静(动)态光散射仪的工作原理

静态光散射功能对于悬浮于液体中的颗粒，利用Mie散射形成光强与角度的函数关系，从而得到颗粒粒度大小与形状的信息。

对于高分子溶液，光强与角度、浓度形成的依赖关系（即浓度依赖性与角度依赖性），利用Zimm图（或其他类似的方法）可以得到以下参数：1) 绝对重均分子量(Mw)2) 第二维里系数(A2)3) 均方根回旋半径(Rg)4) Zimm, Berry和Debye曲线2. 静态光散射应用领域1) 石油化工：包括PS、PMMA等等多种聚合物的研究与表征2) 生命科学：如各种人造组织（合成高聚物）的研究与改性3) 生物医学：蛋白质、多肽，及多糖等的研究和表征4) 环境化学：絮凝方面的研究产品：zeta电位、便携式示波表、碳硅分析仪、电子温湿度计、污水处理设备、FLUKE钳表、微机继电保护测试仪、浊度仪、无转子硫化仪、微量水分测定仪、经济型数控机床等。

动态光散射仪的工作原理动态光散射技术（dynamiclightscattering,DLS）是指通过测量样品散射光强度起伏的变化来得出样品颗粒大小信息的一种技术。

之所以称为“动态”是因为样品中的分子不停地做布朗运动，正是这种运动使散射光产生多普勒频移。

动态光散射技术的工作原理可以简述为以下几个步骤：首先根据散射光的变化，即多普勒频移测得溶液中分子的扩散系数D，再由D= KT/6πηr可求出分子的流体动力学半径r，(式中K为玻尔兹曼常数，T为绝对温度，η为溶液的粘滞系数),根据已有的分子半径-分子量模型，就可以算出分子量的大小。

光在传播时若碰到颗粒，一部分光会被吸收，一部分会被散射掉。

如果分子静止不动，散射光发生弹性散射时，能量频率均不变。

但由于分子不停地在做杂乱无章的布朗运动，所以，当产生散射光的分子朝向监测器运动时，相当于把散射的光子往监测器送了一段距离，使光子较分子静止时产生的散射光要早到达监测器，也就是在监测器看来散射光的频率增高了；如果产生散射的分子逆向监测器运动，相当于把散射光子往远离监测器的方向拉了一把，结果使散射光的频率降低。

日常生活中，但我们听到救护车由远而近时，声音的频率越来越高，也是同样的道理。

实际上我们可以根据声音频率变化的快慢来判断救护车运动的速度。

光散射技术就是根据这种微小的频率变化来测量溶液中分子的扩散速度。

由D=KT/6πηr可知，当扩散速度一定时，由于实验时溶剂一定，温度是确定的，所以扩散的快慢只与流体动力学半径有关。

蛋白质多方面的性质都直接和它的大小相关。

因此，光散射广泛应用与蛋白质及其它大分子的理化性质研究。

动态光散射技术的优点：1．样品制备简单，不需特殊处理，测量过程不干扰样品本身的性质，所以能够反映出溶液中样品分子的真实状态；2．测量过程迅速，而且样品可以回收利用；3．检测灵敏度高，10kD蛋白质，浓度只需0.1mg/mL,样品体积只需20-50µL即可；4．能够实时监测样品的动态变化。

二、动态光散射技术的应用溶液中的颗粒物质（如生物大分子、高分子聚合物、胶束等），其颗粒大小的变化往往可以反应出某些性质方面的变化。

由于光散射实际上是首先通过测量大分子物质的扩散系数，进而推导出其它参数。

所以，光散射不仅可以用来进行静态测量，还可以检测一些动态过程的变化。

下面以大家熟悉的生物学中的几个具体实例来介绍动态光散射技术的应用。

1.测定蛋白质分子的均一性蛋白质样品的均一性是生长晶体的前提条件，在无法直接观察蛋白质在溶液中状态的情况下，生长晶体是一个需要经验和运气的过程。

但是用光散射技术，只需要几分钟就可以确切地告诉你，这个样品是否有长出晶体的可能性。

你还可以测定蛋白在不同溶液中的状态，从而确定出哪种溶液最适合生长晶体。

2.测定蛋白质分子的pH稳定性有些蛋白质分子在不同的pH值条件下，会有不同的构型，或者形成聚合态，或是变性。

如胰岛素在pH2.0时是以单体存在，而在pH3.0时则以二聚体形式存在，当pH升至7.0时则以六聚体存在。

因为这种变化表现为大小的变化，所以光散射技术可以用来测定蛋白质分子的pH稳定性。

3.测定蛋白质分子的热稳定性对一些热不稳定的蛋白，温度改变会导致分子变性聚合，因此可以观察到分子半径明显增大。

所以可以利用光散射技术来研究蛋白质分子的热稳定性。

4.蛋白质变复性及折叠的研究蛋白质变性时往往是以聚合形式或较松散的状态存在，复性后，蛋白质折叠成天然状态，会发生结构的变化，这一变化可以导致流体动力学半径的变化，所以光散射技术可以用来检测这一动态变化的过程。

