毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用
适配体筛选方法研究进展
适配体筛选方法研究进展王巍 贾凌云*(大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系,大连116023)摘 要 利用指数富集配体进化技术(SELEX )可获得与目标靶具有特异性结合能力的适配体(寡核苷酸)。
经过近20年的研究,适配体被证实可在科研及临床应用中部分取代抗体,是有很大发展前景的技术领域。
适配体技术发展的关键在于对目标靶具有高选择性吸附能力的适配体的筛选和获得。
十几年来,以提高筛选效率和效果为目标的适配体筛选技术不断改进,产生了如消减筛选、复合靶筛选、基因组筛选、毛细管筛选等新方法,推动了这一技术的发展。
本文对现有适配体筛选方法进行了系统的评述。
关键词 适配体,指数富集配体进化技术,筛选方法,评述2008-09-08收稿;2008-10-26接受本文系国家自然科学基金(N o .20435020)资助项目*E-m ai:l l y j 81@dlut 1 引 言适配体的概念在1990年由Tuer k 等[1]首次提出,是指利用指数富集的配体进化技术(syste m atic evo l u tion o f li g ands by exponentia l enr i c hm en,t SELEX )从特定的寡核苷酸库中筛选出对目标靶有特异性相互作用的寡核苷酸(DNA 或RNA )。
与传统的抗体相比,适配体具有以下特点和优势:(1)对目标靶分子具有与抗体相当甚至更高的亲和性;(2)可以大量、快速的在体外合成,制备方法更为简单快捷;(3)可以针对不同种类的目标靶进行筛选,包括生物毒性的分子以及只具有半抗原性的分子,拓宽了其应用范围;(4)稳定性优于抗体,利于储存。
基于适配体的上述优良特性,其在疾病检测、药物研发、临床治疗、分析化学、蛋白质组学以及基因表达调控机理研究等多个领域都有着良好的应用前景。
目前,限制适配体技术应用的瓶颈问题仍是适配体的有效筛选技术。
希望通过本篇对现存适配体筛选方法的分析与评述,为进一步解决适配体筛选技术中存在的不足提供参考。
复合靶指数富集的配基系统进化技术研究进展
复合靶指数富集的配基系统进化技术研究进展武振宁;薛书江;杨咏洁【摘要】核酸适配体是一类具有高度特异性和亲和力的单链寡核苷酸,被誉为\"人工单抗\",具有广阔的应用前景.它一般是通过指数富集的配基系统进化(SELEX)技术筛选获得.目前SELEX技术多局限于单一、纯化的可溶性蛋白质靶标.然而,蛋白质的纯化过程繁琐,耗时费力,而且很多靶标(如血清中的低丰度蛋白质或细胞的膜蛋白)很难纯化获得单一纯品.复合靶SELEX技术则可以避免靶标的纯化过程,能够保持靶标的天然构象,并且可以在未明确靶标的组成及结构特性的前提下,通过高通量的盲筛获得一系列特异性核酸适配体.该文主要介绍以未纯化的各种生物样本为复合靶的SELEX技术,以期为核酸适配体的筛选提供新思路.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2018(036)010【总页数】5页(P947-951)【关键词】复合靶;核酸适配体;指数富集的配基系统进化;筛选;综述【作者】武振宁;薛书江;杨咏洁【作者单位】延边大学农学院,吉林延吉 133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉 133002【正文语种】中文【中图分类】O658核酸适配体是一类新的、具有高度特异性和亲和性的单链寡核苷酸(single-stranded DNA (ssDNA)或RNA),可发生适应性折叠形成特殊的三维结构(如发夹、假结、凸环、G-四分体等)[1]。
这些特殊的三维结构使核酸适配体具有高度的分子识别能力,能够与靶物质特异性结合。
这种特异性可与单克隆抗体相媲美,因此,被誉为“人工单抗”。
除了高度的特异性和亲和力之外,核酸适配体还具有筛选周期短、易制备、易修饰、热稳定性和重复性好、无免疫原性等优点[2]。
基于上述优良特性,核酸适配体在临床诊断[3-6]、药物研发[7,8]、疾病治疗[4,9,10]等领域极具应用前景。
凡是涉及单抗的应用领域,几乎都可以用核酸适配体来取代。
毛细管电泳技术的研究应用
毛细管电泳技术的研究应用作者：貟亚培宋荣娜来源：《山东工业技术》2015年第17期（黄淮学院，河南驻马店 463000）摘要：毛细管电泳（CE）技术是一种方便、快速的分离和分析技术，是当前分析化学前沿领域和研究重点之一，其具有操作步骤简单、分析时间短、检测灵敏度高、环境污染小等优点。
本文介绍了毛细管电泳技术的基本原理和其在中药、食品安全健康、临床医学、生命科学等几个方面的应用及其展望，从而加深对毛细管电泳技术的了解。
关键词：毛细管电泳;原理;应用;展望1 概述毛细管电泳又称高效毛细管电泳，包括电泳、色谱及其交叉内容，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性为根据的液相微分离分析技术。
