生物制药分离纯化设计
生物制药分离纯化技术
学习情景一
子情景一 子情景二 子情景三
发酵液的预处理
降低发酵液的黏度 凝聚沉降分离悬浮物 絮凝法沉降分离悬浮物
四、实施准备
1.知识和技能准备 （1）PH的调节
发酵液的酸度对降低发酵液黏度有影响，可调节发酵液PH
值，当产生絮凝物时即可。
（2）薄力飞黏度计的使用方法 以说明书为准 2.器材和原料准备 精密PH计、黏度计、蒸汽发 生器、冷热缸、青霉素发酵液
五、实施项目
1.设备清洗 2.设备组合及管道安装
3.向冷热缸输送发酵液
பைடு நூலகம் 三、计划决策
1.采用方法： 明矾凝聚法 2.产品指标： 澄清液浊度 3.制定工作流程： （1）检查黏度和固形物含量；
（2）计算明矾用量；
（3）加入明矾澄清30分钟； （4）测定发酵液浊度，达到规定指标后即停止； （5）打扫场地。
（6）小组评估，经验总结，书写报告。
四、实施准备
1.知识和技能准备
比浊法又称浊度测定法。为测量透过悬浮质点介质的光强度
他们与传统使用的无机絮凝剂相比，具有用量少，沉降速度快，澄清效
果好，成本低等特点。 ②天然高分子絮凝剂
有多糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、甲壳素、脱乙酰甲壳素、
微生物絮凝剂等。其中甲壳素类具有广泛的应用前景。
三、计划决策
1.采用方法： 壳聚糖须凝澄清法 2.产品指标： 澄清液浊度 3.制定工作流程： （1）检查黏度和固形物含量；
2.器材和原料准备 精密PH计、黏度计、可见紫外分光光度计、沉淀罐、青霉素 发酵液。
生物分离纯化案例
生物分离纯化案例
生物分离纯化是一种将目标生物分子从复杂的混合物中分离出来的技术，常用于生物医药、食品工业和环境监测等领域。
以下是一个生物分离纯化的案例：
目标：分离纯化某种特定的酶
步骤：
1. 破碎细胞：使用物理或化学方法破碎细胞，释放出细胞内的酶。
2. 离心分离：通过高速离心机将破碎的细胞残渣与酶溶液分开。
3. 过滤：使用过滤器去除未破碎的细胞和杂质。
4. 层析：使用层析技术（如凝胶层析、离子交换层析等）将酶与其他杂质分离。
5. 透析：将层析得到的酶溶液与外界溶液进行物质交换，进一步纯化酶。
6. 浓缩：使用蒸发等方法将酶溶液浓缩，便于后续处理。
7. 结晶：通过结晶方法将纯化的酶结晶化，便于储存和运输。
通过以上步骤，可以将目标酶从复杂的混合物中分离出来，并进行纯化处理。
在实际操作中，根据不同的目标和要求，可以选择不同的分离纯化方法和技术。
生物制药中的纯化与分离技术
生物制药中的纯化与分离技术生物制药中纯化与分离技术是指从生长在细胞中或微生物中的蛋白质中分离出所需的目标蛋白质的一种技术。
这种技术利用分子大小、电荷、流动性等特性将蛋白质分离出来，使目标蛋白质纯化到99.9%以上。
本文将讨论生物制药中常见的纯化与分离技术及其在生物制药中的应用。
1. 透析透析是一种将离子和小分子物质从蛋白质中除去的方法。
透析技术主要利用膜选择性地筛选分子。
膜可以是人造的例如Amylose树脂，也可以是天然的如酪蛋白。
利用这种技术可以除去体积较小的污染物，使目标蛋白质的纯度得到提高。
2. 电泳电泳是一种基于蛋白质电荷的分离技术。
在电泳实验中，样品被置于注入获得电流的胶体中。
这个胶体具备可以分离蛋白质的网状结构。
电流会引起蛋白质带电的全体向胶体的某个极移动，取决于蛋白质的电荷。
这样，蛋白质就可以分离出来，根据蛋白质的电荷和分子大小，分别形成不同的带。
在生物制药中，这种分离技术最常用于分离小分子处方药物，以及分析生产了多少蛋白质，并确定是否达到预期的纯度。
3. 柔性析柔性析（Soft Gel）是在微球内置入各种树脂甚至基于酸碱度、水性、亲疏水性等特性。
通过改造单元格的特性，在保留不同特性的前提下同时去除掉多余杂质。
柔性析适用于各种具有变异性和特异性的多克隆抗体的准备，也适用于分离和净化由培养基中分泌的多克隆抗体。
