毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用
收稿:2008年8月,收修改稿:2008年9月 3国家自然科学基金项目(N o.20875009)和国家重点基础研究发展规划(973)项目(N o.2007C B914101)资助33C orresponding author e 2mail :qu fengqu @毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用3屈 锋133 刘 允1 任肖敏1 赵新颖2 张经华2(1.北京理工大学生命科学与技术学院 北京100081;2.北京市理化分析测试中心 北京100089)摘 要 核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化(SE LEX )技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的高亲和性与特异性的寡核苷酸序列配体。
毛细管电泳是高效、快速、低成本的微量分离分析技术。
应用毛细管电泳高效、快速筛选核酸适配体是近几年出现的新方法。
本文介绍了核酸适配体筛选过程中的主要分离方法如亲和色谱、醋酸纤维素膜、凝胶电泳和磁性分离等方法,并对近年来毛细管电泳在核酸适配体中的亲和作用研究以及用于核酸适配体筛选(CE 2SE LEX )的主要方法(ECEE M ,NECEE M ,N on 2SE LEX 和三者比较)和研究进展进行了综述。
关键词 核酸适配体 毛细管电泳 核酸适配体筛选中图分类号:O65718;Q524 文献标识码:A 文章编号:10052281X (2009)07Π821576207Application of C apillary E lectrophoresis in AptamersStudy and Aptamers SievingQ üFeng133 Liu Yun 1 Ren Xiaomin 1 Zhao Xinying 2 Zhang Jinghua2(1.School of Life Science &T echnology ,Beijing Institute of T echnology ,Beijing 100081,China ;2.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis ,Beijing 100089,China )Abstract Aptamers ,DNA or RNA olig onucleotides obtains by systematic ev olution of ligands by exponential enrichment (SE LEX )from a random olig onucleotide library ,which exhibit high affinity and specificity to a wide variety of targets.Capillary electrophoresis ,a micro 2separation method with advantages of high performance ,high speed and low cost ,has been applied in aptamers sieving in recent years.This article introduces the separation methods in aptamers sieving process such as affinity chromatography ,nitrocellulose filter ,gel electrophoresis ,magnetic bead separation and s o on.The aptamer affinity interaction studied by capillary electrophoresis ,the methods of CE 2SE LEX (ECEE M ,NECEE M ,N on 2SE LEX and com paris on of them )in aptamer sieving and advances of CE 2SE LEX are reviewed.K ey w ords aptamers ;capillary electrophoresis ;aptamer sievingContents1 Introduction2 Separation methods in SE LEX3 Studied of aptamers affinity interaction by capillaryelectrophoresis4 Capillary electrophoresis methods in aptamers sieving411 NECEE M 412 ECEE M 413 N on 2SE LEX414 C om paris on of NECEE M ,ECEE M and N on 2SE LEX 5 Application of CE in aptamers sieving 6 Prospects第21卷第7Π8期2009年8月化 学 进 展PROG RESS I N CHE MISTRYV ol.21N o.7Π8 Aug.,20091 引言SE LEX技术(systematic ev olution of ligands by exponential enrichment),即指数富集配体系统进化技术,通过靶分子与大容量化学合成的随机寡核苷酸(主要是ssDNA和RNA)文库作用,将所形成的靶分子2寡核苷酸复合物与游离寡核苷酸分离,再利用PCR体外扩增技术对形成复合物的寡核苷酸进行扩增。
通过对可与靶分子特异结合的寡核苷酸进行数轮反复的体外筛选、扩增,达到指数级富集的效果,最终获得与靶分子有特异结合作用的核酸适配体。
1990年,Tuerk[1]和E llington等[2]先后筛选出针对不同靶分子并具有独特结构的RNA和ssDNA序列,并将其称为“aptamer”。
Tuerk[1]研究了噬菌体T4 DNA聚合酶(gp43)与mRNA的核糖体结合位点的相互作用,并从含110bp的随机RNA库中筛选出了gp43的RNA aptamer。
E llington等[2]从含150bp随机序列的RNA库中筛选出6种有机小分子染料(cibacron blue3G A,reactive red120,reactive yellow86, reactive brown10,reactive green19和reactive blue4)的aptamer。
1992年,E llington等[3]又从一个含157bp 的随机序列ssDNA库中筛选出3种染料(cibacron blue、reactive green19和reactive blue4)的aptamer。
尽管ssDNA和RNA有所差别,但SE LEX技术筛选到的ssDNA aptamer与RNA aptamer都是以相同方式识别和结合靶分子,都是通过寡核苷酸链内碱基相互作用折叠形成稳定的特殊三维结构,如发卡、假结、凸环、G2分体等,并构成了与靶分子的特异结合位点。
与一般的亲和作用配体相比,aptamer的亲和力高,特异性强,稳定性好,而且容易制备及修饰。
此外aptamer所针对的靶分子范围极广,蛋白质类分子(受体蛋白、酶、膜蛋白、抗体、生长因子等)、激素、肽、药物分子、糖、有机染料及小分子、无机离子等理论上均存在其对应的aptamer。
Aptamer具有高度的分子识别能力,其与靶分子结合的特异性可与抗体媲美。
由于它是通过化学合成获得,故不仅稳定性明显优于抗体,而且比抗体更容易制备。
在疾病诊断和药物治疗等领域的应用研究中,aptamer与抗体相比,其分子量小,因此更易穿过细胞膜,具有易被血液清除且无免疫原性等突出优点[4]。
因此aptamer被誉为“人工抗体”。
Aptamer的获得依赖于SE LEX技术的应用。
在筛选aptamer过程中,高效快速的分离游离寡核苷酸和aptamer2靶分子复合物是提高筛选速度和效率的关键,也是限制SE LEX技术发展的一个难点。
毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)作为一种微量分析方法已广泛应用于各种生物大分子、药物分子、有机酸和无机离子的分析,且具有分离速度快、分辨率高、操作简单、样品用量少和研究成本低等明显优势。
CE还是研究靶分子与配体亲和作用的重要方法之一。
近几年的研究结果表明CE用于aptamer的筛选可使筛选效率和筛选速度大大提高,是一种新的高效筛选方法(CE2SE LEX)。
2 SE LEX筛选中的分离方法SE LEX技术筛选aptamer的筛选过程是:(1)通过化学合成的方法制备一个寡核苷酸库,对于一个碱基数为n的寡核苷酸库,它包含4n个不同的寡核苷酸序列。
这些单链核苷酸由于链内碱基间的配对、静电作用及氢键作用等发生自身折叠,形成一些稳定的三维空间结构。
(2)将这些具有空间结构的寡核苷酸序列与靶分子作用,结合形成稳定的复合物。
(3)选择适宜的分离方法将结合靶分子的序列与未结合靶分子的序列分离,收集与靶分子结合的寡核苷酸分子。
(4)以结合的寡核苷酸分子为模板进行PCR扩增,获得一个亲和性更强的新的寡核苷酸库。
将此新库用于下一轮筛选,如此进行多次循环,最后对所得的序列进行测序。
在aptamer筛选过程中,随着循环次数的增加,富集到靶分子上的DNA或RNA序列的亲和作用越来越强,直到其亲和作用达到饱和,即富集到的DNA或RNA序列占据了靶分子上所有的结合位点,由此产生了高亲和力的aptamer。