5.临界胶束浓度的测定一定浓度的表面活性剂分子加到溶液中会形成微胶束，但浓度不同会影响胶束的大小以及是否能够形成胶束。

如果浓度增加到一定程度，胶束就会形成，胶束的大小和单分子大小会有明显区别，利用光散射就可以确定胶束形成的临界浓度。

动态光散射技术还可用于一些动态过程的检测，譬如蛋白质复性的整个过程的监测。

三、激光动态光散射仪的结构动态光散射仪的结构原理图如下：仪器结构总是与其功能相适应的，下图为生命科学学院所有的proteinsolution公司的MS8 00光散射仪的外形。

上方为主机，包括激光器、检测器、相关器等；下方是温控器和样品室四、动态光散射仪的使用1、样品制备由于动态光散射仪对灰尘和气泡及其它大的颗粒非常敏感，所以制备样品时，一定要注意不要让样品中混有大颗粒物质。

一般采取如下措施：a)先将样品离心，12000g离心5分钟,离心时的温度视样品要求而定。

取上层样品过滤，滤膜的选择要视样品分子大小而定，对蛋白质样品通常用0.02µm的滤膜，如果目标分子在1 00kD以上，建议用0.1µm的滤膜。

过滤后的样品直接加样到样品室中。

2、加样步骤将加样针伸到样品池的底部，一边加样一边缓缓向上提起加样针，以免形成气泡，然后盖上样品池的盖子。

注意，加样针不能碰到样品池的窗口，否则会留下划痕，影响测量。

1）样品池的清洗与准备2）动态光散射技术非常灵敏，所以对每一个细节的要求都很高。

样品池的内外表面不能粘有脏物，不能有手指印迹等。

3）清洗步骤：用1％tritonX－100浸泡，超声清洗十分钟，然后用超纯水冲洗干净，再用高纯氮气吹干。

检测是否洗干净的方法是装上超纯水，进行光散射测量，看散射光强是否与标准值接近。

清洗干净的样品池保存在专用的盒子中备用。

3、数据分析与解释*PolydispersityCP<15%ofRH®均一(如下图上排所示)。

注意：均一并不说明一定是单体，下图上排三种情况均是均一状态。

CP<30%ofRH®(如下图下排左一所示)CP>30%ofRH®(如下图下排左二、三所示)五、实验步骤1、打开计算机，打开光散射仪电源；2、运行DynamicV6程序，将温度设定在所需的值，并待其温度稳定；3、装配过滤器，滤膜孔径为0.02µm。

将100ul配制好的蛋白质溶液12000rpm离心5分钟，取上层样品40微升，过滤上样。

4、新建实验窗口，从file菜单中选择new或在主界面直接点击new快捷;5、输入相应的参数和文件名，参数包括；溶剂类型，采集数据的时间，温度，样品浓度，所选理论模型等;6、将盛放好样品的样品池放到样品室中，盖上样品室盖子；7、点击record按钮，采集数据；8、收集十组以上有用数据，分析实验结果；注意，样品池用过之后，下一次上样之前，必须清洗干净，判断方法是在样品池中加入过滤后的超纯水，看所测结果是否符合标准。

六、注意事项仪器中光路系统的干燥管需要定期检查，如果吸潮到一定程度，需要烘干再生。

实验流程开机及打开软件设置参数（包括温度，激光强度，分子结构模型）将样品放到散射池中将散射池放到样品室中等五分钟，待温度平衡采集数据检测数据采集保存数据如果数据较好，分析粒径分布采样结束，取出散射池清理散射池，装载下一个样品采集数据重复测试其它样品或终止实验推出软件（必须在关闭仪器电源之前）关闭电源操作流程图示软件操作部分1、新建一个文件2、点击右下的connect,建立软件与仪器的连接；3、连接成功后，startbutton会变成绿色。

4、装载样品，点击startbutton，即可开始采集数据。

数据采集时，startbutton为红色，点击红色的startbutton即可停止数据采集。

建议：1]第一次上样建议用未过滤的样品，最小上样体积12微升。

把加样针的前端伸到样品池的底部，加样时缓慢将上样针上提，避免气泡产生。

2]如果采集的数据表明样品有聚集或者有大的颗粒，可将样品进行离心（15000g，10min）,或者将样品进行过滤处理。

当样品池放好，点击绿色startbutton按钮，采集数据。

如果按钮不是绿色，表明计算机没有和仪器连接起来；采集十组有效数据以上，停止采集数据。

5、数据的自动采集在程序界面的树目录栏位，点击右键，可以设置程序采集数据，可以设置时间延迟，数据采集，数据保存，温度设置等。

7、数据保存点击file–save，或点击save按钮保存文件。

8、数据分析处理通过软件对采集的数据进行分析处理。