4. 亲和层析亲和层析（Affinity Chromatography）被认为是生物制药中最严格的纯化技术之一。
亲和层析是利用可选择地结合目标蛋白质的静态结构将其纯化的，因此是一种高选择性的技术。
技术是通过将特异性结合的化合物连接到某些树脂顺序，然后将这些树脂用于分离目标蛋白质。
根据目标蛋白质和其它污染物分子之间的差异，目标蛋白质可以非常高效地结合到树脂上，而杂质则被过滤掉。
这种技术广泛应用于生产高度纯化的生物制药产品，从而确保符合FDA和EMA的标准。
5. 氨基酸层析氨基酸层析是一种基于不同的氨基酸序列进行分离的技术。
生物制药技术中的过滤与纯化方法介绍
生物制药技术中的过滤与纯化方法介绍在生物制药技术中，过滤与纯化是非常重要的步骤，它们用于从复杂的混合物中分离出所需的生物制剂。
这些技术可以帮助提高产品的纯度和质量，并且在制药工艺中起到关键作用。
本文将介绍生物制药技术中常见的过滤与纯化方法。
一、过滤方法1. 微滤：微滤是一种利用孔径大小为0.1-10微米的微细滤膜或滤器来分离溶液中的微小颗粒和悬浮物的方法。
该方法可以去除细胞碎片、细菌和大多数病毒等微生物颗粒，使溶液更加清澈透明。
微滤常用于前处理步骤，如澄清发酵液和细胞培养基。
2. 超滤：超滤是一种利用孔径大小为0.001-0.1微米的滤膜或滤器来分离分子和溶质的方法。
该方法可以去除分子量较大的蛋白质和多糖等大分子物质，同时保留较小分子物质。
超滤常用于蛋白质纯化、多糖提取和分离等步骤。
3. 离心过滤：离心过滤是利用旋转离心机产生离心力，将混合物中的固体颗粒或大分子物质沉淀到离心管或离心滤芯中的过滤方法。
离心过滤可以高效地去除悬浊物和颗粒，并可以在非常短的时间内完成分离过程。
它常用于快速蛋白质纯化、病毒颗粒提取等步骤。
二、纯化方法1. 亲和层析：亲和层析是一种基于生物分子之间特异性结合的分离纯化方法。
它利用靶分子（如抗体或配体）与某种特定的配对分子（如抗原或亲和剂）之间的亲和力进行选择性识别和分离。
亲和层析通常具有高选择性和高纯化效果，但对于大规模生产来说操作成本较高。
2. 杂交层析：杂交层析是一种依据目标物分子的细菌或细胞表面融合蛋白与其针对性抗体或配体间的亲和性进行分离纯化的方法。
这种方法可以通过调整条件，如洗脱缓冲液pH或盐浓度，来实现目标物的选择性吸附和洗脱。
杂交层析适用于大规模生产，并具有较低的成本。
3. 高效液相层析（HPLC）：高效液相层析是一种基于溶液相亲和性进行分离的方法。
它利用高压输送系统和特定的填料，将混合物中的分离物质通过不同的物理或化学性质将其分离出来。
HPLC可用于溶质的快速分离和纯化，广泛应用于生物制药领域。
药物分离纯化的一般工艺流程
我们使用精纯层析这一术语描述在生物制药生产的最后阶段去除少量杂质的过程。
本
文介绍精纯步骤设计过程中应考虑的因素，从基本问题到面临的典型挑战，均有涉及。
什么是精纯层析，何时需要使用精纯层析？
在生物制药生产的下游生物工艺阶段，层析捕获的第一步是将产品与大部分杂质（例
如细胞培养基组分和蛋白酶）分离开来。
第二步是精纯层析，即去除剩余杂质，获得
更高纯度的目标分子（图 1）。
减少杂质最高效的办法是在开始纯化时尽可能地采用亲和步骤作为捕获的第一步。
在
单克隆抗体生产中，蛋白 A 亲和层析是广泛采用的捕获步骤。
经过该第一步纯化后，
纯度可以达到 95% 以上，这意味着只需进行有限的精纯即可进入最终的配制步骤。
但是，大部分涉及抗体相关产品（mAb、双特异性抗体、Fab 片段）及其他重组蛋白的工艺在捕获步骤完成后，都需要至少两个精纯步骤。
对于部分其他类型的分子，有时可能无法获得所需的亲和层析溶液。
目前尚无令人满
意的溶液可去除纯化后所有的痕量标签蛋白，因此生物制造中基本不考虑采用标签蛋
白质纯化。
如果无法获得目标分子纯化所需的亲和层析溶液，应设计第二步纯化以去除大部分工
艺和产品相关杂质，例如高分子量 (HMW) 杂质、宿主细胞残留蛋白 (HCP) 和 DNA。
