植物花药培养及单倍体植株鉴定-2015资料
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花药培养
基础知识 （三）影响花药培养的因素
一、材料的选择：
1.月季的花药培养时间选在月季的 初花期 。 2.选择合适的花粉发育时期: 单核期 ，细胞核由中央移向 细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。 为了挑选到此时期的花药，通常选择完全未开放的 花蕾。 二 培养基 激素：KT：激动素
（一）材料的选取
选择花药时，一般通过镜检来确定其 中的花粉是否处于适宜的发育期。 最常用的方法有 醋酸洋红法 。但是，某 些植物的花粉细胞核不易着色，需采 用 焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染 成 蓝黑色。
凡是种子有果皮包被着， 胚珠有子房壁包被着的植物， 就叫做被子植物。
被子植物：种类繁多，占地球上所有植物种类的2/3。
被 子 植 物
双子叶植物
种子的胚具有 两片子叶
单子叶植物
种子的胚具有一片子叶
花的结构
被子植物的双受精作用
精 子 （1个） 卵细胞（1个） 精子（1个）
受精作 用
受精卵
发育
胚 胚乳
专题三 植物组织培养
课题2 花药培养
课题背景
• 实验证明：植物的生殖细胞也可以和体 细胞一样，在离体条下，具有发育成 完整植株的潜能。 • 目前，已有250多种高等植物的花药培养 获得成功。 • 花药培养在育种上有特殊的意义：单倍 体育种。
一、基础知识
（一）、被子植物花粉的发育 被子植物： 花的结构： 种子与果实的发育过程 花粉的形成过程
基础知识 （二）产生花粉植株的两条途径
脱分化
分化 胚状体 丛芽 再分化 诱 导
丛芽
花粉
脱分化
生根
移栽
花粉
愈伤组织
取决于培养基中激素的种类及其浓度配比
第7章_花药培养及单倍体育种
第一节 单倍体及单倍体育种
一、单倍体的概念及其来源
1、概念 单倍体(haploid)：是指具有配子体染色体数（n） 的孢子体(植物个体)。 单倍体有一元单倍体和多元单倍体。
南瓜的单倍体和二倍体 的雄花和雌花
单倍体植物的特点：
体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器
官明显减小； 雌、雄配子严重败育，有的
生根培养：将分化出的芽苗转入含NAA的生根培 养基中，一般2周左右可形成根。
烟草花粉植株的生根培养基： 1/2 MS + 2%蔗 糖 + 0.5%琼脂。
壮苗培养：在生根培养基或基本培养基中添加 多效唑（1-3mg/L），提高蔗糖浓度（5-8%）。
培养条件： 25 ℃，光照下。
花粉植株的驯化移植
② 激素选择
烟草和毛曼陀罗：仅含蔗糖的琼脂板 茄子花药培养中： MS＋2,4-D 0.5 mg/L＋KT 1mg/L
n 93.8% 2n 6.2% MS＋2,4-D 2 mg/L ＋ KT 1mg/L
n 64,1% 2n 35.9%
③ 蔗糖：一般为3％～15％
烟草和油菜：2～3％诱导花粉胚； 水稻：3～6％诱导愈伤，分化时2～3％； 小麦：8～11％麦芽糖诱导愈伤，分化时5～8％蔗 糖； 玉米：12～15％诱导愈伤； 甘蔗：高达20％。
➢ 二，认为小孢子发育过程中花药内源激素平衡在 不断改变，随花药的成熟，激素平衡变得不适合 小孢子的生长和分裂，或脱分化必须的一些物质 被消耗尽，从而引起培养效果不佳。
花粉发育时期的确定
•鉴定花粉发育时期的方法可用涂片法来进行。 •为方便起见，可找出与花粉发育时期相对应的形 态学指标。
（3） 花药预处理
体细胞干扰 生殖细胞的自发加倍 培养过程的各种影响因素
一、单倍体的概念及其来源
1、概念 单倍体(haploid)：是指具有配子体染色体数（n） 的孢子体(植物个体)。 单倍体有一元单倍体和多元单倍体。
南瓜的单倍体和二倍体 的雄花和雌花
单倍体植物的特点：
体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器
官明显减小； 雌、雄配子严重败育，有的
生根培养：将分化出的芽苗转入含NAA的生根培 养基中，一般2周左右可形成根。
