布、培养
筛选与鉴定 抗生素抗性筛选 挑单菌落培养 提取质粒 质粒酶切、电泳检测
2.微量移液器的使用
将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头
基因工程试验设计
基因工程试验设计基因工程是指通过基因操作技术对生物体的遗传信息进行改造和调控的一种技术手段。
在基因工程中，通过对目标生物体的基因进行剪接、插入、删除等操作，可以实现对生物体性状的改变和遗传特征的调控。
基因工程技术在医学、农业、环境保护等领域具有广阔的应用前景。
1.实验目的：明确实验的目的和预期结果，例如改变生物体的特定性状、提高生物体的产量或抗病性等。
2.选择目标生物体：根据实验目的选择适合的目标生物体，可以是细菌、真菌、植物、动物等。
3.确定基因操作的方式：基因工程技术有多种操作方式，如基因剪接、基因插入、基因删除等。
根据实验目的和目标生物体的特点选择合适的操作方式。
5.确定基因传递方式：确定基因将如何传递到目标生物体中，可以采用转染、转化、转基因等方式。
6.制备实验材料：根据实验设计制备所需的实验材料，包括目标生物体的培养基、基因操作所需的酶、载体等。
7.设计对照组和实验组：根据实验目的设计对照组和实验组，对照组不进行基因操作，实验组进行基因操作。
8.确定实验条件和时间：确定实验的条件和时间，包括温度、湿度、光照等条件，以及实验的持续时间。
9.设计实验步骤：根据实验目的和操作方式设计实验步骤，包括基因操作、培养、鉴定等。
10.实验数据的分析和解读：根据实验结果进行数据分析和解读，判断实验是否成功，预测实验结果对生物体的影响。
基因工程试验设计需要综合考虑实验的科学性、技术可行性和安全性等因素。
在设计过程中，需要进行充分的文献调研和数据分析，确保实验的有效性和可靠性。
同时，也需要遵循伦理规范和相关法律法规，保证生物安全和环境保护。
总之，基因工程试验设计是对基因工程技术进行验证和探索的重要过程。
通过合理的设计和操作，可以实现对生物体的遗传信息进行改造和调控，为生物科学研究和实践应用提供重要支持。
设计实验三、基因工程方法表达蛋白药物
设计实验三、基因工程方法表达蛋白药物设计实验三、基因工程方法表达蛋白药物实验目的：利用大肠杆菌、酵母或动物细胞表达体系表达一种蛋白药物或蛋白因子，发酵培养后进行提取。
通过本实验，让同学们深刻理解基因工程药物的生产程序及其中的注意事项。
实验体系：根据实际情况，确定一种或几种蛋白类药物，由实验老师提供已构建好的表达体系，有条件的单位可以让同学自己制备表达体系。
需要同学解决的关键问题：1、了解所表达蛋白的功能及其在实际应用过程中的优缺点。
2、充分查阅资料，了解所用表达体系的来源及优缺点。
3、分析发酵过程中的注意事项。
4、了解所表达蛋白的稳定性及现有的先进工艺，综合分析后确定提取工艺。
5、综合评定所表达体系的优缺点，提出可能的改进路线及方案。
举例说明：大肠杆菌表达干扰素的工艺具体步骤：1、查阅文献，了解干扰素的来源、种类、性质、应用以及干扰素的研究进展。
了解目前准备发酵生产的干扰素的研究状况及可能的改进方法。
2、使用已经构建好的表达体系进行实验，首先要了解所使用表达体系的构建过程，所使用的表达质粒及菌株的特性。
（有条件的实验室可以让同学独立构建干扰素表达体系）3、查阅该表达体系使用的发酵条件。
4、了解基因工程菌株发酵过程中的注意事项。
5、进行实验分析溶氧、pH、温度、培养成分对于表达蛋白产量的影响。
6、优化条件后进行进行培养发酵。
7、确定提取、纯化干扰素的工艺路线。
总结在提取过程中的注意事项：如需要加入巯基乙醇对于二硫键进行保护，加入苯甲基磺酰氟（PMSF）来抑制蛋白酶的活力。
同时也要考虑比如说使用哪种絮凝剂等具体问题。
8、集体讨论文献中的提取方法有优缺点，从理论上讲是否有可以改进的地方。
9、发酵后提取干扰素，然后进一步分析提取效率。
10、同样，需要调研是否有新开发的提取方法用于蛋白药物的提取，是否有可能在本实验中使用。
11、提出目前使用的生产工艺的优缺点，结合文献，提出合理的、可能实施的改进方案。