如果捕获步骤不采用亲和层析，则捕获与最终精纯步骤之间的步骤也可称为“中度纯化”（图 1）。
生物分离工程课业设计方案
生物分离工程课业设计方案一、项目背景随着生物技术的发展，生物分离工程作为一项重要的技术在生物制药、食品加工和环境保护等领域得到了广泛应用。
生物分离工程主要是针对生物体内的细胞、蛋白质、酶等生物分子进行分离和纯化，从而得到纯净的生物产品。
这对于生物制药行业的发展、食品安全和环境保护等方面都具有重要意义。
因此，本次课程设计将围绕生物分离工程展开，设计一个生物分离工程的项目，以便学生能够通过实践操作，了解生物分离工程的原理、方法和应用。
二、项目目标1. 了解生物分离工程的基本理论和方法。
2. 掌握生物分离工程的实验操作技术。
3. 设计并完成一个生物分离工程的实验项目，获得实验数据并进行分析。
4. 探索生物分离工程在生物制药、食品加工和环境保护等领域的应用前景。
三、项目内容1. 选择适合的生物分离工程项目生物体内的生物分子种类繁多，如细胞、蛋白质、核酸等。
根据项目目标和可操作性，选择适合的生物分离工程项目进行设计。
可以从生物制药、食品加工或环境保护等不同领域进行选择。
2. 设计生物分离工程实验方案根据所选项目的特点，设计生物分离工程的实验方案，包括实验操作步骤、需要的设备和试剂、实验条件等。
并进行实验方案的评估和改进。
3. 进行实验操作根据设计方案和实验步骤，进行生物分离工程的实验操作。
包括样品处理、生物体的破碎、离心分离、色谱层析等操作，获得实验数据。
4. 数据分析和实验结果的总结根据实验数据进行分析，评估实验结果，并进行总结。
对实验中出现的问题进行讨论，提出改进措施，为项目的进一步深入研究提供参考。
5. 应用前景的探索探索生物分离工程在生物制药、食品加工和环境保护等领域的应用前景，了解相关行业的需求和趋势，为学生提供就业或深造方向的参考。
四、设计思路1. 选择合适的生物分离工程项目学生可以选择生物分离工程方面的研究热点，如细胞分离技术、蛋白质纯化技术、核酸提取技术等，根据自己的兴趣和学习需求进行选择。
生物制药中的蛋白质分离与纯化技术研究
生物制药中的蛋白质分离与纯化技术研究蛋白质是生物大分子中，具有重要生物学功能的主要分子之一。
蛋白质分离与纯化技术是生物制药中制备高质量重组蛋白质的关键步骤。
在目前的制药领域中，蛋白质经常被用作治疗，诊断和预防疾病的药物。
蛋白质的制备过程需要经过严谨的分离与纯化操作，以确保最终产物具有较高的纯度，并有利于其进一步的应用。
蛋白质分离的方法有很多种，但纯化高品质蛋白质的方法非常具有挑战性。
其中，手动分离的方法已经被取代，并由高通量方法取而代之。
本文将重点介绍几个常见的高通量分离和纯化蛋白质的技术，包括色谱技术，电泳技术和过滤技术，并简单介绍用于提高蛋白质产量的细胞培养技术。
1.色谱技术色谱技术是蛋白质纯化的主要方法之一。
其原理是利用成分在固定相、移动相和物理化学性质等方面的差异，对混合物进行分离。
这些逐渐被过滤的混合物，经过不同的分离途径（如离子交换、反相和尺寸排除技术）达成纯化输出物的目的。
例如，在一个反相高效液相色谱柱中，柱中的固定相是一种碳氢化合物，这些碳氢化合物中的化合物的极性不同，可以根据化合物吸附水的能力来对混合物进行分离。
利用这种方法进行分离后，可以得到高品质的蛋白质，并进行后续的研究。
2.电泳技术在分子量较小的蛋白质中，电泳技术是蛋白质分离和纯化方法的首选之一。
电泳技术基于被分离的蛋白质的分子量和电荷密度的差异，选择恰当的条件进行分离，常用的有SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、同位素荧光半制动并热雾化质谱等技术。
使用SDS-PAGE，可以在不破坏蛋白质的情况下，通过分子量分离蛋白质。
此外，SDS-PAGE还可以用于与一些特定抗体反应并进行后续分析。
3.过滤技术固定液体膜过滤技术（TFF）是未分子量大和相对重量大的蛋白质进行分离和纯化的一种技术。