烟草花粉植株的生根培养基： 1/2 MS + 2%蔗 糖 + 0.5%琼脂。
壮苗培养：在生根培养基或基本培养基中添加 多效唑（1-3mg/L），提高蔗糖浓度（5-8%）。
培养条件： 25 ℃，光照下。
花粉植株的驯化移植
② 激素选择
烟草和毛曼陀罗：仅含蔗糖的琼脂板 茄子花药培养中： MS＋2,4-D 0.5 mg/L＋KT 1mg/L
n 93.8% 2n 6.2% MS＋2,4-D 2 mg/L ＋ KT 1mg/L
n 64,1% 2n 35.9%
③ 蔗糖：一般为3％～15％
烟草和油菜：2～3％诱导花粉胚； 水稻：3～6％诱导愈伤，分化时2～3％； 小麦：8～11％麦芽糖诱导愈伤，分化时5～8％蔗 糖； 玉米：12～15％诱导愈伤； 甘蔗：高达20％。
➢ 二，认为小孢子发育过程中花药内源激素平衡在 不断改变，随花药的成熟，激素平衡变得不适合 小孢子的生长和分裂，或脱分化必须的一些物质 被消耗尽，从而引起培养效果不佳。
花粉发育时期的确定
•鉴定花粉发育时期的方法可用涂片法来进行。 •为方便起见，可找出与花粉发育时期相对应的形 态学指标。
（3） 花药预处理
体细胞干扰 生殖细胞的自发加倍 培养过程的各种影响因素
第4章 花粉培养和单倍体育种
花药培养和单倍体育种
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第一节
相关知识基础三、花药培养的简和概况• 第一个被发现的单倍体植物是1921年Bergner在蔓陀罗植物 群体中发现的。发现单倍体植物后不久，1924 Blakeslee和 Belling就提出了在植物育种中利用单倍体减少杂交后代分离， 加速性状稳定，缩短育种年限的设想。 • 由于自然条件下出现的单倍体很少，此后育种学家和植物学 家的工作主要集中在对单倍体植株的人为诱导方面。由于当 时组织培养技术的水平还很低，直到 1964年才由Guha和 Maheshwari利用花药培养的方法在毛叶蔓陀罗这个植物种上 取得成功。
花药培养和单倍体育种
15
第二节
花药培养技术
二、选材
• 有研究结果表明，发育落后的花粉在培养条件下有发 育成愈伤组织或胚的更大可能，并将这部分花粉称为 胚性花粉。 • 在大麦中，花药下半部的异常花粉的比例比花药上半 部的比例高，因此，由花药下半部的花粉形成的愈伤 组织也比上半部要多。 • 异常花粉并不是愈伤组织的唯一起源，正常的花粉也 是可以形成愈伤组织或胚的，不过两者在对培养基的 反应程度有不同。
花药培养和单倍体育种
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第一节
相关知识基础
四、花粉的发育过程
• 减数分裂 有丝分裂 胼胝质壁溶解 • 小孢子母细胞 2个小孢子 4个小孢子 单个小孢子
• 形成大液泡，分裂 积累储藏物质 • 单个小孢子 营养细胞…………在花粉管伸长过程中退化 • + 分裂 • 生殖细胞 2个精子……（双受精）
花药培养和单倍体育种
花药培养和单倍体育种
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第二节
花药培养技术
二、选材
• 花粉发育时期的确定一般采用对花药进行染色压片后在显 微镜下观察的方法。染色的染料一般是醋酸洋红，也叫醋 酸卡红（acetocarmine）。通过染色可以简单地辨别减数分 裂前期的花粉母细胞，减数分裂后的四分体初期和后期， 单核期和双核期等。 • 在染色镜检后，通过建立花粉适当时期和植株某些器官的 发育阶段特征的联系就可以进行准确有效的选材。例如， 水稻采样的合适时期是剑叶完全抽出后剑叶叶片基部距离 前一片叶的叶片基部2-10厘米左右时；矮牵牛是花瓣开始 显色的时候。
植物花药培养
3.外植体的预处理 3.外植体的预处理
在花药接种之前，先对其进行预处理往往可以提高诱导 率。适宜的温度和时间处理可改善小抱子代谢活动，并 利于小抱子适应离体后的培养环境，促使大部分的小抱 子得以正常生长。处理时间过长，超过小抱子耐受力， 导致小抱子受伤，细胞核解体，反而降低了材料的出愈 率，影响绿苗分化% 处理时间过短，由于母体与离体培 养条件相差悬殊，小抱子在生理上不适应，同样也会造 成小抱子死亡或发育迟缓。
二、预处理与消毒
1.材料的预处理：最常用的是低温预处理，将
