免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项以下是免疫荧光双标操作方法及注意事项的详细介绍：方法：1.样品制备：a.细胞：将培养皿中的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，并以适当浓度悬浮于PBS（磷酸盐缓冲液）中。
b.组织：从动物体内取出组织样本，用PBS洗涤并切成适当大小的块。
2.固定：a.细胞：用适当浓度的乙醛在室温下固定细胞。
b.组织：用适当浓度的乙醛固定组织样本，然后在PBS中冲洗。
3.渗透：a.细胞和组织：将样本浸泡在PBS-T（含0.2%的肌凝蛋白酶）中，进行渗透处理，以增强抗体的渗透性。
4.阻断：a.使用几何草酸或明胶作为非特异性蛋白质的抗原来阻止非特异抗体的结合。
5.主抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的一抗（特异抗体），孵育样本，可以在室温或4°C条件下进行。
6.洗涤：a. 用PBS-T或TBST（含0.1%的Tween 20）进行多次洗涤，以去除未结合的一抗。
7.次抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的二抗（荧光标记的抗体），与一抗结合后，通过固定区域与目标蛋白进行特异结合。
8.洗涤：a.用PBS-T或TBST进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。
9.核染色/细胞膜染色：a.加入DNA染色剂（如DAPI）或细胞膜标记（如细胞膜标记染料），用于定位目标蛋白。
10.显微镜观察：a.将样本放置在玻片上，用荧光显微镜观察并拍照或记录图像。
注意事项：1.温度控制：孵育和洗涤过程中，适当控制温度可以提高抗体结合的特异性和效率。
2.抗体稀释倍数：需要根据实验要求和试剂手册推荐的稀释倍数来使用抗体。
3.阻断剂的选择：根据实验要求选择适当的非特异性蛋白质抗原来阻断非特异抗体的结合。
4.试剂保存：将抗体和荧光标记物保存在适当的低温条件下，避免暴露在光和高温下。
5.孵育时间：一抗和二抗的孵育时间需要根据试剂手册推荐的时间来进行。
6.具体细胞/组织类型的处理：不同的细胞或组织在样品制备和处理过程可能需要略微不同的方法，可以参考试剂手册或已发表的方法。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是一种常用的免疫学研究方法，可以用于检测和定位抗原或抗体在细胞或组织中的表达和定位。
免疫荧光操作步骤及注意事项如下：步骤1：样品制备1.收集需要检测的细胞或组织样品。
2.如有需要，固定细胞或组织样品以保持其形态和抗原性。
3.如有需要，对组织样品进行切片以便于检测。
步骤2：抗体选择和标记1.根据需要选择合适的一抗和二抗，一抗用于识别目标抗原，二抗用于与一抗结合并携带荧光标记。
2. 选择合适的荧光染料或荧光标记，常用的有荧光素色素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
3.根据供应商指南或经典实验文献中的方法，进行抗体标记。
步骤3：荧光标记试剂的制备1.根据推荐的配方或说明书，在标记试剂的缓冲液中加入合适的荧光染料或荧光标记，并进行充分混匀。
2.如有需要，可以在标记试剂中加入其他辅助试剂以增强染色强度或减少非特异性结合。
步骤4：样品孵育1.将样品均匀分布在载玻片或孵育板上，并使其附着。
2.加入一抗和二抗的混合物，并在暗处孵育一段时间，通常在室温下孵育1-2小时或在4°C下孵育过夜。
3.如果需要，可以在抗体孵育结束后进行染色或共孵育其他标记试剂。
步骤5：洗涤1.在孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤样品，以去除未结合的抗体和其他杂质。
2.洗涤次数根据需要，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤时间约5分钟。
步骤6：显微镜观察和成像1.将标本置于显微镜上，并使用荧光显微镜或倒置显微镜观察荧光信号。
2.使用合适的荧光滤光片或滤片盒，选择适当的波长来显现荧光染色。
3.根据需要，使用数字相机或图像分析软件进行图像采集和分析。
注意事项：1.仪器和试剂的准备与操作一定要在无菌和干净的条件下进行，以避免外源性污染或感染的发生。
2.使用抗体和试剂前请仔细阅读供应商提供的说明书，遵守推荐的使用和储存条件。
3.一抗和二抗的选取要慎重，确保其与目标抗原或抗体具有高度特异性。
4.荧光标记试剂的制备要注意在无菌和干净的条件下进行，避免污染或降低荧光标记效果。
免疫荧光双标检测实验流程
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免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项免疫荧光双标技术（Immunofluorescence Double Staining Technique）是一种常用于生物医学研究中的实验技术，通过检测特定抗原和抗体的结合情况，可以对细胞或组织中的蛋白质进行定位和表达研究。
在进行免疫荧光双标实验时，为了确保实验结果的准确性和可靠性，有几个操作要点和注意事项需要特别关注和遵守。
一、试剂准备在开始实验之前，需要准备好以下试剂：1. 抗体：根据实验需要选择适当的一抗和二抗。
一抗用于识别待检测的抗原，二抗则与一抗结合形成免疫复合物，发出荧光信号。
