细胞培养方法及应用实例
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
细胞工程的应用实例及原理
细胞工程的应用实例及原理细胞工程是一门涉及生物学、工程学和医学等多学科交叉的学科领域，主要研究利用工程技术手段调控和操纵生物细胞，以实现特定的功能和应用。
下面将介绍几个细胞工程的应用实例及其原理。
1. 细胞治疗细胞治疗是指利用活体细胞作为治疗手段来治疗各种疾病。
细胞工程通过培养和扩增患者自身的干细胞或特定的细胞类型，如造血干细胞、T细胞等，然后将其重新引入患者体内，通过细胞的生物学特性和功能修复破损组织或改变疾病的进程。
例如，利用干细胞转化为心肌细胞可以修复心脏组织的损伤，治疗心脏病；利用改造的T细胞可以攻击癌细胞，治疗癌症。
2. 人工器官细胞工程技术可以用于构建人工器官，主要包括通过细胞培养和支架材料结合的方法，构建出可移植的人工心脏、肝脏、肺等器官。
其原理是利用可生物降解的支架材料作为蓝本，通过细胞培养技术培养和定向分化相应的细胞，然后将这些细胞种植在支架上，培养出与人体器官相似的结构和功能。
这种方法可以解决器官移植的短缺问题，并减少免疫排斥反应。
3. 功能基因组学功能基因组学是通过调控和操作细胞内的基因表达来研究基因功能及其调控机制。
细胞工程可以通过基因编辑技术，如CRISPR/Cas9等，针对特定的基因进行精确修改和调控。
这种方法可以帮助我们理解基因的功能，发现相关疾病的致病机制，并为疾病的治疗提供新的思路和方法。
4. 生物制药细胞工程在生物制药领域有着广泛的应用。
通过利用细胞工程技术，可以构建工程细胞（如CHO细胞）来表达和生产重组蛋白、抗体、疫苗等生物药物。
其原理是将含有目标基因的质粒或病毒载体导入到工程细胞中，使其表达和生产特定的蛋白。
这种方法可以大规模生产高效、纯度高的生物药物，满足疾病预防和治疗的需求。
5. 人工肉细胞工程技术在人工肉的制造上也起到了重要作用。
通过从动物体内提取肌肉干细胞，然后在体外培养、扩增并分化为肌纤维细胞，最后形成肌肉组织。
这样可以实现无需屠宰动物，获得与传统肉相似的食品。
第3章 动物细胞工程制药(二)
2. 主要参数癿检测和控制方法
（1）温度（电阻温度计） （2）pH（复合式参比电极） （3）溶氧（极谱式或电流式覆膜电极） 为保持所需的溶氧，目前常采用的措施（P115） （4）搅拌（电磁感应癿转速计） （5）迚出液流量（泵速癿控制） （6）其他
温度传感器
pt-100温度传感器探头
DO电极
pH电极
显 微 镜 下 的 微 载 体
• 第二代微载体——多孔微载体/多孔微球 • 材粒：蛋白类（明胶、胶原）、纤维素、高分子塑料、特 种橡胶、玻璃、陶瓷…… • 优点：极大地增大了供细胞贴附的比表面积 • 缺点：培养条件不易均一，传质和传氧条件要求更高，清 洗较困难。
•
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩
3.灌流式操作
• 灌注式操作是指细胞接种后迚行培养，一方面新 鲜培养基丌断加入反应器。一方面又将反应液连 续丌断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处 于一种丌断癿营养状态。 • 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件较 好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～108 个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温 下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高， 生产成本明显降低。
2.半连续式操作
