固相萃取技术及其在N-亚硝胺分析中的应用

固相萃取技术及其在N-亚硝胺分析中的应用摘要：固相萃取（SOILD PHASE EXTRACTION，简称SPE）是近年来快速发展的样品前处理技术,由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来,其原理是根据萃取组分、样品基质及其它成分在固定相填料上作用力强弱的不同而使它们彼此分离,达到样品分离富集的目的。

与液液萃取法(Liquid-Liquid Extraction, LLE)相比,处理水样量大、使用有机溶剂量少,是水中痕量富集的理想途径。

本文介绍了固相萃取技术的原理、操作过程并综述了固相萃取技术在N-亚硝胺分析中的研究进展及应用。

关键词：固相萃取；N-亚硝胺；分析方法N-亚硝胺是亚硝基化合物中的一种，其一般结构为R2（R1）N-N=O。

N-亚硝胺在通常条件下不易分解。

在中性和碱性环境中较稳定，但在特定条件下也发生反应，如N-亚硝基二甲胺在盐酸溶液中加热70～110℃即可分解，除了盐酸外，Br2、H2SO4加KMnO4、HBr 加冰乙酸都可作为去亚硝化剂[1]。

N-亚硝胺在紫外光照射下，N=O基可以裂解，紫外光解反应在酸性水溶液或有机溶媒中都能进行。

此外，某些N-亚硝胺具有挥发性。

这样一种在温和的条件下极稳定的物质，具有高致癌性。

迄今为止，已发现的N-亚硝胺中90%左右可诱发动物不同器官的肿瘤。

此外，这类物质还具有致畸，致突变以及神经毒性等生物毒害。

人群中流行病学调查表明，人类某些癌症，如胃癌、食道癌、肝癌、结肠癌和膀胱癌等可能与N-亚硝胺有关[2]。

从理论上讲，由于大多数食品都含有蛋白质，以及氮氧化物在环境中的分布广泛，这两点使得几乎所有的食品都有产生N-亚硝胺的可能，但是胺类物质只有在蛋白质腐败分解时才会产生，所以蛋白质丰富且容易腐烂的食品是高含量N-亚硝胺的主要风险，肉制品和水产品中N-亚硝胺的含量就成为人们关注的焦点。

已有报道，在奶酪[3] [4]、鱼肉制品[5]、烘烤肉制品[6-9]和火腿[10]等食品中都检测到至少一种N-亚硝胺存在。

考虑到N-亚硝胺的毒性及其存在的广泛性，饮用水中N-亚硝胺的定性、定量分析一直是研究的热点问题。

挥发性亚硝胺的测定中，样品前处理方法随着分析仪器的发展而逐渐变化，从一开始的水蒸气蒸馏，到后来的矿物油萃取，固相萃取，再到现在的固相微萃取技术（SPM E），发展趋势是更加简便、快速、安全，同时也使分析结果更加的精确。

固相萃取法，又有人称之为固液萃取法(Solid Liquid Extraction, SLE)是八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。