2. 样品：包括细胞、组织等待检测的样品。
3. 荧光染色试剂：根据实验需要选择适当的荧光染色试剂。
常用的有荧光染料如荧光素、多聚荧光素等。
4. 细胞或组织培养基：提供细胞或组织的生长和营养。
二、标本处理1. 样品固定：使用适当的固定液对细胞或组织样品进行固定，一般常用的固定液有乙醛或甲醛。
2. 膜通透：使用适当的溶液对固定后的样品进行膜通透处理，常用的膜通透液有Triton X-100等。
三、抗体反应1. 一抗孵育：将适当稀释的一抗添加到样品中，充分反应一段时间，使一抗与待检测的抗原结合。
2. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的一抗。
3. 二抗孵育：将适当稀释的二抗添加到样品中，与已结合的一抗形成免疫复合物。
4. 再次洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的二抗。
四、荧光染色和观察1. 加入荧光染色试剂：将所选的荧光染色试剂加入样品中，使其与免疫复合物结合。
2. 温度和时间控制：根据荧光染色试剂的要求，控制反应温度和时间，确保荧光信号的强度和稳定性。
3. 洗涤：使用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，去除未结合的荧光染色试剂。
4. 观察和分析：使用荧光显微镜观察样品，记录和分析荧光信号的分布和强度。
注意事项：1. 试剂保存：保持试剂的储存条件和有效期，使用前检查试剂的颜色和透明度，避免使用已失效的试剂。
免疫荧光双标安全操作及保养规程
免疫荧光双标安全操作及保养规程一、前言为了确保实验室工作人员在进行免疫荧光双标实验时能够安全操作，保证实验的准确性和稳定性，同时保养实验设备，延长其使用寿命，制定本规程。
二、安全操作规程1. 实验室基本规定•实验室进出要签到，并且着规定实验服；•实验室内禁止吸烟、喝饮料、食物；•实验结束后，把实验用过的工具和危废物及时处理；•发生意外事故要及时向实验室负责人报告。
2. 个人行为规约•实验操作前，必须认真阅读实验操作步骤和注意事项，并通过实验室负责人审核后方可进行操作；•需要操作有毒、易爆等物质时必须经过特殊的操作程序方可进入实验室；•操作前必须洗手，操作时必须戴手套、口罩、护目镜等防护用品，并尽量避免手触摸面部，如要触摸面部，要先摘掉手套并更换新的手套后再进行操作；•手套应经常更换，在操作前、中、后都应进行更换，特别是在换液、换试剂时；•操作过程中，若涉及到某些物品会产生呛、臭、刺激等气味，必须开启实验室排气设备，保证实验室空气流通；•操作过程中禁止打闹、嬉笑和聊天，尤其是进行危险操作的时候；•若发生意外情况，比如跌倒、化学品泼洒，要及时向负责人报告，按照操作规程处理。
3. 免疫荧光双标实验安全操作规程•保持试验台洁净：实验前应清洗试验台，勿插板、电器、插头、试剂瓶等，以免磕碰而油墨不得之处。
•实验室文明礼仪：实验之前，必须穿上实验服并戴上手套、口罩、护目镜等防护用品，如有发热、头晕等不适症状，不宜进行操作•安全使用荧光显微镜：使用荧光显微镜时，要注意镜片表面不得有灰尘、指纹、油污、水珠等物品附着，以免影响观察效果和仪器寿命。
•实验前充分计划：在进行实验时，应充分计划实验步骤，以保证实验的准确性和可靠性，避免误用试剂。
•妥善处理实验废弃物：实验过程中应注意对废实验酒精、废液体和其他废弃物进行妥善处理，以免影响环境。
三、仪器设备保养规程1. 常规保养•仪器设备要摆放平整，防止水波荡漾而影响实验结果；•仪器设备每天使用后要及时清理，防止污染和损伤；•荧光显微镜镜头应进行定期清洗，清洁剂要使用专用清洁剂，注意不得伤及镜片；•仪器设备的外观应经常擦洗，以保持美观、整洁；•维护仪器设备的正常工作环境，保持恒温、恒湿、恒压等设备常态；•仓储设备用后，应安置在固定位置，以免移动设备时泼洒药物等。
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
免疫荧光 双标
免疫荧光步骤（双标）1.冰冻切片制备将脱水后的脊髓标本放于冰冻托盘上，加OCT使组织被完全包埋，置于冰冻切片机中，调节箱体温度为-22℃，冷冻头温度为-23℃。
观察OCT冻成白色固态状时，将其放置于冷冻头，准备切片。
设置切片厚度为8µm，必要时用刷子辅助将切好的OCT薄片贴附于载玻片上。
室温下晾干载玻片后保存于-20℃冰箱。
2.免疫荧光染色（1）室温下晾干切片15min，待完全晾干后放置于湿盒内，PBS冲洗浸泡5min/次，3次（以除去OGT）。
（2）抗原修复液(1X)（双蒸水稀释），95-100℃加热约20分钟(加热时间可以控制在10-30分钟内)。
20-30分钟内冷却至室温。
PBS冲洗5min/次，3次。
（3）用滤纸吸干玻片上残余PBS，用免疫组化笔在标本周围画一适当大小圆圈，避免接触标本，将配置好的封闭液（5%驴血清=920ulPBS+50ul驴血清+30ul 10%trition）加入圆圈内，室温下封闭1h。
（4）用滤纸吸去封闭液，向标本加入相应一抗：（1%BSA）兔源一标：兔抗IL-33（1：50）小鼠源二标：小鼠抗NeuN（1：500，神经元）小鼠抗GFAP（1：300，星形胶质细胞）小鼠抗OX42（1：100，小胶质细胞）小鼠抗OLIG2（1: 25，少突胶质细胞）一抗于4℃静置过夜孵育。
（5）次日，PBS洗去一抗，10min/次，3次，用滤纸吸干PBS，之后操作均需避光，向标本加入相应二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG（1：300），Dylight 594标记驴抗小鼠IgG（1：300），二抗室温静置避光孵育2h。