• 半连续培养又称为反复分批式培养或换液培养。 • 是指在分批式操作癿基础上，每间隔一段时间，丌 全部取出反应系，而只取出部分培养物（或单纯条 件培养基，或连同细胞、载体），剩余部分重新补 充新癿营养成分，或另加新鲜载体，再继续培养， 这是反应器内培养液癿总体积保持丌变癿操作方式。 • 该法应用广泛，优点是操作简便，生产效率高，可 长时期迚行生产，重复收获产品，而且可使细胞密 度和产品产量一直保持在较高癿水平。
动植物细胞培养产酶
理化性质
• 英文名：Paclitaxel, Taxol® or
Ph3
O C6H5
Ph2
C6H5 O N H
3' 2' 1'
18 12
AcO
11
10 9 17 2 16
O19
8 3
OH
6 5 20 O
O C6H5
OH
二、动物细胞培养产酶
动物细胞的特性 动物细胞培养特点与培养方式
动物细胞培养的工艺条件控制
动物细胞培养产酶的工艺过程
典型动物细胞培养产酶的工艺过程
2.1 动物细胞的特性
动物细胞的形态
A、贴壁依赖型
1、成纤维细胞（fibroblast 或mechanocyte type)
2、上皮细胞（epithilium cell)
缺点：1、合成过程烦琐复杂，几十步
2、费用高，化学试剂昂贵 3、总收率太低（2%）
• 半合成
以10-DABⅢ和Baccatin Ⅲ作为半合成原料获得 紫杉醇 新方法用10-DAT
优点：1、原料枝叶含量丰富、 提取相
对容易，充分利用再生资源 2、产率较高； 3、可以规模化制备； 4、获取紫杉醇构效关系信息，进 行结构改造; 缺点：合成过程相对复杂 （11步化学转化和7步分离）
3、游走细胞（wondering cell）
4、多形性细胞（polymorphic cell)
B、悬浮型或非贴壁依赖型
1、动物细胞的特性
动物细胞的特性
动物细胞没有细胞壁，适应环境能力差； 动物细胞的体积大，稍小于植物细胞； 大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制 性；
动植物细胞培养
CO2的含量水平对细胞的生长 同样相当重要
研究发现,植物细胞能非光合地固定一定浓度 的CO2,如在空气中混以2%～4%的CO2能够 消除高通气量对长春花细胞生长和次级代谢物 产率的影响.因此,对植物细胞培养来说,在 要求培养液充分混合的同时,CO2和氧气的浓 度只有达到某一平衡时,才会很好地生长,所 以植物细胞培养有时需要通入一定量的CO2气 体.
填充床/流化床反应器
填充床反应器
流化床反应器
膜反应器
三,影响细胞培养因素
细胞种质影响 外界因素影响 光照影响 光对黄酮化合物形成的影响,培养物在光照特别 是紫外光下黄酮及黄酮类醇糖苷积累的所有酶活性均 增加.通常光照采用荧光灯,或者荧光灯和白炽灯混 合,其光强度是300～10000lx(6～100m/m2s)可以 连续光照,也可以每天光照12～18h. pH 培养基成分的影响:
第二节 动物细胞培养技术
动物细胞培养开始于本世纪初,到1962年规模 开始扩大,发展至今已成为生物,医学研究和 应用中广泛采用的技术方法,利用动物细胞培 养生产具有重要医用价值的酶,生长因子,疫 苗和单抗等,已成为医药生物高技术产业的重 要部分.大规模动物细胞培养在生物技术产业 化进程中显示出强大的潜力. 利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世 界生物高技术产品市场份额的50%.
已有商品市售无血清培养基主要有下述3 类: ①基本合成培养基; ②基本合成培养基加生长因子; ③基本合成培养基加组织抽提物.
合成培养基的种类虽多,但一般都含有氨 基酸,维生素,碳水化合物,无机盐和 一些其它辅助性成分. 在细胞培养中,大多数细胞需要谷氨酰胺 作为能源和碳源 复杂培养基都含有核苷,柠檬酸循环中间 体,丙酮酸,脂类,氧化还原剂如抗坏 血酸,谷胱甘肽等及其他各种化合物.