参考文献：李元主编，基因工程药物，2002年，化学工业出版社马清钧主编，生物技术药物，2002年，化学工业出版社李校坤（名简写），袁辉主编，2003年，暨南大学出版社。
基因工程实验报告
基因工程实验报告引言基因工程是现代生物技术的一个重要分支，通过对生物体基因的修改和重组，可以创造出具有特定功能的生物体。
本次实验旨在探究基因工程在农业、医学等领域的应用，以及可能带来的潜在风险和争议。
实验方法1. 筛选目标基因：首先，我们在实验中选择了对叶绿体功能有重要影响的一个基因作为目标基因。
2. 基因克隆：通过PCR技术，将目标基因从细菌DNA中放大，然后将其插入载体DNA中。
3. 转化目标生物体：将重组的载体DNA转入植物叶片细胞中，借助几丁质体、热激冲击等方法促使基因转化成功。
4. 筛选阳性转化率：通过筛选培养基中的抗性选择制剂，筛选出转化成功的阳性细胞。
5. 验证目标基因的表达：通过PCR扩增和基因芯片技术验证目标基因在转化植物中的表达情况。
实验结果1. 实验结果显示：我们成功将目标基因插入到植物叶片细胞的染色体中，并且获得了一定比率的阳性转化植株。
2. 鉴定转化植株：对转化植株进行证实鉴定，确保目标基因已经整合到植株基因组中，且稳定表达。
3. 表达验证：通过PCR扩增和基因芯片分析，确定目标基因在转化植物中得到了表达，并且表达量较高。
4. 性状鉴定：对转化植物进行生长发育、形态结构、生理生化等方面的综合性状鉴定，结果显示转化植物与野生型无显著差异。
讨论基因工程技术的应用：本次实验展示了基因工程技术在农业生产中的应用前景，通过将具有耐逆性、抗病虫害等功能基因导入植物，可以提高植物的产量和抗逆性。
潜在风险和争议：但是，基因工程也伴随着一系列争议和风险，如转基因植物可能对环境造成影响，转基因食品可能对人体健康产生潜在影响，因此需要严格的监管和评估。
结论通过本次实验，我们成功地验证了基因工程技术的可行性，展示了其在农业和生命科学领域的广阔应用前景。
然而，我们也要看到基因工程技术所带来的潜在风险和争议，需要谨慎评估和监管。
基因工程是一把双刃剑，只有正确使用才能实现其最大的利益。
愿基因工程技术为人类带来更多福祉。
《基因工程》实验教学教案
《基因工程》实验教学教案一、实验背景基因工程是一种现代生物技术，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
本实验旨在让学生了解基因工程的基本原理和操作步骤，掌握PCR扩增、DNA连接、转化等关键技术，并应用于实际问题的解决。
二、实验目标1. 理解基因工程的基本原理及操作步骤。
2. 掌握PCR扩增、DNA连接、转化等关键技术。
3. 学会分析实验结果，并能够对实验问题进行解决。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：DNA模板、引物、dNTPs、Taq酶、DNA连接酶、感受态细胞等。
2. 仪器设备：PCR仪器、凝胶成像系统、电泳仪、离心机、DNA提取仪、显微镜等。
四、实验内容与步骤1. PCR扩增目的基因：a. 设计引物，并进行合成。
b. 配置PCR反应体系，包括DNA模板、引物、dNTPs、Taq酶等。
c. 进行PCR扩增，观察扩增曲线。
d. 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2. DNA连接：a. 准备连接反应体系，包括目的基因、载体、DNA连接酶等。
b. 将目的基因与载体连接，并进行转化。
c. 转化感受态细胞，筛选阳性克隆。
3. 转化与筛选：a. 配置转化反应体系，包括连接产物、感受态细胞等。
b. 进行转化，观察转化效率。
c. 筛选阳性克隆，并进行鉴定。
4. 实验结果分析：a. 分析PCR扩增产物，判断扩增效果。
b. 分析转化子，判断连接效果。
五、实验注意事项1. 实验操作过程中要严格遵循无菌操作原则。
2. 实验材料要进行质控，确保实验的准确性。
3. 实验过程中要记录详细的数据和观察结果，便于分析。
4. 实验结果要进行多次重复，以验证实验结果的可靠性。