目前最常使用的是键合硅胶柱及聚合树脂柱。

与传统的液液萃取法(Liquid-Liquid Extraction, LLE)比较，SPE具有明显的优势。

首先，在LLE中乳化是一种时常发生的现象。

萃取过程一但发生乳化，将严重影响结果的重现性。

而在SPE 中则不存在这个问题。

其次，LLE的另一个主要缺点是回收率的高低在很大程度上取决于操作人员对该技术掌握的熟练程度。

也就是说，同。

由八十年代中期开始，一项发展较快的样品前处理技术是目前最常使用的是键合硅胶柱及聚合树脂柱。

与传统的液液萃取法(Liquid-Liquid Extraction, LLE) 比较，SPE 具有明显的优势。

首先，在LLE中乳化是一种时常发生的现象。

萃取过程一但发生乳化，将严重影响结果的重现性。

而在SPE中则不存在这个问题。

其次，LLE的另一个主要缺点是回收率的高低在很大程度上取决于操作人员对该技术掌握的熟练程度。

也就是说，同样一个方法，不同操作者所得到的结果可能差异很大。

这将影响方法的推广，也难以进行实验室的质量控制和标准化。

而SPE是基于分析物功能团和固相填料功能团之间的作用力将分析物萃取出来的，其萃取结果稳定、方法很容易在实验室之间转移，有利于标准化。

此外，固相萃取法还有许多优点：如选择性强、分离时间短、使用有机溶剂少等等。

目前在国际上SPE技术已在许多领域里逐渐取代LLE。

SPE 的最突出的优点之一是便于自动化，而SPE的自动化使繁所、复杂、费时的样品前处理发生了一个飞跃性的变化。

固相萃取技术能够与气相（GC）、气相-质谱（GC-MS）、气相-热能分析仪（GC-TEA）、液相（HPLC）、液相-质谱仪（HPLC-MS）联用，可使分析的检出限达到μg/L~ng/L量级。

1 SPE的基本原理固相萃取是一个包括液相和固相的物理萃取过程。

在固相萃取过程中，固相对分析物的吸附力大于样品基液。

当样品通过固相柱时，分析物被吸附在固体填料表面，其它样品组份则通过柱子。

分析物可用适当溶剂洗脱下来。

SPE的基本原理和HPLC相同，但目的则完全不同。

HPLC是要在短时间内将各化合物分离并保持好的峰形。

而SPE是要从复杂的基液中分离人们感兴趣的化合和物并将其浓缩，以便进行进一步的分析。

因此，传统的SPE柱填料的颗粒往往比HPLC柱的填料颗粒要大的多(一般在40Å)，而且是不规则的颗粒以增加接触样品的表面积。

目前用的最广泛的是键合硅胶柱(BONDED SILICA COLUNM)，其次是聚合树脂柱。

固相萃取是靠固体填料上的键合功能团与待分离化合物之间的的作用力将目标化合物与基液分离达到样品净化浓缩的目的的。

因此，在进行固相萃取时吸附剂和分析物之间作用力是必须考虑的。

1.1 非极性作用力非极性作用力存在于吸附剂功能团的碳氢键和分析物的碳氢键之间。

即Van der Waals 力。

因为大多数有机分子都在一定程度上具有非极性结构。

非极性作用力常被用于分析物的分离。

最常见的非极性吸附剂是C8、C18。

图1 非极性作用力一般来说，非极性萃取比极性或离子交换萃取选择性差。

非极性作用力常被用于同时萃取多种不同的化合物。

基液的极性大有利于非极性吸附剂与非极性化合物之间的作用力。

如水溶液。

相反，这种非极性作用力可被具有一定程度非极性特征的溶剂破坏。

1.2 极性作用力极性作用力包括：氢键、偶极力/偶极力、诱导偶极力、π-π等。

如：–OH、-NH3、-SO3，羰基、芳香环及含氧、氮、硫、磷等杂原子的基团。

硅胶本身的性质(没有键合的-OH)决定了极性作用力存在于全部键合硅胶材料，并在非极性溶剂中最明显。

非极性环境有利于吸附剂和分析物之间的极性作用力；极性环境有利于破坏吸附剂和分析物之间的极性作用力；环境离子强度大也不利于吸附剂和分析物之间的极性作用力。

图2 极性作用力1.3 离子作用力离子作用力是发生在具有相反电荷的分子功能团之间的作用力。

对于有机化学来说，人们更加关心的是带电荷的有机化合物。

在一定的pH条件下，有机分子可以呈离子状态。

图3 离子作用力环境的pH对离子作用力影响很大，为了有效地利用离子交换机理将分析物吸附在固相柱上，必需满足两个条件：环境的pH必需使分析物和吸附剂带相反电荷；环境不能含有高浓度带有和分析物相同电荷的竞争化合物。