应用SE LEX技术筛选aptamer的关键步骤之一是对结合靶分子的序列与未结合靶分子序列进行高效分离。
亲和色谱是常用的分离方法之一,即将大量靶分子固定在琼脂糖或葡聚糖固定相上,使寡核苷酸库溶液作为流动相通过。
溶液中的寡核苷酸与靶分子发生亲和作用而结合到固定相上,再将结合的寡核苷酸进行洗脱,即可得到aptamer。
在亲和色谱分离中,靶分子能否有效地固定在固定相上以及对aptamer的洗脱决定了分离的效率。
Storm o等[5]以锌指蛋白EG R为靶分子进行aptamer筛选,指出亲和色谱法作为SE LEX技术中的分离方法可以有效地获得更多的DNA结合位点,且aptamer2蛋白质复合物易于与游离DNA分离。
硝酸纤维素膜超滤法是另一种较常用的分离方法。
一定孔径的硝酸纤维素超滤膜可以选择性地截留复合物而使游离的寡・7751・第7Π8期屈 锋等 毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用核苷酸序列通过,从而达到分离结合靶分子的序列与游离序列的目的。
适配体筛选方法研究进展
适配体筛选方法研究进展王巍 贾凌云*(大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系,大连116023)摘 要 利用指数富集配体进化技术(SELEX )可获得与目标靶具有特异性结合能力的适配体(寡核苷酸)。
经过近20年的研究,适配体被证实可在科研及临床应用中部分取代抗体,是有很大发展前景的技术领域。
适配体技术发展的关键在于对目标靶具有高选择性吸附能力的适配体的筛选和获得。
十几年来,以提高筛选效率和效果为目标的适配体筛选技术不断改进,产生了如消减筛选、复合靶筛选、基因组筛选、毛细管筛选等新方法,推动了这一技术的发展。
本文对现有适配体筛选方法进行了系统的评述。
关键词 适配体,指数富集配体进化技术,筛选方法,评述2008-09-08收稿;2008-10-26接受本文系国家自然科学基金(N o .20435020)资助项目*E-m ai:l l y j 81@dlut 1 引 言适配体的概念在1990年由Tuer k 等[1]首次提出,是指利用指数富集的配体进化技术(syste m atic evo l u tion o f li g ands by exponentia l enr i c hm en,t SELEX )从特定的寡核苷酸库中筛选出对目标靶有特异性相互作用的寡核苷酸(DNA 或RNA )。
与传统的抗体相比,适配体具有以下特点和优势:(1)对目标靶分子具有与抗体相当甚至更高的亲和性;(2)可以大量、快速的在体外合成,制备方法更为简单快捷;(3)可以针对不同种类的目标靶进行筛选,包括生物毒性的分子以及只具有半抗原性的分子,拓宽了其应用范围;(4)稳定性优于抗体,利于储存。
基于适配体的上述优良特性,其在疾病检测、药物研发、临床治疗、分析化学、蛋白质组学以及基因表达调控机理研究等多个领域都有着良好的应用前景。
目前,限制适配体技术应用的瓶颈问题仍是适配体的有效筛选技术。
希望通过本篇对现存适配体筛选方法的分析与评述,为进一步解决适配体筛选技术中存在的不足提供参考。
复合靶指数富集的配基系统进化技术研究进展
复合靶指数富集的配基系统进化技术研究进展武振宁;薛书江;杨咏洁【摘要】核酸适配体是一类具有高度特异性和亲和力的单链寡核苷酸,被誉为\"人工单抗\",具有广阔的应用前景.它一般是通过指数富集的配基系统进化(SELEX)技术筛选获得.目前SELEX技术多局限于单一、纯化的可溶性蛋白质靶标.然而,蛋白质的纯化过程繁琐,耗时费力,而且很多靶标(如血清中的低丰度蛋白质或细胞的膜蛋白)很难纯化获得单一纯品.复合靶SELEX技术则可以避免靶标的纯化过程,能够保持靶标的天然构象,并且可以在未明确靶标的组成及结构特性的前提下,通过高通量的盲筛获得一系列特异性核酸适配体.该文主要介绍以未纯化的各种生物样本为复合靶的SELEX技术,以期为核酸适配体的筛选提供新思路.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2018(036)010【总页数】5页(P947-951)【关键词】复合靶;核酸适配体;指数富集的配基系统进化;筛选;综述【作者】武振宁;薛书江;杨咏洁【作者单位】延边大学农学院,吉林延吉 133002;延边大学农学院,吉林延吉133002;延边大学农学院,吉林延吉 133002【正文语种】中文【中图分类】O658核酸适配体是一类新的、具有高度特异性和亲和性的单链寡核苷酸(single-stranded DNA (ssDNA)或RNA),可发生适应性折叠形成特殊的三维结构(如发夹、假结、凸环、G-四分体等)[1]。
这些特殊的三维结构使核酸适配体具有高度的分子识别能力,能够与靶物质特异性结合。
这种特异性可与单克隆抗体相媲美,因此,被誉为“人工单抗”。
除了高度的特异性和亲和力之外,核酸适配体还具有筛选周期短、易制备、易修饰、热稳定性和重复性好、无免疫原性等优点[2]。
基于上述优良特性,核酸适配体在临床诊断[3-6]、药物研发[7,8]、疾病治疗[4,9,10]等领域极具应用前景。
凡是涉及单抗的应用领域,几乎都可以用核酸适配体来取代。
毛细管电泳技术的研究应用
毛细管电泳技术的研究应用作者：貟亚培宋荣娜来源：《山东工业技术》2015年第17期（黄淮学院，河南驻马店 463000）摘要：毛细管电泳（CE）技术是一种方便、快速的分离和分析技术，是当前分析化学前沿领域和研究重点之一，其具有操作步骤简单、分析时间短、检测灵敏度高、环境污染小等优点。
本文介绍了毛细管电泳技术的基本原理和其在中药、食品安全健康、临床医学、生命科学等几个方面的应用及其展望，从而加深对毛细管电泳技术的了解。
关键词：毛细管电泳;原理;应用;展望1 概述毛细管电泳又称高效毛细管电泳，包括电泳、色谱及其交叉内容，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性为根据的液相微分离分析技术。
CE是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析乃至单分子分析成为可能。
1983年，Hjerten先后提出了毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦法，不仅大幅度提高了电泳效率，而且使之可以成为操作自动化，便于进行定性和定量工作。
现在，毛细管电泳已经成为一种相当普遍的微量分离分析方法。
随着相关标准方法的建立和推广应用，毛细管电泳已逐渐成为某些标准和常规的分析方法。
2 毛细管电泳分离技术的基本原理在电场的作用下根据离子的迁移速度不同，以高压电场为驱动力，以内径10-100μm的毛细管为工具对样品组份进行分离和分析，毛细管电泳技术采用熔融石英管毛细管柱，石英管外包裹聚酰亚胺涂层以保持石英管的弹性，毛细管的内径达到微米级。
因此，一方面可以分析量非常少的样品如单细胞组份的分析，另一方面因为比表面积大，横截半径小，具有较快的散热速度，克服了传统电泳散热效率差而不能采用高电场分离的问题。
在毛细管电泳分离过程中，样品分子的迁移是有效电泳速度和电渗速度的综合表现。
由于在毛细管中电渗速度比电泳速度大一个数量级，因此能实现样品组份同向泳动。
3 毛细管电泳技术的应用3.1 在中药方面的应用毛细管电泳技术（CE）应用到药学等领域是在八十年代后期出现的，其最高柱效可达到105个理论板数，最高灵敏度可以达到10-19 mol，有区带电泳，凝胶电泳等多种模式。
适配体
适配体的类型：
★反义核苷酸链 ★随机核苷酸链
反义核苷酸链
通常包含15-20个核苷酸,其碱基组成与 它们的靶序列是互补的。但是在实际应用中, 存在反义寡核苷酸容易被核酸酶降解、对特 定靶位点的识别不够好、有一定毒性等问题, 所以要对适配体中的核苷酸进行了各种各样 的化学修饰。修饰位点一般在碱基、磷酸骨 架等。★
前景与展望
正是基于寡核苷酸适配体的高特异性、高亲和 力、易体外合成及修饰等特性,寡核苷酸适配体可作 为配基应用于靶分子的分离;其高特异性和高亲和力 地与靶分子结合特性使其可应用于靶分子的捕获;适 配体还被用作分子信标定量检测靶分子。适配体在 分析化学,在蛋白质组研究、临床医学、药物研发及 基因调控等领域已经成为重要的研究工具。随着寡 核苷酸适配体的研究进展,以及在多学科之间的广泛 渗透,其在许多领域将具有更广泛的应用前景。
通过筛选获得的特异识别肿瘤细胞的适配 体,本身就可在不需要知道正常细胞和肿瘤细 胞之间的差异成分的情况下,直接用于肿瘤的 诊断和导向治疗。而这些适配体所特异结合 的蛋白质或其它成分正是正常细胞和肿瘤细 胞之间的差异成份,因此只要能够将这些差异 成分进行纯化、鉴定和检测,新的分子标志物 就有可能被发现,它们有可能成为新的特异性 肿瘤标志物。
亲和介质筛选：一些具有亲和表面的介
质也用于适配体的筛选,如琼脂糖、纤维素及 具有亲和表面的小珠或小柱等。利用这些亲 和介质可以筛选一些小分子物质,如金属、毒 素的适配体。 ★
CE-SELEX
毛细管电泳为基础的SELEX技
术(CE-SELEX),在众多改进的适配体筛选方法 中发展较快。该方法最显著的特点是整个筛 选过程只需要4个循环。
SELEX技术大致可以分为以下几步:
①建立寡核苷酸库。 ②适配体的筛选、分离和EX筛选技术
毛细管电泳技术在生物医学领域中的应用
毛细管电泳技术在生物医学领域中的应用随着生物医学领域的不断发展，越来越多的医学研究需要用到高效、准确的分析方法。
毛细管电泳技术作为一种高效、低成本、快速而且对样品无损的检测方法，在生物医学领域得到了广泛的应用。
本文将从毛细管电泳技术的原理、优势和应用方面进行探讨。