CE是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析乃至单分子分析成为可能。
1983年，Hjerten先后提出了毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦法，不仅大幅度提高了电泳效率，而且使之可以成为操作自动化，便于进行定性和定量工作。
现在，毛细管电泳已经成为一种相当普遍的微量分离分析方法。
随着相关标准方法的建立和推广应用，毛细管电泳已逐渐成为某些标准和常规的分析方法。
2 毛细管电泳分离技术的基本原理在电场的作用下根据离子的迁移速度不同，以高压电场为驱动力，以内径10-100μm的毛细管为工具对样品组份进行分离和分析，毛细管电泳技术采用熔融石英管毛细管柱，石英管外包裹聚酰亚胺涂层以保持石英管的弹性，毛细管的内径达到微米级。
因此，一方面可以分析量非常少的样品如单细胞组份的分析，另一方面因为比表面积大，横截半径小，具有较快的散热速度，克服了传统电泳散热效率差而不能采用高电场分离的问题。
在毛细管电泳分离过程中，样品分子的迁移是有效电泳速度和电渗速度的综合表现。
由于在毛细管中电渗速度比电泳速度大一个数量级，因此能实现样品组份同向泳动。
3 毛细管电泳技术的应用3.1 在中药方面的应用毛细管电泳技术（CE）应用到药学等领域是在八十年代后期出现的，其最高柱效可达到105个理论板数，最高灵敏度可以达到10-19 mol，有区带电泳，凝胶电泳等多种模式。
适配体
适配体的类型：
★反义核苷酸链 ★随机核苷酸链
反义核苷酸链
通常包含15-20个核苷酸,其碱基组成与 它们的靶序列是互补的。但是在实际应用中, 存在反义寡核苷酸容易被核酸酶降解、对特 定靶位点的识别不够好、有一定毒性等问题, 所以要对适配体中的核苷酸进行了各种各样 的化学修饰。修饰位点一般在碱基、磷酸骨 架等。★
前景与展望
正是基于寡核苷酸适配体的高特异性、高亲和 力、易体外合成及修饰等特性,寡核苷酸适配体可作 为配基应用于靶分子的分离;其高特异性和高亲和力 地与靶分子结合特性使其可应用于靶分子的捕获;适 配体还被用作分子信标定量检测靶分子。适配体在 分析化学,在蛋白质组研究、临床医学、药物研发及 基因调控等领域已经成为重要的研究工具。随着寡 核苷酸适配体的研究进展,以及在多学科之间的广泛 渗透,其在许多领域将具有更广泛的应用前景。
通过筛选获得的特异识别肿瘤细胞的适配 体,本身就可在不需要知道正常细胞和肿瘤细 胞之间的差异成分的情况下,直接用于肿瘤的 诊断和导向治疗。而这些适配体所特异结合 的蛋白质或其它成分正是正常细胞和肿瘤细 胞之间的差异成份,因此只要能够将这些差异 成分进行纯化、鉴定和检测,新的分子标志物 就有可能被发现,它们有可能成为新的特异性 肿瘤标志物。
亲和介质筛选：一些具有亲和表面的介
质也用于适配体的筛选,如琼脂糖、纤维素及 具有亲和表面的小珠或小柱等。利用这些亲 和介质可以筛选一些小分子物质,如金属、毒 素的适配体。 ★
CE-SELEX
毛细管电泳为基础的SELEX技
术(CE-SELEX),在众多改进的适配体筛选方法 中发展较快。该方法最显著的特点是整个筛 选过程只需要4个循环。
SELEX技术大致可以分为以下几步:
①建立寡核苷酸库。 ②适配体的筛选、分离和EX筛选技术
毛细管电泳技术在生物医学领域中的应用
毛细管电泳技术在生物医学领域中的应用随着生物医学领域的不断发展，越来越多的医学研究需要用到高效、准确的分析方法。
毛细管电泳技术作为一种高效、低成本、快速而且对样品无损的检测方法，在生物医学领域得到了广泛的应用。
本文将从毛细管电泳技术的原理、优势和应用方面进行探讨。
一、毛细管电泳技术的原理毛细管电泳技术是利用毛细管内表面电荷的存在、电场的作用和离子在电场中的迁移速度差异，将样品中的各种离子或分子进行分离的一种技术。
毛细管的内壁带有固定电荷，当毛细管两端通以电荷正负相间的电场后，样品中的负离子会被向阳极迁移，正离子则会被向阴极迁移。
由于不同分子的离子迁移速度差异不同，因此，分离出来的分子具有不同的速度，最终在毛细管中形成一道道不同的峰。
二、毛细管电泳技术的优势毛细管电泳技术具有以下优势：1、高效快速：毛细管电泳技术的分离效率高、分离速度快，可在短时间内完成样品分析。
2、高分离效果：毛细管电泳技术的分离效果好，能分离出非常相似的分子，如同构体和同分异构体等，并且可对几百种物质进行同时分离。
3、低成本：毛细管电泳技术所需成本相对较低，并且无需大型设备和复杂的仪器。
4、无损害：毛细管电泳技术对样品不会造成损害，并且可对生物大分子进行分离。
三、毛细管电泳技术在生物医学领域中已经得到了广泛的应用，其中包括：1、蛋白质分离和鉴定：毛细管电泳技术与质谱技术结合，可以快速高效地实现蛋白质的分离和鉴定。
毛细管电泳技术分离出的蛋白质样品可以与其他分析技术结合，如质谱技术，以进行更深入的分析。
2、核酸分离和鉴定：毛细管电泳技术可用于对DNA、RNA、mRNA和寡核苷酸等的分离和鉴定。