六、实验拓展与思考1. 讨论基因工程在生物制药、农业、环保等领域的应用。
2. 分析基因工程所面临的伦理、法律和社会问题。
3. 探索基因工程技术在未来的发展趋势。
七、实验报告要求1. 报告内容：实验目的、实验原理、实验材料与仪器、实验步骤、实验结果及分析、实验拓展与思考等。
基因工程育种的实验方案
基因工程育种的实验方案实验目的：本实验旨在利用基因工程技术，通过编辑植物基因组，培育具有抗逆性和高产性的玉米新品种。
实验步骤：1. 选品种：选择适合基因工程改良的玉米品种，考虑其遗传稳定性和对外界环境的适应能力，确保实验能够顺利进行。
2. 确定目标基因：通过文献调研和实验分析，确定对玉米抗逆性和产量有所贡献的关键基因，作为编辑目标。
3. 获得载体和基因编辑工具：设计和合成目标基因的编辑载体，选择适合的基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，用于将载体导入目标植株中。
4. 构建编辑载体：将目标基因和编辑工具导入编辑载体中，通过体外培养和转化技术，获得具有目标编辑基因的植物组织。
5. 转化植物：利用侵染法、基因枪法等技术，将编辑载体导入玉米中，培育转基因玉米株系。
6. 验证转基因植物：对转基因玉米进行PCR鉴定、Southern blot分析等技术，验证其基因组中是否成功导入目标基因。
7. 产量和抗逆性筛选：通过种植试验和生理生化指标测定，筛选出具有优质产量和抗逆性的转基因玉米株系。
8. 品系选育：从筛选出的优质转基因玉米中，选取具有明显优势性状的个体，进行后代选育和杂交，培育出稳定性状的新品种。
9. 田间试验：在不同的环境条件下进行田间试验，评估新品种的产量、抗逆性和适应性，挑选出适合大面积推广的新品种。
10. 商业化推广：准备申请相关的转基因作物审批文件，推广适合商业化种植的优质转基因玉米品种，进行市场化生产。
实验设备和试剂：1. 基因编辑载体、编译工具和转基因技术相关试剂；2. PCR检测设备、电泳仪等分子生物学实验设备；3. 适用于离体培养和转化的生物学试剂；4. 田间试验所需的灌溉设备、气象监测设备等。
实验规范和安全：1. 实验需严格遵守转基因生物安全管理的相关规定；2. 在植株转基因和种植过程中，需对实验室和田间环境进行严格隔离，防止转基因物质外泄；3. 导入转基因植物后代种植区域，需进行环境风险评估和监测，确保周围生态环境不受影响。
基因工程实验设计与教学
基因工程实验设计与教学基因工程是一门应用科学，通过对细胞和基因的操作，来改变生物体的遗传特征。
在现代生物科技领域中，基因工程已经发展成为一项重要的研究方向。
基因工程实验设计与教学旨在培养学生对基因工程实验技术的理解和应用能力。
本文将介绍基因工程实验设计与教学的内容和方法。
一、实验设计1. 实验目的基因工程实验的设计目的是让学生通过实际操作，了解基因工程技术的原理和应用，并培养学生的实验技能和科学思维能力。
2. 实验器材与材料基因工程实验所需的器材和材料包括离心机、PCR仪、DNA测序仪等基因工程实验常用仪器，以及DNA、RNA、酶等实验试剂。
3. 实验步骤（1）提取DNA：学生通过样本提取DNA，可以选择常见的植物、动物或微生物作为实验材料，提取DNA的方法可以采用传统的酚/氯仿提取法或商业DNA提取试剂盒。
（2）PCR扩增：学生将提取到的DNA作为PCR反应的模板，通过PCR扩增特定的基因片段。
PCR反应的条件包括温度、时间和引物浓度等。
（3）凝胶电泳：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，观察扩增片段的大小和数量。
（4）酶切与连连：使用限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，然后进行DNA连接。
连接的方法可以选择经典的黏性末端连接法或者采用DNA连接试剂盒。
（5）转化：将连接好的DNA导入宿主细胞进行转化，培养并筛选含有目标基因的转化菌落。
二、教学方法1. 理论教学在教学之前，需要对基因工程的基本原理、实验设计和操作技巧进行系统的讲解。