该技术利用特殊设计的（反渗透）膜对溶液进行过滤，而不是使用物理和化学特性，这使其在蛋白质纯化中具有独特的优势。
在这种技术中，溶液会流过一个半透性膜，大分子会被留在膜上，并且小分子会被通过膜拦截，从而得到所需的蛋白质。
生物制药中的新型分离纯化技术
生物制药中的新型分离纯化技术生物制药作为当今医药领域的重要分支，其发展对于人类健康事业的进步具有至关重要的意义。
在生物制药的整个流程中，分离纯化技术是关键环节之一，它直接影响着药物的纯度、质量和疗效。
随着科学技术的不断进步，一系列新型分离纯化技术应运而生，为生物制药产业带来了新的机遇和挑战。
一、膜分离技术膜分离技术是一种基于选择性透过膜的分离方法，其原理是利用膜的孔径大小、电荷性质和亲和力等差异，实现对混合物中不同组分的分离。
常见的膜分离技术包括微滤、超滤、纳滤和反渗透等。
微滤膜的孔径较大，通常用于去除细胞、细菌等较大的颗粒物质。
超滤膜的孔径较小，能够分离分子量较大的蛋白质、多糖等生物大分子。
纳滤膜则可用于分离小分子有机物和多价离子。
反渗透膜主要用于去除溶液中的溶剂，实现浓缩的目的。
膜分离技术具有操作简单、能耗低、无污染等优点。
在生物制药中，它被广泛应用于细胞培养液的澄清、蛋白质的浓缩和分离等环节。
例如，在单克隆抗体的生产中，超滤技术可以有效地去除杂质和多余的盐分，从而提高抗体的纯度和活性。
然而，膜分离技术也存在一些局限性，如膜污染问题会导致膜的性能下降，需要定期清洗和更换膜组件；此外，膜的选择性和通量之间往往存在矛盾，需要在实际应用中进行优化和平衡。
二、亲和层析技术亲和层析是一种利用生物分子之间特异性亲和力进行分离的技术。
其基本原理是将具有特异性亲和作用的配体固定在层析介质上，当含有目标分子的混合物通过层析柱时，目标分子与配体结合而被滞留，其他杂质则随流动相流出，然后通过改变条件（如 pH 值、离子强度等）将目标分子洗脱下来。
亲和层析具有高度的选择性和特异性，能够从复杂的混合物中高效地分离出目标物质。
例如，在胰岛素的生产中，可以使用固定有胰岛素抗体的亲和层析柱来分离纯化胰岛素。
但是，亲和层析技术也存在一些不足之处，如配体的制备和固定过程较为复杂，成本较高；此外，由于亲和作用较强，洗脱条件的选择较为苛刻，可能会对目标分子的活性产生一定影响。
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生物药物制备方案设计线路简介
研究目的
机械法、物理法 化学法、生物法 溶剂萃取
文献综述 材料选择 细胞破碎 提 取 固液分离 浓 缩 色谱分离 脱盐冻干
目标物研究进展 建立分析方法 预备实验
沉降 离心 过滤
溶解性能 溶液稳定性 固体稳定性 物理性质 化学性质
水相萃取
吸附色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 亲和色谱 疏水色谱 逆流色谱
鉴定常用方法 化学方法 仪器方法 1、紫外光谱：用于是否含有共轭体系的鉴定 2、红外光谱：测定分子中存在的官能团种类 3、质谱：确定分子量 4、氢核磁共振谱 ：确定氢的个数及相互关系 5、旋光光谱：具有旋光性的天然产物，测定其构 型和构象 6、元素分析：测定C、H、N、S元素含量。 7、核磁共振谱：确定分子骨架。
第二部分 天然产物的提取分离鉴定
一、提取方法
水 亲水性有机溶剂 亲脂性有机溶剂
溶剂提取法 水蒸气蒸馏法
溶剂
超临界流体萃取法（SFE） 升华法
压榨法
浸渍法（泡药酒） 渗漉法 溶剂提取的方法 煎煮法（煎中药） 回流提取法 连续回流提取法
影响溶剂提取法的因素 （1）生物材料的粉碎度
二、生物药物常用的提取方法与优化
（一）几种常用提取方法 1．酸、碱、盐水溶液提取方法 2．表面活性剂提取方法与反胶束提取方法 3．有机溶剂提取
4. 双水相萃取法
5．超临界萃取法
（二）提取方法优化 1.溶剂选择 2.选择添加剂 ①保护剂； ②酶抑制剂 3.提取条件 ①温度； ②pH； ③盐； ④表面活性剂
Thank you!