采取的新鲜花药用湿纱布包裹后再用塑料袋套 起，放在冰箱中预处理。不同材料所需的温度 和时间不同。 低温预处理是草莓花培养中的一个重要步骤， 其作用主要是改善花粉的生理状态， 延缓花粉 退化，提高内源激素的水平，启动雄核发育， 能显著提高花药诱导率。
75﹪酒精溶液的制备：
倒取150mL无水乙醇于500mL中，加入50mL的 蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀。
MS培养基（单位：mg/L）
NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4·H2O CaCl2·2H2O FeSO4·7H2O Na2-EDTA MnSO4·4H2O 1650 1900 170 370 440 27.85 37.25 22.3 ZnSO4·7H20 H3BO3 KI Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H20 甘氨酸 盐酸硫胺素 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 2 0.4 盐酸吡哆醇 盐酸 肌醇 蔗糖 琼脂 PH 0.5 0.5 100 30000 1000 5.8
2.培养
通常每瓶接种花药7-10个，温度控制在25℃左右，不需 要光照。幼小植株形成后才需要光照。 一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤 组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养 基上，以便进一步分化出再生植株。
(第七章)第八章植物花药(花粉)培养
第四节
花药培养
（2）材料生理状态 花药供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导 率有直接影响。 对水稻、小麦和大麦等禾本科植物而言，大田植株 比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都 明显的要高。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有 显著变化，例如：水稻，早造比晚造接种的愈伤组织诱 导率要高；烟草，开花早期比开花晚期的花药可产生更 多的花粉植株；小麦，早期接种比晚期接种的材料愈伤 组织诱导率可提高2～3倍。说明供体植株的生态环境， 特别是温度和光周期可能对花粉发育及其对离体培养的 反应有重要影响。
第二节
花药和小孢子的发育
（以烟草花粉发育过程为例，说明被子植物花粉发 育过程，P222） 第一期：小孢子母细胞经减数分裂形成孢子四 分体，随胼胝质分解，4个小孢子分离。 第二期：小孢子为球形细胞，核大，有液泡， 挤核靠边（单核靠边期），期末细胞明显增大，细 胞壁特化，小孢子进行第一次花粉细胞有丝分裂 （不对称），形成2个不均等的细胞。 第三期：小孢子细胞中有2个核。 在离体培养条件下，花粉发育偏离正常发育途 径，第一次花粉细胞有丝分裂是对称的，结果形成 两个形态和体积相等的细胞，把此作为B型。
第四节
花药培养
2、材料预处理 对所取用的穗子或花蕾，进行低温、激素（生长 素）或其他方法预处理，能有效提高愈伤组织诱导 率和苗分化率。 （1）低温预处理： 一般是将材料置于冰箱5～10℃下冷藏一定时 间再接种。处理时间视不同植物而定，水稻在5～ 10℃时为5～8天，烟草在7～9℃时为7～14天。 同种植物不同品种的要求也有差异，需作试验比较 才能确定。
第四节
花药培养
3、材料灭菌： 取回的材料，在接种前必须进行表面灭菌。一 般方法是先用70～75%酒精擦洗穗子和花蕾的外 部苞叶，然后用0.1%升汞浸泡7～10分钟（水稻、 玉米等需剥取穗子浸入消毒液）或用饱和漂白粉溶 液浸泡10～20分钟以灭菌，最后用无菌水冲洗3～ 5次，供接种用。 材料灭菌是花药培养成功与否的一个重要环节， 此关不过，谈不上什么培养。
花药离体培养获得单倍体的原理
花药离体培养获得单倍体的原理花药离体培养获得单倍体是一种常用的植物遗传学技术，其原理是利用花药中的生殖细胞在合适的培养条件下分裂分化，最终得到单倍体植株。