一、毛细管电泳技术的原理毛细管电泳技术是利用毛细管内表面电荷的存在、电场的作用和离子在电场中的迁移速度差异，将样品中的各种离子或分子进行分离的一种技术。
毛细管的内壁带有固定电荷，当毛细管两端通以电荷正负相间的电场后，样品中的负离子会被向阳极迁移，正离子则会被向阴极迁移。
由于不同分子的离子迁移速度差异不同，因此，分离出来的分子具有不同的速度，最终在毛细管中形成一道道不同的峰。
二、毛细管电泳技术的优势毛细管电泳技术具有以下优势：1、高效快速：毛细管电泳技术的分离效率高、分离速度快，可在短时间内完成样品分析。
2、高分离效果：毛细管电泳技术的分离效果好，能分离出非常相似的分子，如同构体和同分异构体等，并且可对几百种物质进行同时分离。
3、低成本：毛细管电泳技术所需成本相对较低，并且无需大型设备和复杂的仪器。
4、无损害：毛细管电泳技术对样品不会造成损害，并且可对生物大分子进行分离。
三、毛细管电泳技术在生物医学领域中已经得到了广泛的应用，其中包括：1、蛋白质分离和鉴定：毛细管电泳技术与质谱技术结合，可以快速高效地实现蛋白质的分离和鉴定。
毛细管电泳技术分离出的蛋白质样品可以与其他分析技术结合，如质谱技术，以进行更深入的分析。
2、核酸分离和鉴定：毛细管电泳技术可用于对DNA、RNA、mRNA和寡核苷酸等的分离和鉴定。
在分离和鉴定这些分子时，毛细管电泳技术在速度和准确性方面具有独特的优势。
此外，该技术还可用于药物筛选和基因检测等领域。
3、药物代谢研究：毛细管电泳技术可用于研究潜在的药物代谢通路。
通过毛细管电泳技术的高效分离，可以分离并鉴定药物代谢产物及其结构，并在药效学和毒理学方面提供有用的信息。
基于毛细管电泳的核酸检测技术研究
基于毛细管电泳的核酸检测技术研究核酸检测技术是生物学、医学、环境科学等领域中广泛应用的技术之一。
在当前的公共卫生事件中，核酸检测技术在新冠病毒检测中发挥了重要作用。
毛细管电泳技术是一种基于电动力的分离技术，被广泛地应用于DNA、RNA、蛋白质等大分子的分离和定量。
一、毛细管电泳技术原理毛细管电泳技术是一种基于电动力的分离技术。
其原理是在外加电压的驱动下，带电的溶液在狭窄的毛细管内迁移，满足库仑定律。
库仑定律是一个描述电荷之间相互作用的经典定律，其原理简单而清晰。
异号电荷之间的作用力为吸引力，同号电荷之间的作用力为排斥力，而电荷的大小与电荷之间的距离成反比例。
在电泳实验中，样品分子内的分子量、电荷和电场力是影响分离效果的主要因素。
毛细管电泳速度与分子电荷密度成正比，与分子质量和粘度成反比。
这就使得毛细管电泳技术成为了检测大分子样品分子量、分子结构和化学性质的理想方法。
二、毛细管电泳技术在核酸检测中的应用在核酸检测中，毛细管电泳技术的应用几乎已经普及化了。
其基本步骤包括：DNA或RNA样品进行电泳分离、电流检测、信号收集和数据分析。
毛细管电泳技术可定量检测DNA或RNA的分子量和数量，也可以实现样品的快速、准确、高通量的分析。
尽管毛细管电泳技术已经成为核酸检测领域中的主流技术，但是其仍然存在一些局限。
例如，仅能对某些特定的DNA或RNA进行分析，对于一些形态复杂的分子仍然难以实现快速、高通量的检测。
三、毛细管电泳技术的发展趋势随着生物技术的发展，毛细管电泳技术也在不断地发展和改进。
如今，毛细管电泳技术已经具备一些新的应用和发展趋势。
1. 网络电泳技术网络电泳技术是一种基于网络化点阵电场驱动的电泳技术。
不同于毛细管电泳技术中的一维电场环境，在网络电泳技术中样品受到的是一个三维的电场环境。
这种技术在核酸检测中具有更高的分离分辨率和更高的灵敏度。
2. 微芯片电泳技术微芯片电泳技术是毛细管电泳技术的另一种延伸。
A 毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用
收稿:2008年8月,收修改稿:2008年9月*国家自然科学基金项目(No.20875009)和国家重点基础研究发展规划(973)项目(No.2007CB914101)资助**Corresp onding author e -mail:qufengqu@毛细管电泳在核酸适配体研究及核酸适配体筛选中的应用*屈 锋1**刘 允1任肖敏1赵新颖2张经华2(1.北京理工大学生命科学与技术学院 北京100081; 2.北京市理化分析测试中心 北京100089)摘 要 核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化(SELE X)技术从随机寡核苷酸文库中筛选得到的高亲和性与特异性的寡核苷酸序列配体。
毛细管电泳是高效、快速、低成本的微量分离分析技术。
应用毛细管电泳高效、快速筛选核酸适配体是近几年出现的新方法。
本文介绍了核酸适配体筛选过程中的主要分离方法如亲和色谱、醋酸纤维素膜、凝胶电泳和磁性分离等方法,并对近年来毛细管电泳在核酸适配体中的亲和作用研究以及用于核酸适配体筛选(CE -SE LEX)的主要方法(EC EEM,NECEE M,Non -SELEX 和三者比较)和研究进展进行了综述。
关键词 核酸适配体 毛细管电泳 核酸适配体筛选中图分类号:O65718;Q524 文献标识码:A 文章编号:1005-281X(2009)07P 8-1576-07Application of Capillary Electrophoresis in AptamersStudy and Aptamers SievingQ Feng1**Liu Yun 1 Ren Xiaomin 1 Zhao Xinying 2 Zhang Jinghua2(1.School of Life Science &Tec hnology,Beijing Institute of Technology,Beijing 100081,China;2.Beijing Center for Physical and Chemical Analysis,Beijing 100089,C hina)Abstract Aptamers,DNA or RNA oligonucleotides obtains by syste matic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)from a random oligonucleotide library,which exhibit high affinity and specificity to a wide variety of targets.Capillary electrophoresis,a micro -separation method with advantages of high performance,high speed and lowcost,has been applied in aptamers sieving in recent years.This article introduces the separation methods in aptamers sieving process such as affinity chromatography,nitrocellulose filter,gel electrophoresis,magnetic bead separation and so on.The aptamer affinity interaction studied by capillary electrophoresis,the methods of CE -SELEX (EC EEM,NECE EM,Non -SELEX and comparison of them)in aptamer sieving and advances of CE -SE LEX are reviewed.Key words aptamers;capillary electrophoresis;apta mer sie vingContents1 Introduction2 Separation methods in SELEX3 Studied of aptamers affinity interaction by capillaryelectrophoresis4 Capillary electrophoresis methods in aptamers sieving411 NECEE M 412 ECEE M 413 Non -SELEX414 Comparison of NECEE M,ECEE M and Non -SE LEX 5 Application of CE in aptamers sieving 6 Prospects第21卷第7P 8期2009年8月化 学 进 展PROGRESS I N C HE MISTRYVol.21No.7P 8 Aug.,20091引言SELEX技术(syste matic evolution of ligands by e xponential enrichment),即指数富集配体系统进化技术,通过靶分子与大容量化学合成的随机寡核苷酸(主要是ssDNA和RNA)文库作用,将所形成的靶分子-寡核苷酸复合物与游离寡核苷酸分离,再利用PC R体外扩增技术对形成复合物的寡核苷酸进行扩增。
寡核苷酸适配体的筛选及在农兽药残留检测中的应用
寡核苷酸适配体的筛选及在农兽药残留检测中的应用适配体是一类从随机寡核苷酸文库中筛选出来的可对特定靶分子具有高亲和性和特异识别性的单链短脱氧核糖核酸或核糖核酸序列。
以下是适配体筛选的简要过程：
1. 构建随机寡核苷酸文库。
2. 将文库与靶分子孵育，使文库中的寡核苷酸序列与靶分子结合。
3. 通过特定的分离手段，将结合的寡核苷酸序列与未结合的寡核苷酸序列分开。