动植物细胞组织培养技术现状及应用实例
动植物细胞组织培养技术现状及应用实例动植物细胞组织培养技术是现代生物科学研究的重要工具，它可以应用在药物研发、农业生产、环境保护等领域。
本文将介绍动植物细胞组织培养技术的现状及应用实例。
一、植物细胞组织培养技术现状植物细胞组织培养技术是指将植物组织、细胞或器官移植到营养饲料中，通过调节培养条件和营养液组成，使其在无土、无阳光的条件下进行生长和繁殖的技术。
植物组织培养技术主要包括植物愈伤组织培养、植物无菌播种等。
目前，植物细胞组织培养技术的应用已经从传统的植物繁殖转移到了植物产生抗性、药用物质和基因转化等方面。
植物组织培养技术的主要应用之一是在植物育种中，例如通过合适的培养条件和营养液配方，可以促进植物遗传变异，产生新的变异体，为植物育种繁殖提供新的材料。
此外，植物组织培养技术还可以用于植物基因工程研究，如通过组织培养体系，将外源基因导入到植物体内，实现对植物性状的基因编辑和调控。
二、植物细胞组织培养技术应用实例1.丹参组织培养产生丹参酮丹参是一种常见的中药材，丹参酮是其中最重要的活性成分之一。
通过植物组织培养技术，可在无污染的条件下，得到大量优质的丹参组织，从中提取出丹参酮，具有较高的药效价值。
2.马铃薯组织培养繁殖马铃薯是世界上重要的蔬菜和淀粉作物之一。
植物组织培养技术可以通过组织切片、愈伤组织的诱导等手段，实现马铃薯的高效繁殖，为农业生产提供了更为丰富的资源。
3.玫瑰无菌苗繁殖玫瑰是世界上重要的观赏花卉之一，通过植物组织培养技术可以实现无菌苗繁殖，克服传统繁殖方式中的传播病害风险，提高玫瑰繁殖的效率和质量。
4.菜豆组织培养产生抗病性菜豆菜豆是我国重要的经济作物之一，由于受病害、虫害、籽粒质量等因素的影响很大，因此，使用植物组织培养技术进行抗性育种具有重要的经济意义。
菜豆组织培养技术可大大缩短育种周期，提高育种效率，是菜豆育种的重要手段之一。
三、动物细胞组织培养技术现状动物细胞组织培养技术是指将动物细胞移植到营养液中，以其自身的生殖能力、分化能力和功能表现进行生长和繁殖的技术。
小鼠细胞实验培养步骤
小鼠细胞试验培养步骤小鼠细胞常用的分别方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分别和培养原代细胞。
一、试验分别和培养步骤1. 小鼠颈椎脱臼处以死刑后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。
2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。
3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后赶忙转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。
4. 清洗完成后，用剪刀镊子搭配除掉自动脉弓和心房组织，仅保管心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。
5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。
A. 贴块法6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3—5 min。
7. 消化完成后，添加数毫升FBS停止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T—25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2—4h。
8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触全部的组织块。
9. 之后放入培养箱中连续培养，一般2—4天后成纤维细胞会从组织块四周爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。
B. 消化法6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。
7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS停止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3—5次，直至组织块消化。
一种鼻黏膜上皮细胞3d类器官及其培养方法和应用与流程
一种鼻黏膜上皮细胞3d类器官及其培养方法和应用与流程在生物医学研究领域，3D类器官技术的发展为疾病模型的构建及药物筛选提供了新的途径。
本文将详细介绍一种鼻黏膜上皮细胞3D类器官及其培养方法、应用与流程。
一、鼻黏膜上皮细胞3D类器官简介鼻黏膜上皮细胞3D类器官是一种基于鼻黏膜上皮细胞构建的三维细胞培养模型，能够模拟人体鼻黏膜组织的结构和功能。
这种类器官具有高度仿生性，可为研究鼻黏膜相关疾病提供理想的实验平台。
二、培养方法1.细胞来源：从鼻黏膜组织中分离出上皮细胞。
2.细胞培养：将分离得到的上皮细胞进行原代培养，待细胞生长至80%汇合时，进行传代培养。
3.3D类器官构建：将传代后的细胞接种于生物可降解支架材料（如胶原蛋白、明胶等）中，形成三维结构。
4.培养条件：类器官培养过程中，需提供适宜的营养物质、氧气、温度和湿度等条件，以保证细胞生长和类器官形成。
5.诱导分化：通过添加特定生长因子和激素，诱导细胞向鼻黏膜上皮细胞分化。
三、应用与流程1.疾病模型：利用鼻黏膜上皮细胞3D类器官，可以构建各种鼻黏膜相关疾病模型，如慢性鼻炎、鼻窦炎等，为研究疾病发生机制提供实验依据。
2.药物筛选：将候选药物作用于3D类器官，观察药物对鼻黏膜上皮细胞的影响，评估药物的安全性和有效性。
3.个性化治疗：基于患者个体差异，利用3D类器官进行药物敏感性测试，为患者提供个性化治疗方案。
具体流程如下：（1）类器官构建：根据上述培养方法，制备鼻黏膜上皮细胞3D类器官。
（2）疾病模型构建：将类器官暴露于致病因素（如病原体、化学物质等），观察细胞生长、分化及炎症反应等。
（3）药物筛选与评估：将候选药物作用于类器官，观察药物对细胞的影响，评估药物疗效。
（4）数据分析：对实验结果进行统计分析，为疾病治疗和药物研发提供理论依据。
四、总结鼻黏膜上皮细胞3D类器官作为一种新型实验模型，具有高度仿生性、可靠性和应用广泛性。
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与悬浮培养法相比：扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能 有效监测细胞的生长。 ⑷细胞贴壁的表面