花药是花的雄性生殖器官，包括花粉和花丝。
花药离体培养一般以花期结束后的花药为材料，经过消毒处理后，将其放置在含有适当濃度植物生长调节剂的培养基中，控制温度、光照和湿度等条件，使其逐渐分裂分化生成胚胎或胚愈伤组织。
在特定培养基配方和培养环境的作用下，胚胎或胚愈伤组织可以继续发育，分化出合适的植株。
这种技术的优点在于可以在短时间内大批量地获得同源性强、单倍体的植株，有助于植物育种、品种改良等研究工作的开展。
同时，这种方法适用于不同种类的花卉，包括樱花、玫瑰、百合、茉莉等，可以充分利用植物遗传资源，提高植物的遗传多样性。
此技术同样适用于果树、蔬菜等植物的研究。
然而，花药离体培养也存在着一些缺点和限制。
例如由于植物细胞易被污染所致的不稳定性大、培养环境的影响等，植株的发育率和质量难以保证，需要经过精心的操作和长期的观察和培养。
此外，还要考虑到减数分裂过程中的染色体異變且难以控制，可能导致基因结构改变和表达的不正常，影响植株的生长和遗传稳定性。
总之，花药离体培养是一种有效的植物遗传学技术，可以使植物在较短时间内分化出单倍体的植株，具有重要的科研和实践价值。
但
同时也需要充分了解各种因素的影响，切实提高技术操作水平，才能达到理想的效果。
植物花药培养及单倍体植株鉴定-
四、实验步骤
1.适期花药的选择
花药中的花粉是由生殖细胞 （体细胞）经过减数分裂而来， 其染色体只是体细胞中的一半， 如果通过一定的途径将花粉培 养成植株，获得单倍体植株。 再经过染色体加倍，得到纯合 的二倍体，大大缩短育种进程。
花粉发育时期： 被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、
白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。
（二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行 调控。
3.单倍体植株的鉴定 通过花药培养获得的再生植株的染色体数目也常
发生变异，其后代常是混倍体，所以必须对其后代进 行鉴定。
鉴定方法既可以根据形态特征进行间接鉴定，也 可以镜检体细胞中的染色体数或花粉母细胞中染色体 数以及染色体配对的情况进行直接鉴定。此外还可以 根据花粉的育性或利用遗传标记性状进行鉴定。
0.5
0.05
0.5 2
200倍
0.05 0.2
5
0.5
0.05
5
0.5
0.05
0.005
类别 化合物
大 KNO3 量 NH4NO3 元 MgSO4·7H2O 素 CaCl2 ·2H2O
KH2 PO4 MnSO4·4H2O 微 ZnSO4·7H2O 量 H3BO3 元 KI 素 Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2.6H2O 铁 Na2·EDTA 盐 FeSO4·7H2O 盐酸硫胺素(B1) 有 盐酸吡哆素(B6) 机 甘氨酸 物 烟酸
醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。
四分体: 醋酸洋红染色
单核期
双核期
四分体: Alexander’s 染 色
成熟花粉粒
液泡
植物花药培养和单倍体育种
植物花药培养和单倍体育种
----------生技3091
单倍体育种
• 单倍体：是指具有配子染色体组成的 细胞或个体
获得单倍体的途径
• 1，花药培养：把整个花药接种到培养基上， 花药培养：把整个花药接种到培养基上， 在离体培养条件下， 在离体培养条件下，使其小孢子诱导形成 单倍体的孢子体。 单倍体的孢子体。 • 2，花粉培养：是把花粉从花药中分离出来 花粉培养： 接种到培养基上，在离体培养条件下， 接种到培养基上，在离体培养条件下，诱 导形成单倍体的孢子体。 导形成单倍体的孢子体。 • 3，远缘杂交授粉：利用远缘杂交不亲和， 远缘杂交授粉：利用远缘杂交不亲和， 刺激卵细胞单性发育的特点， 刺激卵细胞单性发育的特点，通过亲缘关 系较远的种间或属间杂交， 系较远的种间或属间杂交，有时可获得少 量的单倍体。 量的单倍体。
2
拜拜
hui
• 4，延迟授粉：去雄后延迟授粉，可以提高 延迟授粉：去雄后延迟授粉， 孤雌生殖的发生频率. 孤雌生殖的发生频率.