4. 经过多轮重复上述过程，富集具有高亲和性和特异识别性的寡核苷酸序列，得到适配体。
在农兽药残留检测中，适配体通常与其他可以产生信号的材料如纳米金、量子点等构成复合探针，或与电化学电极等构成传感器，用于检测食品和环境中的农兽药残留。
此外，还有基于毛细管电泳分离手段的SELEX或非SELEX筛选方法。
其中，基于毛细管电泳(CE)的SELEX具有高效分离选择性特点，使筛选的效率大大提高，一般仅需2\~4轮即可达到SELEX 8\~15轮的富集效率。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询专业人士。
毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究
DOI :10.11895/j.issn.0253⁃3820.181347毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究杨歌 朱超 刘晓慧 王勇 屈锋*(北京理工大学生命学院,北京100081)摘 要 毛细管电泳(CE)被认为是核酸适配体筛选的高效方法,其无需介质固定,在溶液相中完成筛选,分离高效,样品用量少,筛选成本低㊂但由于小分子靶与核酸的结合位点少,且小分子的核酸复合物与核酸库的电泳迁移率差异小,通常认为CE⁃SELEX 不适用于筛选小分子靶标的适配体㊂本研究建立了基于CE⁃SELEX 的盐酸克伦特罗靶标的的适配体筛选方法㊂将80nt 的ssDNA 库与盐酸克伦特罗特混合孵育,通过CZE⁃UV 分离混合物㊂收集ssDNA 库峰前的馏分,通过PCR 扩增和ssDNA 制备,完成第一轮筛选㊂将次级核酸库经过3轮筛选,获得10条ssDNA 序列㊂选择3条亲和力较强的序列Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12,通过CE⁃LIF 测定其与盐酸克伦特罗的K d 分别为9.315×10-7mol /L㊁1.040×10-6mol /L 和1.143×10-5mol /L㊂软件分析表明,上述3条序列均可形成茎环二级结构,其中Apt 4茎环结构的自由能最低,结构最稳定㊂以沙丁胺醇为对照,验证了3条序列,具有较高的特异性㊂关键词 盐酸克伦特罗;核酸适配体筛选;毛细管电泳;毛细管电泳⁃指数富集配体系统进化 2018⁃05⁃24收稿;2018⁃07⁃29接受本文系国家自然科学基金项目(No.21675012)资助*E⁃mail:qufengqu@1 引言核酸适配体(Aptamer)由几十个核苷酸组成,具有分子量小㊁易穿透细胞膜㊁化学性质稳定㊁容易制备和修饰等特点[1~3]㊂适配体结合的靶标范围广泛,包括离子㊁小分子㊁蛋白质㊁细胞和微生物等㊂适配体具有广泛的应用前景和潜在需求,近年来是生物学㊁医学㊁药学和分析化学领域的研究热点之一[4]㊂蛋白质㊁细胞和微生物等靶标的Aptamer 可用于疾病诊断和治疗㊁药物研发㊁蛋白质组学以及基因表达调控机理研究[5]㊂而药物㊁氨基酸㊁抗生素等小分子靶标的适配体通常作为化学和生物传感器的识别分子用于食品和环境检测以及生物分析等领域[6]㊂目前已报道的靶标超过500种,适配体超过2300种[7],但具有实际应用价值的适配体还不多㊂研究者开发了各种新的筛选方法和技术,以提高适配体的筛选效率和适配体的性能[8]㊂毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)作为一种高效㊁快速㊁样品用量少的微量分析方法,在蛋白质的适配体筛选中应用较多(即CE⁃SELEX)[9~12],被认为是核酸适配体筛选的最高效方法㊂其无需介质固定,在溶液相中完成筛选,分离效率高㊁分离速度快㊁样品用量少㊁筛选成本低㊂由于小分子靶标与核酸的结合位点少,亲和力较低,且小分子的核酸复合物与核酸库的电泳迁移率差异小,所以小分子⁃核酸库的复合物分离存在困难,通常认为CE⁃SELEX 用于小分子的适配体筛选有难度㊂目前,仅有Bowser 小组利用CE 筛选N ⁃甲基卟啉二丙酸的适配体的报道[13]㊂本课题组长期从事毛细管电泳筛选多尺度靶标(蛋白质[14]㊁微生物[15]㊁细胞和小分子)的核酸适配体的筛选方法研究㊂盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride,Clen,C 12H 18C l2N 2O ㊃HCl,Mr =313.7g /mol),又称 瘦肉精”,非法使用时可提高猪的瘦肉率,是我国食品安全检测的重要指标㊂本研究建立了CE 筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的系统方法和流程㊂选择80nt 的ssDNA 库与盐酸克伦特罗混合孵育,通过CE⁃UV 分离后,经PCR 扩增和ssDNA 制备,完成一轮筛选㊂重复筛选4轮后,克隆测序获得10条ssDNA 序列㊂选择3条亲和力较强的序列,通过CE⁃LIF 测定其解离常数K d ㊂进一步以分子结构和分子量与盐酸克伦特罗相似的沙丁胺醇(Salbutamol,Sal,C 13H 21NO 3,Mr =239.31g /mol)为对照分子(图1),验证了筛选的序列对盐酸克伦特罗的特异性㊂同时建立了胶体金比色分析(AuNPs)与氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)介导的适配体荧光 猝灭⁃恢复”两种方法,可快速验证所第46卷2018年10月分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第10期1595~1603筛选适配体的亲和力和特异性㊂结果表明,CE⁃SELEX 可用于一些小分子的适配体高效快速筛选,本方NHOH·HClAClH 2NClNHOHBOHHO图1 盐酸克仑特罗(A)及沙丁胺醇(B)的结构式Fig.1 Structural formula of clenbuterol hydrochloride (Clen)(A)and salbutamol (B)法为小分子的适配体筛选提供了参考㊂2 实验部分2.1 仪器与试剂BeckmanP /ACETMMDQ 配紫外和激光诱导荧光(LIF)检测器(美国贝克曼库尔特有限公司);Agilent 7100配DAD 检测器(美国安捷伦科技有限公司);S1000TM Thermal Cycler型PCR 仪㊁iQ TM 5Multicolor Real⁃Time PCR Detection System㊁电泳仪和电泳槽(美国Bio⁃Rad 公司);G:BOX 型凝胶成像系统(美国Syngene 公司);NanoDrop 2000c 紫外⁃可见光谱仪(Thermo Fisher Scientific,USA)㊂熔融石英毛细管(邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司)㊂盐酸克伦特罗(98.5%,Dr.Ehrenstorfer GmbH,Germany);80nt ssDNA 核酸库:5′⁃AGCA GCACAGAG GTCA GATG⁃40N⁃CCTA TGCG TGCT ACCG TGAA⁃3′(两端为20nt 引物区固定序列,中间为40nt随机序列),FAM 标记的ssDNA 库(FAM⁃ssDNA library);引物P1:5′⁃AGCA GCAC AGAG GTCA GATG⁃3′,标记荧光的引物5′⁃FAM⁃P1:FAM⁃5′⁃AGCA GCAC AGAG GTCA GATG⁃3′,引物P2:5′⁃TTCA CGGT AGCA CGCA TAGG⁃3′(生工生物工程(上海)股份有限公司);2×Taq Plus PCR Master Mix (天根生化科技有限公司);TransStart TM Top Green q⁃PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司);核酸染料Gold View(北京鼎国昌盛生物技术有限公司);HCl㊁NaOH㊁NaCl㊁KCl㊁MgCl 2㊃6H 2O(分析纯,北京化工厂);三羟甲基氨基甲烷(Tris,赛默飞世尔公司);氧化石墨烯(GO)溶液(北京拜尔迪生物技术有限公司);实验用水均为某品牌蒸馏水㊂2.2 实验方法2.2.1 溶液配制 以30mmol /L HCl 溶解盐酸克伦特罗,配制成0.8mmol /L 的储备液㊂干粉状核酸库用50mmol /L 硼酸盐溶液(pH 8.2)溶解,配制成100μmol /L 核酸库㊂使用前,将100μmol /L 核酸库在94℃变性10min,然后以0.5℃/s 缓慢冷却至25℃㊂将盐酸克伦特罗与核酸库溶液于37℃孵育30min 后,进行CE 分析㊂2.2.2 毛细管电泳 75μm 熔融石英毛细管(有效长度/总长40cm /50.2cm),首次使用时分别用1mol /L㊁0.1mol /L NaOH 和去离子水分别冲洗30min㊂两次实验间和实验结束后,依次用0.1mol /L NaOH 和H 2O 冲洗5min㊂分析条件:50mmol /L 硼酸盐溶液(pH 8.2),20kV,UV 214nm;LIF 检测激发波长:488nm,发射波长:520nm;进样压力3.45kPa,5s㊂复合物分离收集,15kV,混合物进样6.89kPa,4s㊂收集0~5.9min(Before ssDNA library)溶液至50μL 的PCR 用溶液㊂重复收集2次㊂2.2.3 PCR 扩增条件 (1)常规PCR 扩增增加模板量 因收集的复合物中ssDNA 含量较低,需经PCR 扩增增大模板量,对PCR 需进行条件优化[16](见3.3节)㊂PCR 条件:总体积50μL,2×Taq Plus PCR Master Mix 25μL,300nmol /L 