包括对PCR扩增、DNA测序、酶切连接等基础技术原理的介绍，以及实验中可能遇到的问题和解决方法的讲解。
2. 实验操作指导为了保证实验过程的顺利进行，教师需要对实验中每个步骤进行详细的操作指导。
包括提取DNA的方法、PCR反应条件的设置、酶切和连接的步骤、细胞转化和筛选等操作技巧的指导。
3. 讨论与总结学生在实验过程中，可以进行实验结果的讨论和总结。
可以对PCR 扩增产物进行凝胶电泳分析，对转化菌落进行筛选，让学生思考结果的原因，并提出疑问和解释。
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基因工程实验设计一、目的基因的获取ACCACCTTCATATGAAGAAATTAACGGTGTTTTCATGAGGAATCCAACAGTCGCTGAATTGGTGGAAAC TGTGGAATTCTTCTTGGCTGAGGTAACCAATCATCACTTCACCACAATGCACAAGTTTGTAGCTTACTA CTACAGTACTTCTAATAAGTTTTGTCTGTTGAGATTTTATTGCTGATTTCTATGCATGGTCATCTTTTT GACAGGCCATCCAGTCTTATCGTGCTGAGAGTGAAACTGAGCTCAACCTGGCAGCTGGTGACTATATAG TTGTCCGGAAGGTACGGCCCTATCTTCCCATTGGACATGTTTCTAACCATAAACATATCTTTGCTGGAC TTTTGTGGGCAAAGTTGGCTACACTAAACTTGTGTTCATTAACCTGCTCAATCAGGTGTCAAACAATGG ATGGGCAGAAGGTGAATGCAGAGGGAAAGCTGGCTGGTTCCCTTACGACTACATCGAGAAAAGGGACCG TGTGCTTGCAAGTAAAGTCGCCCAGGTCTTCTAGGCGTTCAATGAGCCATACATACATAACCCTGGTGT TGTACACTGTATTATGATCGTTCGTGATCTTCAAAGACCCTCTGATCAGAGAAATCACAAATATTCTTT TGTTCTATTATTGTCATTATCACTACCCCTTTTGTCAAAACCAGTGCAGCCTTTT二、引物设计正向引物：12 5’-CCC AAGCTT ACGAGGTT-3’53.6℃反向引物：378 5’-CCG GAATTC TTATCATG-3’ 49.2℃三、水稻总DNA提取1、实验材料：水稻2、实验仪器、器皿、试剂仪器、器皿：研钵、离心管试剂：研磨液：0.45mol/l NaCL 0.1mol/l Tris-CL(pH7.0)0.1mol/l EDTA-Na2 1%SDS70%乙醇、95%乙醇、氯仿-异戊醇（24：1）、5mol/l高氯酸钠、3mol/lNaAC TE:10mmol/l Tris -Cl(pH7.6) 1mmol/lEDTA-Na2(pH7.6)RNase:10mg/ml液氮3、实验步骤1）、称取水稻萌发幼芽材料10g，清洗干净，再用70%乙醇表面消毒晾干2）、将材料放入研钵中加入适量的液氮捣碎材料并研磨至粉状3）、加入20ml研磨液，继续研磨至糊状4）、加入等体积的氯仿-异戊醇充分混匀，分装与离心管中5)、4000g 10min，取上清液6）、72℃水浴保温3—4min，加入5mol/l高氯酸钠（体积比4：1）7)、加入的体积的氯仿-异戊醇（24：1）混匀，4000g离心10min8)、加入2倍体积的95%低温乙醇，沉淀DNA，可见白色丝状物9）、4000g离心10min,弃上清液，加入适量的TE溶解10)、加入RNase至终浓度为50ug/ml,37℃保温30min11)、加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1），4000g离心10min12）、吸取上层水相，加入1/10体积的3mol/lNaAC和两倍体积低温的95%乙醇，混匀，在-20℃放置30min，DNA形成纤维状沉淀13）、沉淀中加入1ml 