在分离和鉴定这些分子时，毛细管电泳技术在速度和准确性方面具有独特的优势。
此外，该技术还可用于药物筛选和基因检测等领域。
3、药物代谢研究：毛细管电泳技术可用于研究潜在的药物代谢通路。
通过毛细管电泳技术的高效分离，可以分离并鉴定药物代谢产物及其结构，并在药效学和毒理学方面提供有用的信息。
基于毛细管电泳的核酸检测技术研究
基于毛细管电泳的核酸检测技术研究核酸检测技术是生物学、医学、环境科学等领域中广泛应用的技术之一。
在当前的公共卫生事件中，核酸检测技术在新冠病毒检测中发挥了重要作用。
毛细管电泳技术是一种基于电动力的分离技术，被广泛地应用于DNA、RNA、蛋白质等大分子的分离和定量。
一、毛细管电泳技术原理毛细管电泳技术是一种基于电动力的分离技术。
其原理是在外加电压的驱动下，带电的溶液在狭窄的毛细管内迁移，满足库仑定律。
库仑定律是一个描述电荷之间相互作用的经典定律，其原理简单而清晰。
异号电荷之间的作用力为吸引力，同号电荷之间的作用力为排斥力，而电荷的大小与电荷之间的距离成反比例。
在电泳实验中，样品分子内的分子量、电荷和电场力是影响分离效果的主要因素。
毛细管电泳速度与分子电荷密度成正比，与分子质量和粘度成反比。
这就使得毛细管电泳技术成为了检测大分子样品分子量、分子结构和化学性质的理想方法。
二、毛细管电泳技术在核酸检测中的应用在核酸检测中，毛细管电泳技术的应用几乎已经普及化了。
其基本步骤包括：DNA或RNA样品进行电泳分离、电流检测、信号收集和数据分析。
毛细管电泳技术可定量检测DNA或RNA的分子量和数量，也可以实现样品的快速、准确、高通量的分析。
尽管毛细管电泳技术已经成为核酸检测领域中的主流技术，但是其仍然存在一些局限。
例如，仅能对某些特定的DNA或RNA进行分析，对于一些形态复杂的分子仍然难以实现快速、高通量的检测。
三、毛细管电泳技术的发展趋势随着生物技术的发展，毛细管电泳技术也在不断地发展和改进。
如今，毛细管电泳技术已经具备一些新的应用和发展趋势。
1. 网络电泳技术网络电泳技术是一种基于网络化点阵电场驱动的电泳技术。
不同于毛细管电泳技术中的一维电场环境，在网络电泳技术中样品受到的是一个三维的电场环境。
这种技术在核酸检测中具有更高的分离分辨率和更高的灵敏度。
2. 微芯片电泳技术微芯片电泳技术是毛细管电泳技术的另一种延伸。
A 毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用
收稿:2008年8月,收修改稿:2008年9月*国家自然科学基金项目(No.20875009)和国家重点基础研究发展规划(973)项目(No.2007CB914101)资助**Corresp onding author e -mail:qufengqu@毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用*屈 锋1**刘 允1任肖敏1赵新颖2张经华2(1.北京理工大学生命科学与技术学院 北京100081; 2.北京市理化分析测试中心 北京100089)摘 要 核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化(SELE X)技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的高亲和性与特异性的寡核苷酸序列配体。
毛细管电泳是高效、快速、低成本的微量分离分析技术。
应用毛细管电泳高效、快速筛选核酸适配体是近几年出现的新方法。
本文介绍了核酸适配体筛选过程中的主要分离方法如亲和色谱、醋酸纤维素膜、凝胶电泳和磁性分离等方法,并对近年来毛细管电泳在核酸适配体中的亲和作用研究以及用于核酸适配体筛选(CE -SE LEX)的主要方法(EC EEM,NECEE M,Non -SELEX 和三者比较)和研究进展进行了综述。
关键词 核酸适配体 毛细管电泳 核酸适配体筛选中图分类号:O65718;Q524 文献标识码:A 文章编号:1005-281X(2009)07P 8-1576-07Application of Capillary Electrophoresis in AptamersStudy and Aptamers SievingQ Feng1**Liu Yun 1 Ren Xiaomin 1 Zhao Xinying 2 Zhang Jinghua2(1.School of Life Science &Tec hnology,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,China;2.