引物P1㊁P2为6μL㊂PCR 条件:94℃预变性1min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循环15次后72℃后延伸5min㊂(2)不对称PCR 制备次级库 将上述PCR 产物经2.2.4方法浓缩和纯化后作为模板,进行不对称PCR 扩增,制备次级核酸库㊂优化的不对称PCR 条件:总体积,100μL,其中2×Taq Plus PCR Master Mix 50μL,引物P1为1.8μmol /L,引物P2为60nmol /L㊂PCR 条件:94℃预变性1min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循环40次后,72℃后延伸5min㊂2.2.4 PCR 产物的浓缩和纯化 PCR 及不对称PCR 后,需对产物进行浓缩和纯化,分别获得不对称PCR 所用的模板或用于下轮次筛选的次级库㊂浓缩和纯化方法:PCR 扩增的DNA 产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳分离,60V,40min;切下所需凝胶转移到1.5mL 离心管中,12000r /min 离心1min,-20℃冰冻20min㊂取出冻结的凝胶立即捣碎后,加入500μL 水,振摇200次㊂向管中加入500μL Tris 饱和醇酚,振摇200次,于4℃以12000r /min 离心15min㊂将上清液加入含有500μL 氯仿⁃异戊醇(24∶1,6951 分析化学第46卷V /V )的1.5mL 离心管中,振摇200次,于4℃以12000r /min 离心15min㊂弃去上清液后,将沉淀置于干净吸水纸,干燥后得到核酸序列,用于后续筛选或不对称PCR㊂2.2.5 核酸序列分析与亲和力表征方法 (1)核酸序列由奥美德诺(北京)基因科技有限公司测定使用DNAMAN 软件(Lynnon Biosoft,USA)分析序列的二级结构㊂(2)以CE⁃LIF 表征亲和力 测定加入Clen 前后,ssDNA 峰面积的变化百分数(RA)为:RA(%)=(I 0-I 1)/I 0×100%,其中,I 0为1μmol /L ssDNA 的峰面积,I 1为加入不同浓度Clen 后的ssDNA 峰面积㊂RA 越大,表示靶标与ssDNA 的相对亲和力越强㊂(3)平衡解离常数K d 测定 1μmol /L ssDNA 中加入不同浓度(0~20μmol /L)Clen,计算RA,利用软件GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.San Diego,CA),按照1∶1结合模型,对RA 随Clen 浓度变化的非线性饱和曲线拟合,求算解离常数㊂2.2.6 AuNPs 比色分析验证亲和力 (1)AuNPs 制备 采用柠檬酸盐还原法制备AuNPs,加热100mL 1mmol /L HAuCl 4溶液至沸腾;而后在同步搅拌下快速注射194mmol /L 柠檬酸钠溶液2mL,沸腾15min 后取出反应烧瓶,并将反应溶液在缓慢冷却至室温㊂(2)AuNPs 比色分析方法分析核酸序列亲和力 在96孔板中,将25μL 0.1μmol /L 的核酸序列分别与等体积且浓度为0.1㊁0.2㊁0.5㊁1㊁2㊁5和10μmol /L 的Clen 室温孵育15min,加入10μL 900mmol /L NaCl 溶液,观察胶体金溶液颜色变化㊂(3)520和620nm 处吸光度测定 使用紫外⁃可见光谱仪测定AuNP 溶液在520和620nm 波长处的吸光度㊂2.2.7 GO⁃毛细管电泳法分析验证亲和力 (1)孵育缓冲溶液配制 孵育缓冲溶液为20mmol /LpH 7.4Tris⁃HCl,50mmol /L K +,100mmol /L Na +,5mmol /L Mg 2+;(2)样品配制 将GO 溶液用(1)中的孵育缓冲溶液稀释至浓度为60μg /mL,于4℃保存备用;用孵育缓冲液将核酸序列溶液稀释至0.3μmol /L,将Clen 稀释至0.3㊁0.6㊁3㊁6和15μmol /L㊂(3)GO 方法分析核酸序列亲和力 各取稀释后的核酸序列㊁GO 与Clen 溶液10μL,在室温下混合孵育15min 后,通过2.2.2节的CE⁃LIF 方法检测荧光猝灭⁃恢复情况㊂3 结果与讨论3.1 筛选流程图2为Clen 的适配体筛选流程㊂CE 分离和收集靶标⁃ssDNA 复合物组分后,进行PCR 扩增和ssDNA 浓缩和纯化,用于不对称PCR 的模板㊂不对称PCR 扩增后,浓缩和纯化的产物为次级库,用于下一轮筛选㊂各轮次级库用CE⁃LIF 表征筛选效率㊂经过4轮筛选的产物采用克隆测序得到适配体序列㊂利用CE⁃UV,通过RA 初步比较其与盐酸克仑特罗的亲和力㊂选择亲和力较好的序列,通过CE⁃LIF CE seperationClenHeterogeneousPCRAffinity characterization with Clen by CEAs sublibraryDNA products characterizationby CEConcentrationand purificationAsymmetric PCRConcentrationand purificationssDNA library图2 CE 筛选Clen 适配体的流程图Fig.2 Clen aptamer screening process based oncapillary electrophoresis (CE)测定各序列的解离常数K d ㊂3.2 Clen 与ssDNA 库孵育混合物的CZE 分析UV 检测下,Clen 和80nt ssDNA 库分别在中性标记物DMSO 前后出峰(图3A),说明二者在溶液中分别带正㊁负电荷㊂ssDNA 库与Clen 孵育后,游离的Clen 和ssDNA 峰均无明显降低,也未观察到明显的复合物峰㊂LIF 检测下,20nmol /L 的FAM⁃ssDNA 库中加入Clen 后,增加Clen 浓度使ssDNA 库峰面积降低,面积降低百分比为42.65%(图3B)㊂在ssDNA 峰前面,可见产生的包峰,说明二者产生相互作用,形成了复合物㊂因复合物的荷质比小于ssDNA 核酸库,故在ssDNA 核酸库前出峰㊂因此,利用CE⁃LIF 可灵敏检测到ssDNA 库的峰降低以及Clen⁃ssDNA 复合物峰㊂3.3 Clen⁃ssDNA 复合物收集与PCR 条件优化由于ssDNA 核酸库中序列数与多样性可能高达1015,使用的靶标浓度低于ssDNA 时有利于提高各7951第10期杨歌等:毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究 0.042t （min ）A b s o r b a n c e (a .u .)0.060.020.0046810A 205t （min ）R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s301000101520B图3 Clen 与ssDNA 核酸库的毛细管电泳分析:(A)CE⁃UV 检测的电泳图从下往上依次为:DMSO㊁80μmol /L Clen㊁5μmol /L 80nt ssDNA library㊁80μmol /L Clen +5μmol /L 80nt ssDNA library;(B)CE⁃LIF 检测的电泳图20nmol /L FAM⁃ssDNA 库与Clen 混合物分析,Clen 浓度从下往上依次为0㊁160㊁320和400μmol /L,体系在37℃混合孵育30min,室温放置10minFig.3 CE analysis of Clen and ssDNA library:(A)Electrophoretic patterns detected by CE⁃UV,from top tobottom:80μmol /L Clen +5μmol /L 80nt ssDNA library,5μmol /L 80nt ssDNA library,80μmol /L Clen,DMSO;(B)Electrophoretic patterns detected by CE⁃laser inductive fluorescence (LIF)analysis of 20nmol /L FAM⁃ssDNA library and Clen mixture,concentration of Clen is (from bottom to top )0,160,320and 400μmol /L respectively.The system was incubated at 37℃for 30min,and left at room temperature for 10min轮次筛选的次级库收敛度[17]㊂将3.2μmol /L Clen 与20μmol /L ssDNA 等体积混合孵育后进样,收集0~5.9min 的组分(图4A),即ssDNA 库前段包含Clen⁃ssDNA 复合物的馏分㊂为方便收集和增加收集量,进行连续5次收集㊂收集的组分进行PCR 扩增,并优化PCR 的退火温度㊁循环次数条件㊂预设循环数30,分别在退火温度55℃㊁56.5℃㊁58.9℃㊁61.7℃㊁65.6℃㊁68.7℃㊁70.8℃㊁72℃下进行扩增㊂扩0.060.05t （min ）A b s o r b a n c e (a .u .)0.040.030.02A 0.010.00Collection window2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp100bpmB400010CycleP C R p r o d u c t c u r v e f i t R F