要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷 密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。
2.悬浮培养
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
等方法。
1.愈伤组织培养
什么是愈伤组织？
所谓愈伤组织培养是指，将外植体接种到人工培养基上，在激素作用
下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。
切取 植物组织 接种
(消毒)
培养
MS培养基
愈伤组织
试管苗
生根培养
长出茎、叶
资料卡片
愈伤组织（callus）
在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下 来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成 新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
⑵主要优点 细胞紧密黏附于固相表面，易更换培养液；易采用灌注培养，从而达
悬浮培养是对非依赖性细胞培养的一种
方法。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择
也可用此方法培养。
悬浮培养投资较小，扩大培养规模简单
（只须增大培养体积）。如：淋巴细胞的培
养可采用悬浮培养法。
在悬浮培养过程中应注意及时进行细胞
继代培养，因为当培养物生长到一定时期将 进入分裂的静止期。
细胞悬浮培养瓶
对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密
1.悬浮培养反应器——搅拌式反应器
常见的悬浮培养反应器如：搅拌式反应器、液体循环式反应器和鼓泡
式反应器等类型，其工作原理与相应的微生物反应器（发酵罐）相同。
对于动物细胞，因没有细胞壁的保护，对
搅拌剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容
易对其造成损害。
同样，植物细胞的纤维素细胞壁虽然使细
胞具有很强的抗张强度，却使其抗剪切的能力
分离
破壁
植物细胞
原生质体
接种、培养
愈伤组织
分化培养
驯化移栽 试管苗
生根培养
生根
长出茎、叶
3.花粉培养
在无菌条件下取出花药或花粉粒（小孢子），置于培养基上进行人工
培养，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株。
花粉愈伤组织
接器
细胞培养反应器种类繁多，根据细胞的培养方式不同，可将其分为悬 浮培养反应器、贴壁培养反应器及固定化培养反应设备等。
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
动物细胞的固定化易于细胞与产物的分离及产品的纯化。因此，固定 化是实现动物细胞高密度长期培养、从而提高生物反应器生产效率的重要 技术途径。
常见的固定化方法有：吸附法、共价贴附法、交联法和包埋法等。
⑴吸附法 所谓吸附法是指：用固体吸附剂将动物细胞吸附在其表面，从而使细
胞固定化。 吸附法的主要优点是：操作简便、条件温和；其主要缺点是：载体的
开，不与细胞直接接触。这样，反应器既能保证混合效果又有尽可能小的 剪切力，以满足细胞生长的要求。
⑵搅拌浆的改进 搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的
改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。 例如：采用双螺旋带状搅拌桨，并在顶部法兰盖安
装 3块表面挡板。挡板以相对于径向的夹角为30°垂直 插入液面。
负荷能力低，细胞易脱落。
⑵共价贴附法 所谓共价贴附法是指：利用共价键将动物细胞与固体载体结合的细胞
固定化方法。 共价贴附法连接键非常牢固，能有效地减少细胞泄漏；因化学试剂的
引入，对细胞的活性有一定的影响。
⑶交联法 使用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团如氨基、羧基
等进行交联，形成共价键来固定细胞，其结合力是共价键。此法制备的细 胞与载体结合紧密，但制备麻烦，活力损失较大。
相当弱。因此，传统用于微生物的搅拌反应器
用作细胞的培养，须对搅拌方式加以改进。
5L 细胞培养罐
⑴供氧方式的改进 一般情况下搅拌式反应器还常伴有鼓泡，为动物细胞生长提供所需氧
分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以须供氧方式上进行改进。 笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种，即气泡用丝网隔
度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和
接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包
括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。
3.固定化培养
所谓固定化培养是指，将动物细胞与不溶性载体结合起来进行培养的 方法。简单地，说就是将被培养生物体固定在一定的培养基上进行培养的 过程。
愈伤组织在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便 开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。
在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的 愈伤组织，大致要经历三个时期。即：启动期（细胞 准备进行分裂期）、分裂期和形成期。
2.原生质体培养
取植株的幼胚、根、茎或叶等组织细胞，用纤维素酶或果胶酶除去植 物体细胞的细胞壁（原生质体），在培养基上生长分裂，通过愈伤组织诱 导分化长出茎、叶，再长出根形成植株。
第二节 细胞培养方法及应用实例
Cell development method and it’s applied solid example
一、动物细胞培养方法 二、植物细胞培养方法 三、细胞培养反应器 四、细胞工程应用实例
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。