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis,Beijing 100089,C hina)Abstract Aptamers,DNA or RNA oligonucleotides obtains by syste matic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)from a random oligonucleotide library,which exhibit high affinity and specificity to a wide variety of targets.Capillary electrophoresis,a micro -separation method with advantages of high performance,high speed and lowcost,has been applied in aptamers sieving in recent years.This article introduces the separation methods in aptamers sieving process such as affinity chromatography,nitrocellulose filter,gel electrophoresis,magnetic bead separation and so on.The aptamer affinity interaction studied by capillary electrophoresis,the methods of CE -SELEX (EC EEM,NECE EM,Non -SELEX and comparison of them)in aptamer sieving and advances of CE -SE LEX are reviewed.Key words aptamers;capillary electrophoresis;apta mer sie vingContents1 Introduction2 Separation methods in SELEX3 Studied of aptamers affinity interaction by capillaryelectrophoresis4 Capillary electrophoresis methods in aptamers sieving411 NECEE M 412 ECEE M 413 Non -SELEX414 Comparison of NECEE M,ECEE M and Non -SE LEX 5 Application of CE in aptamers sieving 6 Prospects第21卷第7P 8期2009年8月化 学 进 展PROGRESS I N C HE MISTRYVol.21No.7P 8 Aug.,20091引言SELEX技术(syste matic evolution of ligands by e xponential enrichment),即指数富集配体系统进化技术,通过靶分子与大容量化学合成的随机寡核苷酸(主要是ssDNA和RNA)文库作用,将所形成的靶分子-寡核苷酸复合物与游离寡核苷酸分离,再利用PC R体外扩增技术对形成复合物的寡核苷酸进行扩增。
寡核苷酸适配体的筛选及在农兽药残留检测中的应用
寡核苷酸适配体的筛选及在农兽药残留检测中的应用适配体是一类从随机寡核苷酸文库中筛选出来的可对特定靶分子具有高亲和性和特异识别性的单链短脱氧核糖核酸或核糖核酸序列。
以下是适配体筛选的简要过程：
1. 构建随机寡核苷酸文库。
2. 将文库与靶分子孵育，使文库中的寡核苷酸序列与靶分子结合。
3. 通过特定的分离手段，将结合的寡核苷酸序列与未结合的寡核苷酸序列分开。
4. 经过多轮重复上述过程，富集具有高亲和性和特异识别性的寡核苷酸序列，得到适配体。
在农兽药残留检测中，适配体通常与其他可以产生信号的材料如纳米金、量子点等构成复合探针，或与电化学电极等构成传感器，用于检测食品和环境中的农兽药残留。
此外，还有基于毛细管电泳分离手段的SELEX或非SELEX筛选方法。
其中，基于毛细管电泳(CE)的SELEX具有高效分离选择性特点，使筛选的效率大大提高，一般仅需2\~4轮即可达到SELEX 8\~15轮的富集效率。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询专业人士。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
收稿:2008年8月,收修改稿:2008年9月 3国家自然科学基金项目(N o.20875009)和国家重点基础研究发展规划(973)项目(N o.2007C B914101)资助33C orresponding author e 2mail :qu fengqu @毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用3屈 锋133 刘 允1 任肖敏1 赵新颖2 张经华2(1.北京理工大学生命科学与技术学院 北京100081;2.北京市理化分析测试中心 北京100089)摘 要 核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化(SE LEX )技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的高亲和性与特异性的寡核苷酸序列配体。