• 5，照射花粉授粉：花粉经X射线处理后， 照射花粉授粉：花粉经X射线处理后， 给去雄的母体授粉，可诱发单倍体的产生。 给去雄的母体授粉，可诱发单倍体的产生。
• 6，化学处理：用一些化学药剂处理花柱， 化学处理：用一些化学药剂处理花柱， 柱头或子房可诱导单倍体的产生。 柱头或子房可诱导单倍体的产生。
fmvkls
• 3，接种 • 在超净工作台上用镊子剥去部分花冠，露 在超净工作台上用镊子剥去部分花冠， 出花药，夹住花丝取出花药置于培养皿中， 出花药，夹住花丝取出花药置于培养皿中， 或用接种环蘸取花药接种于培养基上。接 或用接种环蘸取花药接种于培养基上。 种密度宜高，以促进“集体效应”的发挥， 种密度宜高，以促进“集体效应”的发挥， 有利于提高诱导率。 有利于提高诱导率。 • 注意： 注意： • 1,尽量避免损伤花药，以免从受伤处产生 1,尽量避免损伤花药 尽量避免损伤花药， 药壁愈伤组织。 药壁愈伤组织。 • 2，注意彻底去除花丝部分，因为接种与花 注意彻底去除花丝部分， 丝相连的花药时， 丝相连的花药时，往往不利于花药内小孢 子的启动，以及愈伤组织或胚状体的形成。 子的启动，以及愈伤组织或胚状体的形成。
----------生技3091
单倍体育种
• 单倍体：是指具有配子染色体组成的 细胞或个体
获得单倍体的途径
• 1，花药培养：把整个花药接种到培养基上， 花药培养：把整个花药接种到培养基上， 在离体培养条件下， 在离体培养条件下，使其小孢子诱导形成 单倍体的孢子体。 单倍体的孢子体。 • 2，花粉培养：是把花粉从花药中分离出来 花粉培养： 接种到培养基上，在离体培养条件下， 接种到培养基上，在离体培养条件下，诱 导形成单倍体的孢子体。 导形成单倍体的孢子体。 • 3，远缘杂交授粉：利用远缘杂交不亲和， 远缘杂交授粉：利用远缘杂交不亲和， 刺激卵细胞单性发育的特点， 刺激卵细胞单性发育的特点，通过亲缘关 系较远的种间或属间杂交， 系较远的种间或属间杂交，有时可获得少 量的单倍体。 量的单倍体。
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• 4，延迟授粉：去雄后延迟授粉，可以提高 延迟授粉：去雄后延迟授粉， 孤雌生殖的发生频率. 孤雌生殖的发生频率.
• 5，照射花粉授粉：花粉经X射线处理后， 照射花粉授粉：花粉经X射线处理后， 给去雄的母体授粉，可诱发单倍体的产生。 给去雄的母体授粉，可诱发单倍体的产生。
• 6，化学处理：用一些化学药剂处理花柱， 化学处理：用一些化学药剂处理花柱， 柱头或子房可诱导单倍体的产生。 柱头或子房可诱导单倍体的产生。
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• 3，接种 • 在超净工作台上用镊子剥去部分花冠，露 在超净工作台上用镊子剥去部分花冠， 出花药，夹住花丝取出花药置于培养皿中， 出花药，夹住花丝取出花药置于培养皿中， 或用接种环蘸取花药接种于培养基上。接 或用接种环蘸取花药接种于培养基上。 种密度宜高，以促进“集体效应”的发挥， 种密度宜高，以促进“集体效应”的发挥， 有利于提高诱导率。 有利于提高诱导率。 • 注意： 注意： • 1,尽量避免损伤花药，以免从受伤处产生 1,尽量避免损伤花药 尽量避免损伤花药， 药壁愈伤组织。 药壁愈伤组织。 • 2，注意彻底去除花丝部分，因为接种与花 注意彻底去除花丝部分， 丝相连的花药时， 丝相连的花药时，往往不利于花药内小孢 子的启动，以及愈伤组织或胚状体的形成。 子的启动，以及愈伤组织或胚状体的形成。
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四、实验步骤
1.适期花药的选择
花药中的花粉是由生殖细胞
（体细胞）经过减数分裂而来，
其染色体只是体细胞中的一半， 如果通过一定的途径将花粉培 养成植株，获得单倍体植株。 再经过染色体加倍，得到纯合
的二倍体，大大缩短育种进程。
花粉发育时期： 被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、 二核期和三核期（雄配子期）4个时期。
处于不同发育阶段的烟草花芽
不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期 发育时期 减数分裂期 四分孢子期 单核早中期 草莓、番茄 葡萄 石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯 物种
单核晚期
单核早期至晚期 单核早期至双核期
荔枝、茄子、青椒、小麦
烟草 梨、水稻、甘蓝
四分孢子期至双核期 玉米
2.花药离体培养
（1）取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适 宜的花蕾。（考虑供体植物基因型、生理状态） （2）消毒 70％酒精擦洗花蕾表面，70％酒精浸泡1530s后，在1％次氯酸钠溶液中浸泡8-10min或在0.1％的 氯化汞溶液中消毒8-10min，无菌水冲洗3-5次。 （3）接种 剥去萼片和花瓣，将花药取出。去除花丝， 但不应使花药受到损伤。 （4）培养 先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形 成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3 周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。
一、实验目的与原理
目的： 掌握植物花药离体培养技术； 掌握单倍体植株鉴定的方法； 了解单倍体育种的意义。 原理： 利用组织培养技术对植物花药进行离体 培养，诱导产生再生植株。通过形态观察 和染色体分析鉴定单倍体植株，作为新的 遗传资源和选择材料。
花药培养基本流程：