U30002000C1000002030402t （min ）R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s6040D20004ssDNA products681210080Primers102046810R un 1Run 2Run 3图4 (A)CE⁃UV 收集复合物;(B)PCR 温度优化M:DNA Marker,a ~h 退火温度分别为:a⁃72.0℃,b⁃70.8℃,c⁃68.7℃,d⁃65.6℃,e⁃61.7℃,f⁃58.9℃,g⁃56.5℃,h⁃55.0℃;(C)Q⁃PCR 优化循环数(平行3次);(D)PCR 产物的CE⁃LIF 分析Fig.4 (A)Complex collection by CE⁃UV;(B)Optimization of PCR temperature M:DNA Marker;a-h annealingtemperatures:a⁃72.0℃,b⁃70.8℃,c⁃68.7℃,d⁃65.6℃,e⁃61.7℃,f⁃58.9℃,g⁃56.5℃,h⁃55.0℃;(C)Optimization of the number of cycles by Quantative⁃PCR(parallel 3times);(D)CE⁃LIF analysis of PCR products8951 分析化学第46卷增产物经琼脂糖凝胶电泳分析(图4B),退火温度为58.9~61.7℃时,DNA 条带较亮,且亮度相近,说明PCR 产物量相差不大㊂继续升高温度,则产物条带变暗,产物量减少,因此选择退火温度为60℃㊂本实验通过荧光实时定量PCR(Q⁃PCR)优化循环数㊂产物荧光信号随扩增轮次增加,在第15次循环达到最高值(图4C)㊂对上游P1引物采用5′⁃FAM 标记,其PCR 产物可经CE⁃LIF 检测㊂由图4D 可见,过剩的P1引物峰和扩增产物dsDNA 的峰,二者迁移时间有明显差异㊂产物中仅有引物峰和dsDNA 峰,说明优化的PCR 条件下,没有副产物ss⁃dsDNA 形成㊂而高灵敏的CE⁃LIF 可用于快速检测PCR 体系中的P1引物㊁PCR 产物以及副产物,辅助PCR 条件优化㊂3.4 制备次级文库通过不对称PCR 扩增制备ssDNA 次级库㊂将3.3节的PCR 产物经浓缩和纯化后,作为次级库制备的不对称PCR 的模板,进一步扩增得到大量ssDNA㊂优化不对称PCR 的上下引物比例,可控制扩增生成的ssDNA㊂考察上下游引物浓度比P1∶P2分别为20∶1㊁30∶1和40∶1时的扩增情况,经过40循环数扩增㊂如图5A 所示,P1∶P2=30∶1时能够获得更多的PCR 产物,且不对称PCR 产物与80nt ssDNA 库条带的位置一致,未产生其他序列㊂由于不对称PCR 反应后的混合体系复杂,不能直接用作次级库进行后续筛选,需对不对称PCR 产物中的单链ssDNA 进一步浓缩和纯化㊂按2.2.4节的方法浓缩纯化ssDNA,对其进行CE 表征,纯化产物为单一的信号峰,且与对照的ssDNA 库迁移时间一致(如图5B),说明纯化效果较好㊂本研究以纯化后的不对称PCR 产物ssDNA 作为次级库并用于下一轮次的筛选㊂3.5 4轮筛选的ssDNA 库与Clen 的亲和力比较将4轮筛选分别制备的ssDNA 次级库(0.5μmol /L)与80μmol /L Clen 混合,以ssDNA 峰面积变化RA 为指标比较多轮筛选的ssDNA 的亲和力,RA 越大,靶标与ssDNA 的亲和力越强㊂如图5C 所示,1~3轮,次级库与靶标的亲和力随筛选轮次增加㊂4轮筛选后,核酸结合比例有所降低,说明亲和力已不再提高㊂3轮筛选的亲和力最优与[9,10,13,18]报道一致,说明CE⁃SELEX 的筛选效率高,3轮筛选即可获得亲和力最优的适配体㊂考虑到轮次筛选少可能引起ssDNA 序列的多样性,会给后续测序带来高成本,并考虑后续研究的结果比较,本研究采用了第4轮筛选的产物进行序列分析和亲和力评价㊂5.0t （min ）A b s o r b a n c e (a .u .)B0.07.5Purified secondary ssDNA library12.515.0A200bp 100bp 50bp2.510.010滋mol/L ssDNA library80LibCycleR e l a t i v e a f f i n i t y (%)6040C200Round 1Round 2Round 3Round 40.100.080.060.040.020.00图5 (A)不对称PCR 的引物浓度比例优化,M:DNA Marker,A⁃C 上下游引物浓度比分别为:a⁃20∶1,b⁃30∶1,c⁃40∶1;(B)CE⁃UV 表征纯化后次级核酸库;(C)各筛选轮次ssDNA 库与Clen 的亲和力比较Fig.5 (A)Primer concentration ratio optimization for asymmetric PCR,M:DNA Marker,A⁃C upstream and downstream primer concentration ratio:a⁃20∶1,b⁃30∶1,c⁃40∶1;(B)CE⁃UV characterization of the purifiedsecondary ssDNA library;(C)Affinity comparison of ssDNA library and Clen in each screening round 3.6 筛选序列分析与亲和力测定3.6.1 筛选序列的相对亲和力比较 将第4轮筛选产物进行克隆测序,得到10条序列,如表1所示㊂用软件DNAMAN 8.0(Lynnon Biosoft,USA)计算各序列的碱基组成,发现(G+C)含量普遍较高,与文献[6]报道一致㊂将1μmol /L ssDNA 与80μmol /L Clen 25℃混合孵育10min,加入Clen 后,ssDNA 与Clen 结合形成复合物,使游离ssDNA 减少,峰面积降低㊂通过CE⁃UV 分析,比较加入Clen 前后ssDNA 峰面积变化RA 比较各序列的相对亲和力㊂由表1可见,RA 值最大的3条序列为Apt 4㊁Apt 7和9951第10期杨歌等:毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究 表1 筛选序列及相对峰面积(%)Table 1 Screened sequences and relative peak area (RA)序号No.序列组成Sequences碱基含量Base percentageA%C%G%T%RA (%)Apt 1P1⁃GCCCGCATGCACTCCGGTAA AGATATGTGG TGTAATTTTC⁃P225.023.827.523.814.05Apt 2P1⁃ATGCCTTGCCAATCATGCTGTTCGAGATGGGAACTCCTTC⁃P223.826.326.323.8-7.63Apt 4P1⁃AGGGCCTGGGCTGTTGAGGCAACGTCGGTTTGTTTATTAA⁃P222.520.032.525.024.6Apt 5P1⁃CCATGGGGCAGTAGTCTTTCCACGCGTGTTTCTAACGGTG⁃P221.325.030.023.818.18Apt 6P1⁃GATACGCTGATGCCCACCGTAGCGTTGTTGGTTTACACGC⁃P222.526.328.822.511.44Apt 7P1⁃CACCATGCCAACTCGTCTGTATAACGACTATCACCTCGTC⁃P226.331.321.321.335.56Apt 9P1⁃GACTAGTCTTGGAGAGACTCAGAAGGCGGAGGTCAAGTAC⁃P228.821.332.517.5 6.05Apt 10P1⁃TACGGTGGGTGTAAATTTGGCGAGCCATCCTTTCCTTAGG⁃P222.522.530.025.09.74Apt 11P1⁃GGTGAGTCGCAAGGCCTCAA AGTAGGCTTATTGACATCTG⁃P226.322.530.021.3 1.78Apt 12P1⁃GGGCAAGAACGTAGACGTGACCCTGGTATTGGATTAGTTG⁃P225.015.035.025.040.53P1,P2分别为20nt 的固定引物序列:P1:5′⁃AGCA GCAC AGAG GTCA GATG⁃3′;P2:5′⁃CCTA TGCG TGCT ACCG TGAA⁃3′.Apt 12,初步确定它们与靶标的亲和力强于其它序列㊂3.6.2 序列的平衡解离常数测定 利用高灵敏的CE⁃LIF,测定Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12的解离常数K d ㊂在1μmol /L FAM 标记的Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12中分别加入0~20μmol /L Clen,测定RA㊂利用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.San Diego,CA )软件,按照1∶1结合模型,拟合RA 随Clen 浓度变化的饱和曲线(图6),求得Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12的解离常数K d 依次为9.315×10-7mol /L㊁1.040×10-6mol /L㊁15010020Clen （滋mol/L ）R A （%）500Apt 12406080100K d =1.143×10-5mol/L R 2=0.9953150100R A （%）50Apt 4K