有机化合物的pKa值是决定环境pH值的重要依据—有机分子功能团的pKa 值为50%的该功能团在溶液中呈离子化时的pH值。

在应用离子交换作用力进行萃取时还必须考虑离子强度和选择性。

低离子强度有利于分析物的吸附，高离子强度有利于分析物的脱附。

离子交换剂选择性的强弱取决于其功能团的性质。

如：丁胺(强阴离子交换剂)对柠檬酸阴离子的吸附力为对醋酸根阴离子的250倍。

因此，用醋酸根阴离子溶液处理的丁胺吸附剂对分析物的吸附力远比用柠檬酸阴离子溶液处理的丁胺吸附剂强。

反之,柠檬酸阴离子溶液是一个好的洗脱剂。

全部键合硅胶填料都会存在一定程度的未键合的硅醇基。

因此，离子作用力作为附作用力一定存在。

1.4 多种作用力几乎全部的键合硅胶都存在多于一种以上的作用力。

因此，在考虑固相萃取方法时应该综合考虑各种作用力对萃取过程的影响。

2 固相萃取的基本程序固相萃取的基本程序可分为以下五个步骤。

但在实际应用时可根据最后分析手段对样品的要求对这五个步骤进行增加或减少。

比如，当使用离子交换原理进行样品萃取时就需要增加调节萃取体系pH的步骤。

图4 固相萃取基本步骤示意图2.1 固相柱的预处理为保证良好的萃取再现性，固相柱必需用适当的溶液进行预处理。

对固相柱进行活化，展开碳氢链增加和分析物作用的表面积。

对固相柱进行清洗，除去柱上吸附的对分析有影响的杂质。

要注意，在加样于固相柱前预处理好的固相柱必需保持湿润。

2.2 添加样品将样品加于固相柱中，用正压或负压使样品通过柱子。

样品的流速必需控制, 对于生物样品，一般在1.5 ml/min。

对于以离子交换为作用机理的萃取，样品通过SPE柱的速度应该适当的降低，以保证分析物有足够的时间与SPE柱填料的离子交换功能团发生作用。

2.3 固相柱的洗涤用当的洗涤剂选择性地附力弱的脱杂质而留分析物于柱上。

洗涤剂的选择也取决于最后的分析手段。

2.4 固相柱的干燥如最后的洗脱剂为缓冲溶液或水溶性有机溶剂，而分析手段为反相HPLC，固相柱上的残留水对分析影响不大。

但是，当非水溶性有机溶剂为洗脱剂或分析手段又为GC或GC-MS时，固相柱的干燥就特别重要。

2.5 固相柱的洗脱在选择洗脱溶剂时必须考虑以下两个因素：洗脱剂必需有足够强度，以最小用量将分析物洗脱下来；洗脱剂必需有足够的选择性只将分析物洗脱，而将吸附力强的杂质保留在柱上。

在选择洗脱溶剂时，可以通过改变溶剂的极性指数、溶剂强度、溶剂选择性来达到最好的分离效果。

3 SPE在N-亚硝胺测定中的应用近年来，N-亚硝胺类消毒副产物样品的预处理大多采用SPE技术。

活性炭是应用最多的一类SPE吸附剂，Jenkins等[11]首次使用Ambersorb 572作为SPE填料，分析饮用水中的亚硝胺类化合物。

由于NDMA是亲水性物质，增加了从水中萃取的难度，而Ambersorb 572 能很好的吸附亚硝胺类化合物，尤其是NDMA,因此很快成为了饮用水中亚硝胺类化合物分析的首选[12-15]。

其他用于亚硝胺类化合物分析的活性炭还包括椰子壳活性炭[16]，炭黑[17,18]，Ambersorb 348F[19]，Supelclean ENVI-carb[20]，碳基薄膜[21]，活性碳纤维毡[22]和中性活性炭[23]。

其中椰子壳活性炭是EPA标准方法中使用的吸附剂。

椰壳活性炭萃取9种N-亚硝胺的平均回收率最高，虽然对毒性低的NDPhA的萃取回收率很低，但是对潜在致癌性很高而且在水样中检出率也很高的NDMA的回收率达88%，显著高于其他2种材料。

对NDEA的回收率也达88%，满足分析要求。

近年来,一些研究者将两种不同性能的吸附剂结合,试图寻找对较大极性范围的亚硝胺类化合物都有很好的回收率。

Cheng等[20]系统的研究了一系列SPE吸附剂，比较了不同吸附剂对饮用水中8种亚硝胺类化合物的吸附能力,包括两种活性炭（Ambersorb 572 和Supelclean ENVI-carb），两种反相吸附剂（LC-18和Oasis HLB）和两种反相吸附剂与离子交换吸附剂（Oasis MCX 和Oasis MAX）结合使用,结果发现Ambersorb 572与ENVI-carb 结合使用对8种亚硝胺类化合物具有较好的回收率（76%-95%）。