70%乙醇洗涤一次，4000g离心8min去上清液，纸帕吸干14）、DNA沉淀真空干燥后溶于TE中四、强碱法提取PUC19质粒DNA试剂：1、溶液1（GTE）：50mmol/l 葡萄糖、10mmol/l EDTA-Na2、25mmol/l Tris-Cl （pH8.0）、4mg/ml 溶菌酶溶液2：200mmol/l NaoH、1%SDS溶液3：5mol/l KAC 60ml、冰乙酸 11.5ml、ddH2O 28.5ml2、苯酚-氯仿3、异丙醇（或95%乙醇，100%乙醇）4、70%乙醇5、TE（pH8.0）：10mmol/l Tris-Cl（pH8.0）、1mmol/l EDTA-Na26、RNase 1mg/ml 、Amp 100ug/ml实验步骤1、挑取一单菌落的Ecoli InvaF（PUC19）菌种接种到含Amp100ug/ml的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
2、吸1.4ml菌液至Ep管中，在高速台式离心机上5000r离心2min，倒去培养基。
3、重复一次，尽可能倒出培养基并将管倒置于纸帕上，以吸干管壁上残留的培养基，收集细菌。
4、将细菌悬于500ul冰冷的溶液1中，于离心机上5000r离心2min.5、倒去溶液1，再悬于200ul冰冷的溶液1中。
6、加入300ul新配制的溶液2，冰浴5min。
7、加入300ul冰冷的溶液3，中和，轻轻振荡，至冰浴5min。
8、于离心机上，10000r离心5min。
9、加入等体积的饱和酚快速抽提，10000r离心5min取上清液。
10、再加入等体积的氯仿抽提，10000r离心5min取上清液。
11、加入750ul异丙醇，沉淀质粒DNA，10000r离心10min。
12、倒去异丙醇，用70%乙醇洗涤沉淀，10000r离心5min。
13、置冰箱内开盖干燥，悬浮于40ul去离子水或TE中。
五、目的全长基因序列的扩增材料、试剂：目的基因以10ug/ul溶解在去离子水中、寡核苷酸引物、TaqDNA聚合酶及其最适缓冲液（10X）15mM MgCl22mM dNTPs(pH7.0)去离子水PCR薄壁管PCR仪琼脂糖凝胶电泳装置凝胶成像系统实验步骤：1、按以下比例和浓度在PCR反应管中按下列顺序配制反应体系：去离子水 11ul10XTapDNA聚合酶缓冲液 2ul目的基因模板 1ul正向引物 1ul（25pmol）反向引物 1ul（25pmol）dNTPs 1ulMgCl2 2ulTaq DNA聚合酶 1ul（1U）总体积20ul，置于PCR仪中进行自动PCR2、PCR仪的设置：预变性 94℃ 4min变性 94℃退火 54℃延伸 72℃最后延伸 72℃ 5min3、电泳检查：扩增结束后，在体系中直接加入4ul电泳载样缓冲液，在预加了EtBr的1.2%琼脂糖凝胶上点样电泳。
5V/cm电场强度电泳45min后，紫外线下观察凝胶，正确扩增反应可观察到一0.5kb分子带。
六、DNA的回收纯化1、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸净凝胶表面液体并切碎。
计算凝胶重量（提前记录离心管的重量），该重量作为一个凝胶体积（100mg=100ul）2、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A,混合均匀后于75℃加热（低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热），间断混合，直到凝胶块融化（约6-8min）3、加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。
当分离的DNA片段小于400bp是，需要再加入一个体积的异丙醇4、吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml离心管）中，12000g离心1min。
再取滤液于DNA制备管中同样条件离心后弃滤液5、将制备管置回2ml离心管，加入500ulBufferW1,12000g离心30s，弃滤液6、将制备管置回2ml离心管，加入700ulBufferW2,12000g离心30s，弃滤液。