选择合适的供体植株
预处理花药（物理或生理逆境） 收集具有胚性小孢子的花药 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体
烟草花药培养，4℃低温预处理2-3天。
② 培养基
主要为MS、H、N6、B5和Nitsch培养基，在此 基础上发展出一些其它的培养基。 H培养基（基本成分+ 6-BA/KT 2mg/L+ NAA/2,4-D 0.2mg/L+ 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂+ 1g/L活性炭，pH值 5.5-5.8）上诱导愈伤组织；愈伤组织形成后转移到H培 养基（ 基本成分+ NAA 2mg/L+ 6-BA 0.2mg/L+ 20g/L 蔗糖+ 7g/L琼脂）上分化成苗。 1/2 MS培养基+ 激素+ 蔗糖+ 琼脂+ 活性炭
高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。
铁盐对花粉胚状体发育很重要。
活性炭促进胚状体发育。
较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；
较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。
细胞分裂素可促进胚状体形成；
生长素可诱导愈伤组织形成。
细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗。
氨基酸 有机附加物
H培养基的配制
胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株
单倍体植株鉴定
二、实验内容
1、镜检花粉发育时期
2、花药离体培养 2.1 取样 2.2 消毒 2.3 接种 2.4 培养
3、单倍体植株的鉴定
三、实验器材
材料：烟草花药。 试剂：MS培养基、N6培养基、B5培养基、 酒精、2,4-D、NAA、KT、蔗糖、醋酸洋红、 蒸馏水。 仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普 通光学显微镜、微波炉、pH计、培养箱、 超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、 解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、 橡皮筋、低温冰箱。
植物花药培养及单倍体植株鉴定
20学时
高俊山
安徽农业大学生命科学学院
花药培养：是指将未成熟的花药接种 在人工培养基上分化成为植株的过程。 属于器官培养。
供体植株 小孢子（n）
பைடு நூலகம்
花培
雄核发育
花粉植株 （ n）
自然加倍 人工加倍
纯合植株DH （2n）
一年内获得纯系
常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。
一般而言，单核期（第一次有丝 分裂前）对诱导反应最敏感，为 最佳培养期。
形成双核后，在合适的条件下， 主要由营养细胞分裂产生胚状体 。
营养细胞
生殖细胞
精子
花粉的发育
花药切片显微观察
单核靠边期
四分体时期
烟草花粉发育时期的检测： 一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加1-2滴1% 醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。
类别
大 量 元 素 化合物 KNO3 NH4NO3 MgSO4· 7H2O CaCl2 · 2H2O KH2 PO4 MnSO4· 4H2O ZnSO4· 7H2O H3BO3 Na2MoO4· 2H2O CuSO4· 5H2O Na2· EDTA FeSO4· 7H2O 盐酸硫胺素(B1) 盐酸吡哆素(B6) 甘氨酸 叶酸 烟酸 生物素(维生素H) 培养基浓度 (mg/L) 950 720 185 166 68 25 10 10 0.25 0.025 37.3 27.8 0.5 0.5 2 0.5 5 0.05 母液扩大 500mL 母 液 每 升 培 养 基 取 倍数 中药品量(g) 母液的量(ml) 9.5 7.2 50 20倍 1.85 1.66 0.68 2.5 1.0 5 200倍 1.0 0.025 0.0025 3.73 5 200倍 2.78 0.05 0.05 5 200倍 0.2 0.05 0.5 0.005
花药培养过程
消毒
预处理 取花药 培养 接种
取花蕾（镜检）
愈伤组织发生
① 预处理
• 预处理是小孢子培养成功的前提条件。
• 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能
多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径
（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理 能使绿苗产量大量增加。 • 预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理， 包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。
四分体: 醋酸洋红染色
单核期
双核期
四分体: Alexander’s 染色
成熟花粉粒
液泡
单核晚期
第一次有丝分裂后期
生殖核
营养核 生殖核 双核早期 双核中期
烟草花粉发育时期的确定
烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。
从烟草花的外部形态变化来看，
当花蕾的花冠长度与花萼的长
度相等时，花药里面的多数花 粉粒正处于单核靠边的阶段。