实验三PCR扩增制备目的基因
扩增目的基因实验报告
扩增目的基因实验报告一、实验目的本次实验的主要目的是通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增特定的目的基因，以便后续的基因分析、克隆和表达等研究工作。
二、实验原理PCR 技术是一种在体外快速扩增特定 DNA 片段的方法。
其基本原理基于 DNA 半保留复制的机制，通过高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤的循环进行。
在高温下，双链 DNA 模板解链成为单链；在低温下，引物与单链模板结合；在适温下，DNA 聚合酶以引物为起始点，沿着模板链合成新的 DNA 链。
经过多次循环，目的基因得以大量扩增。
三、实验材料与设备1、材料模板 DNA：含有目的基因的基因组 DNA 或 cDNA 片段。
引物：根据目的基因的序列设计的一对特异性寡核苷酸引物。
dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：包括 dATP、dCTP、dGTP 和dTTP。
Taq DNA 聚合酶。
PCR 缓冲液。
无菌去离子水。
2、设备PCR 仪。
微量移液器。
离心管。
电泳仪。
琼脂糖凝胶。
四、实验步骤1、反应体系的配制在无菌的离心管中，依次加入以下成分：模板 DNA：＿____ng上游引物：＿____μM下游引物：＿____μMdNTPs：各_____mMTaq DNA 聚合酶：＿____U10×PCR 缓冲液：＿____μL无菌去离子水补足至总体积_____μL2、 PCR 反应条件设置预变性：95°C 5 分钟变性：95°C 30 秒退火：根据引物的退火温度，一般为 55 65°C 30 秒延伸：72°C 30 秒 1 分钟（根据目的基因的长度而定）循环次数：一般为 30 35 个循环终延伸：72°C 5 10 分钟3、 PCR 产物的检测配制 1 2%的琼脂糖凝胶。
取适量的 PCR 产物与上样缓冲液混合，点样于琼脂糖凝胶的加样孔中。
以适当的电压进行电泳，观察 PCR 产物的条带。
五、实验结果与分析1、电泳结果经过电泳，在凝胶成像系统中观察到了预期大小的条带，表明目的基因成功扩增。
基因工程实验-biochemlab
实验二 基因组总ＤＮＡ提取
一、实验目的
掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。
生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。
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五、思考题
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如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？
01
实验目的
02
掌握重组质粒的转化方法
03
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实验六 重组质粒的转化
转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。
化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。
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ＤＮＡ重组、转化 ＭＨＣ与pMD18-T连接 DH5a感受态细胞制备
转化、平板涂布、培养
筛选与鉴定 抗生素抗性筛选 挑单菌落培养 提取质粒 质粒酶切、电泳检测
2.微量移液器的使用
将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头
DNA重组生物实验报告
DNA重组生物实验报告课程名称：_生命科学导论实验课_ 指导老师：______成绩：__________________实验名称：__基因工程实验__ 实验类型：__生物实验_______同组学生姓名：__一、实验目的和要求基因工程实验是生物实验中极具代表性的一部分，在此次实验中有如下目的和要求：1、通过本实验了解和掌握含GFP基因质粒的提取和琼脂糖DNA电泳的等十个小实验组合而成的基因工程实验的原理和技术。
2、了解生物实验的完整流程，对实验室基本操作规范与仪器设备使用方法得到初步了解，从而建立系统、有条理的实验思路。
3、培养实验动手能力，在实践中加强对专业知识的认知与体会，融汇贯通，寓学于用，感受生物学科的魅力。
二、实验内容和原理基因工程又称DNA重组技术，是将不同来源的基因按照预先设计的蓝图，在体外构建成杂种DNA分子（又称重组DNA分子），然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种和生产新产品等。
基因工程技术为生命科学的研究提供了有力的手段，同时为以基因工程技术为核心的现代生物技术产业的建立奠定了扎实的基础。
基因工程技术建立的标志性实验是：①1972年，美国斯坦福大学的伯格(P.Berg)等人将猿猴病毒SV40的DNA和大肠杆菌λ噬菌体DNA分别进行EcoRI酶切，然后用T4DNA连接酶将两个酶切片段进行连接，率先完成了人类历史上第一个DNA分子的体外重组实验，因此荣获了1980年的诺贝尔化学奖。
②1973年，美国斯坦福大学的科恩（S.Cohen）等人在体外构建了含四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒，并将其导入大肠杆菌中，获得了双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。
上述两大科研成果标志着基因工程技术的诞生。
一个典型的基因工程技术包含以下几个步骤：1.目的基因和载体DNA的获取。
2.目的基因和载体DNA的限制性内切酶的酶切消化。
3.酶切后的目的基因和载体DNA的体外重组连接，以获得重组DNA分子。
实验三PCR扩增制备目的基因PPT课件
利用生物信息学软件对PCR产 物进行序列比对、基因注释、
结构预测等分析。
结果解读与讨论
目的基因扩增成功与否
杂带和引物二聚体的处理
根据电泳结果判断目的基因是否成功扩增 ，如果没有扩增出目的基因或扩增效果不 佳，需要检查实验条件和引物设计。
如果电泳结果显示有杂带或引物二聚体， 需要优化PCR条件或重新设计引物，以确保 获得更纯净的目的基因产物。
10×PCR Buffer
04 提供PCR反应所需的离子环境
。
DNA模板
05 含有目的基因的DNA片段。
去Hale Waihona Puke 子水稀释PCR反应体系。06
设计引物
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引物设计原则
选择合适的引物，确保引物与 目的基因的特异性结合，避免
非特异性扩增。
引物长度
通常为15-30个碱基。
引物序列
根据目的基因序列，利用引物 设计软件进行设计。
pcr 技术的应用领域
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遗传疾病的诊断
通过PCR技术可以检测出 人类基因突变，从而对遗 传疾病进行诊断。
病原微生物检测
PCR技术可以快速、准确 地检测出细菌、病毒等病 原体，为疾病预防和控制 提供有力支持。
基因克隆和表达
通过PCR技术可以克隆出 目的基因，并在体外进行 表达和纯化，为基因工程 研究和应用提供基础。
05
pcr 扩增实验结果分析
结果分析方法
琼脂糖凝胶电泳
通过观察电泳结果，判断PCR 产物的大小是否与预期一致， 并判断是否有杂带或引物二聚
体。
测序验证
将PCR产物进行测序，与预期 的基因序列进行比对，验证 PCR产物的准确性。
目的基因扩增实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增特定DNA序列的方法，广泛应用于分子生物学领域。
目的基因扩增实验是分子生物学实验中的一项基本技能，通过PCR技术可以将微量的目的基因片段扩增到足够数量，便于后续的基因克隆、基因表达、基因测序等研究。