d =9.315×10-7mol/LR 2=0.98665Clen （滋mol/L ）0101520251501005Clen （滋mol/L ）R A （%）50Apt 7010152025K d =1.040×10-6mol/L R 2=0.9902图6 序列的解离常数K d 计算及二级结构Fig.6 Calculation of K d and secondary structure of the sequence0061 分析化学第46卷1.143×10-5mol /L,其与文献[8]报道的小分子适配体的解离常数的数量级基本一致㊂Apt 4的K d 最小,与Clen 的亲和力最高㊂使用DNAMAN 8.0模拟Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 123种序列的二级结构,其自由能分别为-37.24㊁-27.63和-21.99kJ /mol,三者均能形成茎环结构(图6)㊂Apt 4的亲和力更强,可能是由于其茎环结构更稳定㊂150100Apt 4B m a x （滋m o l /L ）50Apt 7Apt 12Clen Sal图7 三条序列结合盐酸克伦特罗与沙丁胺醇的B max 比较Fig.7 B max comparison of three sequences combined with Clen and salbutamol3.7 适配体的特异性验证以分子结构和分子量与Clen 相似的沙丁胺醇(Sal),分析适配体序列的特异性㊂利用CE⁃LIF 测定加入Sal 后的峰面积变化RA%,分析不同浓度沙丁胺醇与3条序列的相互作用㊂利用GraphPad Prism 6拟合饱和曲线,分别得到其最大结合量B max ,并与Clen 靶标的结果比较(图7)㊂3条序列与Clen 的B max (>100μmol /L)均明显高于与Sal 结合时的B max(Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12分别为2.22㊁9.58和17.61μmol /L)㊂说明3条序列Apt 4㊁Apt 7㊁Apt 12与Clen 的结合具特异性,且Apt 4的特异性较其它两条序列更高㊂3.8 AuNPs 比色法分析适配体亲和力与特异性在25μL AuNPs 溶液中加入等体积的0.1μmol /L 适配体,室温混合孵育15min 后,加入NaCl 溶液,AuNPs 因适配体保护而不发生沉聚,故其颜色保持酒红色㊂在适配体包被的AuNPs 溶液中,分别加入0.1㊁0.2㊁0.5㊁1㊁2㊁5和10μmol /L 的Clen,室温孵育15min 后加入NaCl 溶液,结果可见,随着Clen 浓度增加,AuNPs 溶液颜色由酒红色逐渐转变为蓝色(图8A )㊂当Clen 浓度为0.2μmol /L 时,结合了Apt 440.0A 520/A 6203210.10.20.512510Apt 4Apt 7Apt 12C Clen (滋mol/L)BCApt 4ClensalApt 12ClensalApt 4Apt 12Clen (滋mol/L)00.10.20.512510A图8 AuNPs 比色分析适配体亲和力与特异性:(A)Clen 浓度对AuNPs 溶液颜色影响;(B)Clen 浓度增加对AuNPs 溶液A 520/A 620的影响;(C)Apt 4与Apt 12的特异性分析(重复3次)Fig.8 Analysis of aptamers affinity and specificity by AuNPs colorimetry:(A)Effect of Clen concentration on color of AuNPs solution;(B )Effect of increasing Clen concentration on A 520/A 620of AuNPs solution;(C)Specificity analysis of Apt 4and Apt 12,repeated 3times1061第10期杨歌等:毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究 的AuNPs 溶液转变为紫色,而加入Apt 7或Apt 12时,Clen 浓度为0.5μmol /L 时AuNPs 转变为紫色㊂说明靶标与Apt4的亲和力高于Apt7㊁Apt12,与CE 测定亲和力结果一致㊂分别在520和620nm 波长处测定AuNPs 溶液吸收值(图8B)㊂Clen 浓度为0~0.5μmol /L 范围时,A 520/A 620的比值随Clen 浓度增加而降低㊂进一步通过AuNPs 比色分析表征适配体的特异性㊂在3条适配体中选择亲和力最高的Apt 4与最低的Apt 12进行特异性比较,结果如图8C 所示㊂吸附了Apt 4㊁Apt 12的AuNPs 溶液中分别加入1μmol /L 的Clen 与Sal,加入1μmol /L Clen 的AuNPs 溶液呈蓝色,而加入1μmol /L Sal 的AuNPs 溶液仍保持酒红色,说明Apt 4㊁Apt 12均不能结合Sal,两条适配体具有特异性㊂3.9 GO⁃毛细管电泳法分析适配体亲和力通过GO 毛细管电泳法,进一步验证Clen 与适配体的亲和力㊂将0.1μmol /L 3种适配体分别与20μg /mL GO 在室温条件下缓冲体系中混合孵育15min,再在孵育溶液中分别加入0.1㊁0.2㊁1㊁2和5μmol /L 的Clen㊂分别对适配体㊁适配体/GO 溶液㊁适配体/GO /Clen 溶液进行CE⁃LIF 检测㊂结果如图9所示,在0.1μmol /L 适配体中加入20μg /mL GO 时,适配体的荧光发生猝灭,其峰面积降低达98%以上㊂进一步加入Clen 时,随Clen 浓度增加,荧光强度逐渐恢复㊂加入5μmol /L Clen 时,荧光几乎完全恢复㊂上述结果表明,与GO 结合的适配体,因Clen 加入而从GO 上脱落,Clen 从GO 上竞争结合适配体,说明其与适配体具有更强的相互作用㊂3条适配体中,Apt12的荧光恢复程度最低,说明其与Clen 的亲和力最弱,与CE 方法和纳米金比色法一致㊂t （min ）R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s101２８642200150100500BApt 7t （min ）R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s101２８642200150100500AApt 4t （min ）R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e u n i t s101２８642020012080400CApt 12160图9 GO⁃毛细管电泳法比较适配体与Clen 结合的亲和力:(A)Apt 4;(B)Apt 7;(C)Apt 12;电泳图从下向上为:0.1μmol /L 适配体;0.1μmol /L 适配体+20μg /mL GO;适配体/GO+0.1μmol /L Clen;+0.2μmol /L Clen;+1μmol /L Clen;+2μmol /L Clen;+5μmol /L ClenFig.9 Comparison of affinity of aptamers to Clen by GO⁃capillary electrophoresis:(A)Apt 4;(B)Apt 7;(C)Apt 12;Electrophoresis pattern of CE⁃LIF detection from bottom to top:0.1μmol /L Aptamers;0.1μmol /L Aptamers +20μg /mL GO;Aptamers /GO+0.1μmol /L Clen;+0.2μmol /L Clen;+1μmol /L Clen;+2μmol /L Clen;+5μmol /L Clen4 结论建立了基于CE⁃UV 和CE⁃LIF 筛选和分析盐酸克伦特罗的核酸适配体的方法㊂CE 不仅可用于适配体序列的分离,还可用于PCR 产物的分离和表征,以及靶标与各轮筛选次级库的亲和力表征㊁适配体序列的亲和力和特异性分析㊂结果表明,建立的CE⁃SELEX 方法可用于适配体的高效快速筛选㊁筛选过程的条件优化及筛选效率表征㊂本研究拓展了CE⁃SELEX 在小分子靶标的核酸适配体筛选中的应用,也为建立核酸适配体的标准筛选方法奠定了基础㊂References1 Ellington A D,Szostak J W.Nature ,1990,346(6287):818-8222 Tuerk C,Gold L.Science ,1990,249(4968):505-5103 Kahn J S,Hu Y,Willner I.Acc.Chem.Res.,2017,50(4):680-6902061 分析化学第46卷4 QIN Shi⁃Ya,CHEN Nan⁃Di,WANG Qing,HUANG Jin,HE Xiao⁃Xiao,LIU Jian⁃Bo,GUO Qiu⁃Ping,YANG Xiao⁃Hai,WANG Ke⁃Min.Chinese J.Anal.Chem.,2017,45(12):1795-1803覃诗雅,陈南迪,王青,黄晋,何晓晓,刘剑波,郭秋平,羊小海,王柯敏.