毛细管电泳是高效、快速、低成本的微量分离分析技术。
应用毛细管电泳高效、快速筛选核酸适配体是近几年出现的新方法。
本文介绍了核酸适配体筛选过程中的主要分离方法如亲和色谱、醋酸纤维素膜、凝胶电泳和磁性分离等方法,并对近年来毛细管电泳在核酸适配体中的亲和作用研究以及用于核酸适配体筛选(CE 2SE LEX )的主要方法(ECEE M ,NECEE M ,N on 2SE LEX 和三者比较)和研究进展进行了综述。
关键词 核酸适配体 毛细管电泳 核酸适配体筛选中图分类号:O65718;Q524 文献标识码:A 文章编号:10052281X (2009)07Π821576207Application of C apillary E lectrophoresis in AptamersStudy and Aptamers SievingQ üFeng133 Liu Yun 1 Ren Xiaomin 1 Zhao Xinying 2 Zhang Jinghua2(1.School of Life Science &T echnology ,Beijing Institute of T echnology ,Beijing 100081,China ;2.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis ,Beijing 100089,China )Abstract Aptamers ,DNA or RNA olig onucleotides obtains by systematic ev olution of ligands by exponential enrichment (SE LEX )from a random olig onucleotide library ,which exhibit high affinity and specificity to a wide variety of targets.Capillary electrophoresis ,a micro 2separation method with advantages of high performance ,high speed and low cost ,has been applied in aptamers sieving in recent years.This article introduces the separation methods in aptamers sieving process such as affinity chromatography ,nitrocellulose filter ,gel electrophoresis ,magnetic bead separation and s o on.The aptamer affinity interaction studied by capillary electrophoresis ,the methods of CE 2SE LEX (ECEE M ,NECEE M ,N on 2SE LEX and com paris on of them )in aptamer sieving and advances of CE 2SE LEX are reviewed.K ey w ords aptamers ;capillary electrophoresis ;aptamer sievingContents1 Introduction2 Separation methods in SE LEX3 Studied of aptamers affinity interaction by capillaryelectrophoresis4 Capillary electrophoresis methods in aptamers sieving411 NECEE M 412 ECEE M 413 N on 2SE LEX414 C om paris on of NECEE M ,ECEE M and N on 2SE LEX 5 Application of CE in aptamers sieving 6 Prospects第21卷第7Π8期2009年8月化 学 进 展PROG RESS I N CHE MISTRYV ol.21N o.7Π8 Aug.,20091 引言SE LEX技术(systematic ev olution of ligands by exponential enrichment),即指数富集配体系统进化技术,通过靶分子与大容量化学合成的随机寡核苷酸(主要是ssDNA和RNA)文库作用,将所形成的靶分子2寡核苷酸复合物与游离寡核苷酸分离,再利用PCR体外扩增技术对形成复合物的寡核苷酸进行扩增。