本实验旨在通过PCR技术扩增目的基因片段，并对扩增结果进行鉴定。
二、实验目的1. 掌握PCR技术的基本原理和操作步骤；2. 学会设计引物和优化PCR反应条件；3. 通过琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定。
三、实验材料1. 实验试剂：PCR试剂盒、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板、上下游引物、10×PCR缓冲液等；2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、恒温水浴箱等；3. 实验耗材：无菌离心管、DNA纯化柱、琼脂糖凝胶、电极等。
四、实验方法1. 引物设计：根据目的基因序列，设计特异性引物，确保扩增片段长度适中，避免非特异性扩增。
2. PCR反应体系配置：按照PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系，包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液等。
3. PCR反应程序：根据实验目的和引物Tm值，设计合适的PCR反应程序，通常包括预变性、变性、复性、延伸等步骤。
4. PCR反应：将配置好的PCR反应体系放入PCR仪中，按照预定的PCR反应程序进行扩增。
5. 琼脂糖凝胶电泳：将PCR扩增产物与DNA Marker进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增产物条带。
6. 结果分析：根据电泳结果，判断目的基因是否成功扩增，并分析扩增产物的大小和纯度。
五、实验结果1. 电泳结果：在琼脂糖凝胶电泳中，观察到目的基因片段的条带，其大小与预期结果相符。
2. 结果分析：根据电泳结果，可以确定目的基因成功扩增，扩增产物大小为预期值。
六、实验讨论1. 引物设计：引物设计是PCR实验成功的关键因素之一，需要根据目的基因序列设计特异性引物，避免非特异性扩增。
实验三PCR扩增制备目的基因
实验三PCR扩增制备目的基因概念反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。
区分:反转录与逆转录不等同。
反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。
二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。
2反转录酶与反转录过程反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。
合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。
反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。
人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶。
在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。
大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。
①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。
此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。
反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。
②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA 形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。
③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。
除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。
反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。
用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。
pcr技术扩增目的基因的步骤
pcr技术扩增目的基因的步骤
PCR（聚合酶链式反应）技术是一种用于扩增特定DNA 片段的技术。
以下是一般PCR 技术扩增目的基因的步骤：
1. 设计引物：根据目的基因的序列，设计一对特异性的引物。
引物是一小段DNA 序列，与目的基因的两端互补。
2. 制备模板DNA：从含有目的基因的样本中提取DNA 作为模板。
可以使用各种方法，如苯酚-氯仿提取法或商业试剂盒。
3. 反应体系准备：将模板DNA、引物、PCR 反应缓冲液、dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）、DNA 聚合酶等试剂按照适当的比例混合在一起，形成PCR 反应体系。
4. 热循环：将反应体系放入PCR 仪中，进行热循环。
热循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，模板DNA 被加热至高温，使双链DNA 解开成为单链。
在退火步骤中，温度降低，引物与模板DNA 互补结合。
在延伸步骤中，温度再次升高，DNA 聚合酶开始合成新的DNA 链。
5. 循环次数：热循环通常进行多个循环，每个循环包括变性、退火和延伸步骤。
循环次数取决于目的基因的长度和扩增效率。
6. 产物分析：经过一定的循环次数后，PCR 反应产生大量的扩增产物。
可以通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法对产物进行分析，以确认目的基因的扩增。
PCR 技术的具体步骤和条件可能因不同的实验目的和设备而有所差
异。
在进行PCR 实验之前，建议仔细阅读相关的实验指南和操作手册，并根据实际情况进行调整。
PCR扩增目的基因
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3.结果观察
高度灵敏的荧光染色剂 染色效果好 操作方便 稳定性差 强致癌剂 中度毒性
取样进行琼脂糖凝胶电泳 溴化乙锭（EB）染色 观察DNA条带
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六、注意事项
1、PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有
必要进一步优化反应条件，包括改变退火 温度和时间，调整Mg2+浓度等。
2、PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA 聚合酶和dNTP的量不宜过多。
• 聚合酶链式反应是一种体外DNA扩增技术 ，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和 应用广泛等特点。
• PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程 ，是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已 知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷 酸作为引物，引物序列将决定扩增序列片 段的特异性和片段长度。
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• 标准的PCR过程分为三步：
pcr扩增目的基因一实验目的1掌握pcr扩增dna的技术与原理2学习pcr扩增仪的使用二实验原理聚合酶链式反应是一种体外dna扩增技术具有灵敏度高特异性强操作简便和应用广泛等特点
任务二： PCR扩增目的基因