分析化学,2017,45(12):1795-18035 Meng H M,Liu H,Kuai H,Peng R Z,Mo L T,Zhang X B.Chem.Soc.Rev.,2016,45(9):2583-26026 Zhou W,Huang P J,Ding J,Liu J.Analyst ,2014,139(11):2627-26407 McKeague M,McConnell EM,Cruz⁃Toledo J,Bernard ED,Pach A,Mastronardi E,Zhang X,Beking M,Francis T,Giamberardino A,Cabecinha A,Ruscito A,Aranda⁃Rodriguez R,Dumontier M,DeRosa M C.J.Mol.Evol.,2015,81(5⁃6):150-1618 McKeague M,DeRosa M C.Nucleic Acids Res.,2012,2012(4968):7489139 Mosing R K,Mendonsa S D,Bowser M T.Anal.Chem.,2005,77(19):6107-611210 Mendonsa S D,Bowser M T.Anal.Chem.,2004,76(18):5387-539211 Berezovski M,Drabovich A,Krylova S M,Musheev M,Okhonin V,Alexander P.J.Am.Chem.Soc.,2005,127(9):3165-317112 Dembowski S K,Bowser M T.Analyst ,2018,143(1):21-3213 Yang J,Bowser M T.Anal.Chem.,2013,85(3):1525-153014 Qian L,Zhao X,Liu H,Feng Q.J.Chromatogr.A ,2014,1364:289-29415 Meng C,Zhao X,Qu F,Mei F,Gu L.J.Chromatogr.A ,2014,1358:269-27616 Musheev M U,Krylov S N.Anal.Chim.Acta ,2006,564(1):91-9617 Jing M,Bowser M T.Anal.Chem.,2013,85(22):10761-1077018 Mendonsa S D,Bowser M T.J.Am.Chem.Soc.,2005,127(26):9382-9383Screening of Clenbuterol Hydrochloride Aptamers Basedon Capillary ElectrophoresisYANG Ge,ZHU Chao,LIU Xiao⁃Hui,WANG Yong,QU Feng *(School of Life Science ,Beijing Institute of Technology ,Beijing 100081,China )Abstract Capillary electrophoresis based systematic evolution of ligands via exponential enrichment (CE⁃SELEX)was reported as a homogeneous efficient method for high⁃affinity selection of aptamer,with several merits involving screening in free solution without nonspecific binding,capable of high⁃efficient separation,low⁃sample consumption,and saving money.There are few studies regarding the aptamer selection against small molecule using CE⁃SELEX,resulting from the aspects of less binding sites and the negligible variety of its complex with nucleic acid in the electrophoretic mobility.In this study,the aptamer selection wasperformed towards a small molecule target of clenbuterol hydrochloride (Cle )by CE⁃SELEX.In brief,incubated Cle and an 80nt ssDNA library were firstly incubated,and CZE⁃UV approach was used to separate complex and random ssDNA.The complex was then collected into a vial followed by PCR amplification.Through three round selections,the third pool was selected to clone and ten sequences were finally obtained.The dissociation constants (K d )of three potential candidates (Apt 4,Apt 7and Apt 12)were determined by CE⁃LIF,and showed high affinities of 9.315×10-7mol /L,1.040×10-6mol /L and 1.143×10-5mol /L,respectively.The m⁃Fold software analysis showed that the above three sequences could form stem⁃loop structure,and Apt 4gave the lowest free energy and the most stable ing salbutamol as a control,three selected aptamers were verified with high specificity.Keywords Clenbuterolhydrochloride;Aptamerselection;Capillaryelectrophoresis;Capillaryelectrophoresis based systematic evolution of ligands by exponential enrichment(Received 24May 2018;accepted 29July 2018)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.21675012)3061第10期杨歌等:毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究 。
试论毛细管电泳及其在种子科学领域的应用
试论毛细管电泳及其在种子科学领域的应用摘要：本文简要介绍了毛细管电泳技术的原理、特点、检测方法及其影响因素。
着重探讨了毛细管电泳在种子科学领域的应用前景，主要包括毛细管电泳在品种鉴定、种子遗传学、种子生物技术、种子营养成分、离子成分及农药残留分析等方面的应用。
关键词：毛细管电泳;种子科学;应用毛细管电泳法CapillaryElectrophoresis，CE，是2O世纪8O年代问世的一种高效液相分离法，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。
目前，它已成为能与20世纪50年代末、6O年代初出现的气相色谱GC以及20世纪70年代初出现的液相色谱HPLC相媲美的一种分离技术，并被认为是当代分析科学最具活力的前沿研究课题[1]。
毛细管电泳法因其分离效率高、分析速度快、样品用量少、抗污染能力强及易自动化等特点而被广泛应用于分子生物学、医学、药学、高分子等领域，尤其在生物分析及生命科学领域中已展示了诱人的应用前景口]。
1毛细管电泳原理及其特点毛细管电泳泛指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术D]。
毛细管电泳仪的基本结构包括一个高压电源，一根毛细管，一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。
毛细管电泳仪的工作原理：毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在pHi3情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成一双电层。
在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体朝负极方向移动的现象叫电渗。
粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流EOF两种速度的矢量和。
正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出;中性粒子的电泳速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度;负离子的运动方向与电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离L4]。
与经典电泳相比，毛细管电泳法克服了由于焦耳热引起的谱带宽，柱效较低的缺点，确保引入高的电场强度，改善分离质量Is]，具有分离效率高、速度快和灵敏度高等特点，而且所需样品少、成本低，更为重要的是，它又是一种自动化的仪器分析方法[a3。