2. 分离纯化原理
(1)根据分子形状与分子大小
(2)根据电荷差异
(3)根据分子极性与溶解度大小
(4) 根据吸附特性
(5) 根据生物配基特性
3. 分离纯化方法选择原则 （1）粗品分离：大处理量,相对低分辨率 盐析，分级沉淀，萃取，超滤 （2）精制：高分辨率 多种色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC， 电泳或等电聚焦
三．浓缩与干燥
1.浓缩方法： ①盐析；
②有机溶剂沉淀；
③高分子脱水
④超滤；
⑤真空浓缩或薄膜浓缩；
2.干燥： ①低温真空干燥； ②喷雾干燥；
③冷冻干燥
四、分离纯化
1.生化制药工艺中分离纯化特点:
(1) 生物材料组成复杂
(2) 目的物含量低
(3) 易变性、失活 (4) 分离方法有很大经验成分 (5) 步骤多，逐级分离 (6) 产品验证与化学上纯度概念不完全相同
4、在分离纯化的设计中需要考虑的因素： 抑制宿主细胞或分泌产物中相应的酶活性，防止其 消化降解待提纯产物。
使目标产物成分有较高的纯度，降低对人体有害的
非目标成分的含量。
保证生物药物的安全、有效。注意每个生产环节的
时效性，对每一步骤的质量进行监控。 尽可能优化分离纯化工艺，减少分离步骤，降低生 产成本。
酚 UV280nm，IR1500~1600、3300cm-1，溶于NaOH 黄酮 黄色或淡黄结晶，UV240~285nm及300~400nm各一 峰，IR在1500~1700cm-1有吸收。 皂甙 1H谱在高场有山峰形及几个甲基尖峰信号。 香豆素 UV240~260nm，IR1500~1600cm-1，有芳环吸收； 320nm吡喃酮环结构， 1700cm-1附近有不饱和内酯 吸收峰 ；1H谱主要为芳香质子信号。
（3）提取时间
以提完为准，是否完全可以提取也做定性 实验，或薄层层析检测，或以液体颜色判断。 根据检测结果确定是否需要延长提取时间。
（4）浓度差
根据扩散原理，造成提取液的浓度差可 以提高提取的效率。 可采取的措施有：搅拌、更换溶剂。
（5）新技术的使用
超声波、微波促提技术的应用，可以加快提 取速度，提高提取效率。
沉淀、吸附、 超滤 离心浓缩
透析、凝胶过滤
冷冻干燥
产品分析
生物活性、酶活力、比活 组成和纯度分析 分子量、pI 其它理化性质分析
生物药物提取、分离、纯化技术基础
一、原材料选择的原则： 原料有效成分含量高、来源丰富、产 地较近、杂质含量少、成本低。
生物材料的选择： 1．生物活性物质存在部位：胞内、胞外、 胞浆、质膜、器膜、周质 2．生物材料的采集与质控 （1）品种鉴定； （2）防止污染与感染； （3）选择富集目的物材料； （4）冷冻保存
材料细，面积大，扩散快，效果好。 但是太细，吸附作用大，易糊化，扩散慢， 同时植物细胞也会遭受破坏，大量蛋白质、 淀粉被提出，产生沉淀或胶束状，影响提 取。 花、叶可适当粗些，皮、茎、根宜细 些。
（2）提取温度
一般使用常温，在不破坏有效成分的条 件下加热不要超过80˚C。 温度低提取时的杂质少，温度高时提取 效率高；但含淀粉、粘液质较多的材料，水 提时避免热提。
二、天然产物的分离与精制方法
溶剂萃取法 色谱法：纸色谱、柱色谱、薄层色谱 沉淀法：乙醇沉淀法 、酸碱沉淀法、铅盐沉淀法 盐析法 透析法 结晶、重结晶和分步结晶
螺旋藻多糖提取
三、天然产物的鉴定
鉴定天然产物所需做的工作 1、元素分析 2、物理常数 3、比旋光度 4、分子量、凝胶过滤法、光散射法、粘度测定法 5、结构测定法：红外光谱、核磁共振（13C谱 、 1H谱和二维谱） 由哪些元素组成，各占多少。 熔、沸点