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一、实验目的
1、掌握PCR扩增DNA的技术与原理 2、学习PCR扩增仪的使用
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二、实验原理
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2、TaqDNA聚合酶（5U/μL），10×扩增 缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买。
3、引物（100pmol/L）：设计并合成与目的 DNA两侧互补的引物。
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五、实验操作
（1）按序将如下成分混合置 于Eppendorf管内
1.准备PCR反应溶液
a.10×扩增缓冲液 10μL b.4×dNTPs 8μL c.引物11μL d.引物2μL e.模板DNA 1μL（10ng） f.TaqDNA聚合酶μL （2.5U） 加水至Ｖ终＝100μL
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反转录
概念
反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。
区分:反转录与逆转录不等同。
反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。
二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。
2反转录酶与反转录过程
反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。
合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。
反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。
人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA 病毒，含有反转录酶。
在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。
大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。
①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。
此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。
反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。
②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。
③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。
除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。
反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。
用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。
反转录的简要过程表示如下：
反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNADNA杂交体。
随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。
至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。
3生物学意义
反转录的发现有重要的理论意义和实践意义。
（1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充，修正后的中心法则表示为：是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。
也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。
这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。
某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）。
有些病毒（如阮病毒，即疯牛病病毒）以蛋白质直接形成蛋白质。
（2）在致癌病毒的研究中发现了癌基因，在人类一些癌细胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中，也分离出与病毒癌基因相同的碱基序列，称为细胞癌基因或原癌基因。
癌基因的发现为肿瘤发病机理的研究提供了很有前途的线索。
（3）在实际工作中有助于基因工程的实施。
由于目的基因的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成DNA用以获得目的基因。
RNA反转为cDNA
10μl体系
mix2μl
RNA500ng
Add O
to 10μl
H
2
PCR 程序
37 ℃10min
85℃5s
稀释产物即可用于后续实验。
实验三 PCR扩增制备目的基因
1．目的
学会PCR操作的基本技术。
2．原理
是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。
再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。
其中<25nt的引物退火温度T m=2（A+T）+4（G+C）。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。
4．试剂
3U/μl Taq D NA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌dd water。
5．实验准备
dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，1000´溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10´
加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）合成的引物：Sense primer Antisense primer 目的基因模板质粒待扩增的NK片段长度
6．操作步骤
（1）在0.2ml PCR 微量离心管中配制20μL反应体系。
（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）
dd water 13.9μL
10×PCR buffer（含MgCl2）2μL
2.5mmol/L dNTP 2μL
Primer1 0.5μL
primer2 0.5μL
模板质粒 1μL
3U/μl Taq酶 0.1μL（3u）
总体积 20μL
（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：
① 94℃ 3min ② 94℃ 30sec ③ 55℃ 30sec ④ 72℃ 1min
⑤ goto② 35 times ⑥ 72℃ 10min
（3）PCR结束后，取10μL产物进行琼脂糖凝胶电泳。
观察胶上是否有预计的主要产物带。
（4）清理桌面，撰写实验报告。
（5）PCR产物可以直接与T载体连接，然后转化感受态细胞。
7．思考
（1）复性温度如何确定？
（2）为什么要在最后延伸10min？
（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？
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