以同样的方法在用700ulBufferW2洗涤一次12000g离心1min7、将制备管置回2ml离心管中，12000g离心1min8、将制备管置于洁净的1.5ml离心管中。
开盖室温静置3分钟，在制备膜中央加入25-30ul或去离子水，温室静置3分钟。
12000g离心1洗脱DNA，重复一次七、酶切目的基因PCR产物和质粒DNA试剂 XbaⅠ限制性内切酶、KpnⅠ限制性内切酶10×buffer：50mmol/l NaCl10mmol/l Tris-Cl10mmol/l MgCl21mmol/l DTT（二硫苏糖醇）步骤：1.将DNA样品1ug溶解在16ul重蒸水中2.加入2ul 10×buffer3.加入1-2U的限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ4.混合反应液后稍离使液体聚集，置37℃温育1小时5.终止反应加入0.5mol/l EDTA-Na2，至终浓度为10mol/l6.进行电泳检查酶切结果八、回收纯化载体和目的基因（采用酚仿抽提）步骤：1、收集载体于EP离心管中，并加入等体积的苯酚，12000g离心10min2、取上清液到新的EP离心管中，加入等体积氯仿，12000g离心10min3、取上清液于新的EP管中，加入1/10体积的醋酸钠(3mol)和2倍体积的无水乙醇九、目的基因与载体PUC19的连接将目的基因与载体PUC19片段连接重组(20ul体系)Vector 4ul目的基因 13.5ul10×ligase buffer 2ulT4 ligase 0.5ul16℃-22℃连接过夜，去除后55℃-60℃灭活十、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1、实验材料：E.coli InvaF(受体) PUC19质粒DNA2、实验仪器、器皿及试剂仪器、器皿：平板、三角瓶、EP离心管试剂：LB培养基：酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、Nacl 10g/l 、1L水、琼脂2%氨苄青霉素100mg/ml 、 0.1mol/lCaCl2溶液X-gal 20mg/l(用甲酰胺溶液配制)使用浓度为40ug/mlIPTG 20mg/l(用无菌水配制)使用浓度为40ug/ml3、实验步骤1、从甘油保存菌种中接种一环E.coli InvaF至LB平板上，37℃道指培养过夜2、挑取2-3mm直径的单菌落接种至50mlLB液体培养基中，37℃振荡培养4-6h(摇床转速200r/min)当OD600为0.6左右即可3、吸取1.4ml菌液至离心管，5000g 2min，弃上清液，并倒置于纸帕4、重复步骤3一次5、将细菌悬浮液于750ul预冷的0.1mol/lCaCl2溶液，冰浴放置10min6、5000g离心2min，收集细菌7、将细菌重悬于200ul预冷的0.1mol/lCaCl2溶液冰浴放置30min8、每管加入质粒DNA50ng/10ul，轻轻混匀冰浴放置20min，设计一不加质粒DNA的对照9、将管置于42℃水浴锅中2-3min,不要摇动10、迅速转移至冰浴2min11、加入700ulLB液体培养基，37℃培养45min，以便转化菌表达抗性12、接种到含100ul/ml Amp的LB冷平板上13、将平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养过夜14、确信对照无菌落时，在Amp培养基上长出的菌落即是转化子15、蓝白斑的筛选，选取白班十一、菌落PCR检测1、PCR mix（PCR预混液）的制备Taq buffer（10×）20 μLdNTP（2.5 mmol/L） 5 μLPrimer Forward（50 mmol/L）10 μLPrimer Reverse（50 mmol/L）10 μLddH2O 147 μLTaq（2U/μL）8 μLtotal 200 μL将上述溶液混匀，10μL每管分装于200μL PCR管中。