通过对可与靶分子特异结合的寡核苷酸进行数轮反复的体外筛选、扩增,达到指数级富集的效果,最终获得与靶分子有特异结合作用的核酸适配体。
1990年,Tuerk[1]和E llington等[2]先后筛选出针对不同靶分子并具有独特结构的RNA和ssDNA序列,并将其称为“aptamer”。
Tuerk[1]研究了噬菌体T4 DNA聚合酶(gp43)与mRNA的核糖体结合位点的相互作用,并从含110bp的随机RNA库中筛选出了gp43的RNA aptamer。
E llington等[2]从含150bp随机序列的RNA库中筛选出6种有机小分子染料(cibacron blue3G A,reactive red120,reactive yellow86, reactive brown10,reactive green19和reactive blue4)的aptamer。
1992年,E llington等[3]又从一个含157bp 的随机序列ssDNA库中筛选出3种染料(cibacron blue、reactive green19和reactive blue4)的aptamer。
尽管ssDNA和RNA有所差别,但SE LEX技术筛选到的ssDNA aptamer与RNA aptamer都是以相同方式识别和结合靶分子,都是通过寡核苷酸链内碱基相互作用折叠形成稳定的特殊三维结构,如发卡、假结、凸环、G2分体等,并构成了与靶分子的特异结合位点。
与一般的亲和作用配体相比,aptamer的亲和力高,特异性强,稳定性好,而且容易制备及修饰。
此外aptamer所针对的靶分子范围极广,蛋白质类分子(受体蛋白、酶、膜蛋白、抗体、生长因子等)、激素、肽、药物分子、糖、有机染料及小分子、无机离子等理论上均存在其对应的aptamer。
Aptamer具有高度的分子识别能力,其与靶分子结合的特异性可与抗体媲美。
由于它是通过化学合成获得,故不仅稳定性明显优于抗体,而且比抗体更容易制备。
在疾病诊断和药物治疗等领域的应用研究中,aptamer与抗体相比,其分子量小,因此更易穿过细胞膜,具有易被血液清除且无免疫原性等突出优点[4]。
因此aptamer被誉为“人工抗体”。
Aptamer的获得依赖于SE LEX技术的应用。
在筛选aptamer过程中,高效快速的分离游离寡核苷酸和aptamer2靶分子复合物是提高筛选速度和效率的关键,也是限制SE LEX技术发展的一个难点。
毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)作为一种微量分析方法已广泛应用于各种生物大分子、药物分子、有机酸和无机离子的分析,且具有分离速度快、分辨率高、操作简单、样品用量少和研究成本低等明显优势。
CE还是研究靶分子与配体亲和作用的重要方法之一。
近几年的研究结果表明CE用于aptamer的筛选可使筛选效率和筛选速度大大提高,是一种新的高效筛选方法(CE2SE LEX)。
2 SE LEX筛选中的分离方法SE LEX技术筛选aptamer的筛选过程是:(1)通过化学合成的方法制备一个寡核苷酸库,对于一个碱基数为n的寡核苷酸库,它包含4n个不同的寡核苷酸序列。
这些单链核苷酸由于链内碱基间的配对、静电作用及氢键作用等发生自身折叠,形成一些稳定的三维空间结构。
(2)将这些具有空间结构的寡核苷酸序列与靶分子作用,结合形成稳定的复合物。
(3)选择适宜的分离方法将结合靶分子的序列与未结合靶分子的序列分离,收集与靶分子结合的寡核苷酸分子。
(4)以结合的寡核苷酸分子为模板进行PCR扩增,获得一个亲和性更强的新的寡核苷酸库。
将此新库用于下一轮筛选,如此进行多次循环,最后对所得的序列进行测序。
在aptamer筛选过程中,随着循环次数的增加,富集到靶分子上的DNA或RNA序列的亲和作用越来越强,直到其亲和作用达到饱和,即富集到的DNA或RNA序列占据了靶分子上所有的结合位点,由此产生了高亲和力的aptamer。
应用SE LEX技术筛选aptamer的关键步骤之一是对结合靶分子的序列与未结合靶分子序列进行高效分离。
亲和色谱是常用的分离方法之一,即将大量靶分子固定在琼脂糖或葡聚糖固定相上,使寡核苷酸库溶液作为流动相通过。
溶液中的寡核苷酸与靶分子发生亲和作用而结合到固定相上,再将结合的寡核苷酸进行洗脱,即可得到aptamer。
在亲和色谱分离中,靶分子能否有效地固定在固定相上以及对aptamer的洗脱决定了分离的效率。
Storm o等[5]以锌指蛋白EG R为靶分子进行aptamer筛选,指出亲和色谱法作为SE LEX技术中的分离方法可以有效地获得更多的DNA结合位点,且aptamer2蛋白质复合物易于与游离DNA分离。
硝酸纤维素膜超滤法是另一种较常用的分离方法。
一定孔径的硝酸纤维素超滤膜可以选择性地截留复合物而使游离的寡・7751・第7Π8期屈 锋等 毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用核苷酸序列通过,从而达到分离结合靶分子的序列与游离序列的目的。