（6）PBS清洗二抗，10min/次，3次，清洗后晾干后滴加DAPI封片，加盖玻片后于荧光显微镜下拍摄图片并保存。
计划：1.IL-33组：1）IL-33/NeuN X2个配比浓度2）IL-33/GFAP X23）IL-33/Iba-1 X24）只孵二抗X22.Sham组：1）IL-33/NeuN X12）IL-33/GFAP X13）IL-33/Iba-1 X14）只孵二抗需要购买：Triton-100，驴血清，一抗：小鼠抗RBFOX3/ NeuN、小鼠抗GFAP、小鼠抗OX42，二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG，BSA(牛血清白蛋白)注意：1、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
免疫荧光经验分享~
免疫荧光经验分享~(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
实验注意事项：1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
最后来说一说免疫荧光的经验之谈！1、合适的细胞密度细胞密度是试验成功的第一步，细胞密度太大，会造成细胞过于拥挤而边界不清晰，不仅细胞形态不佳且易导致染色背景深。
同理细胞过少时不仅容易贴壁不好观察时不好找细胞，而且由于细胞过少可能活性不佳从而易发生非特异性荧光染色。
不管是用六孔板还是共聚焦皿细胞密度以达到75%-85%最佳。
2、细胞固定和通透固定剂的选择依赖于抗原的亚细胞定位（膜蛋白，可溶，细胞骨架相关蛋白等）。
3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛是最常用的固定剂，适用于绝大多数蛋白。
如果是研究膜蛋白的话，最好用3.7%-4%的甲醛。
而研究细胞骨架成分可用甲醇固定法。
固定后一般需要通透步骤，通透即是在膜上打孔，让抗体更易进入细胞与抗原结合。
选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。
通透一般可以用0.1%-0.2%的Triton-X 100，而选择甲醇固定一般无需再通透，甲醇本身就有通透的作用。
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免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
来源：生物谷 2008-6-27 访问量：9826
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一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化，不同点如下：
1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS （1：1）。
5、条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久。
6、荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。
7、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照。
二、注意事项
1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
2、每次试验时，需设置以下三种对照：
（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物
（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物
（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
三、免疫荧光双标的经验之谈
1、选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，secondary antibodies则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2、我的做法是两种primary antibodies同时孵育，然后两种secondary antibodies同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要认真摸索，我感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好，背景比较干净。
3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4、Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清，我的是10%正常donkey血清。
5、其余同一般操作。
原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞：在骨发生形态蛋白—{诱导下，乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白Islet—1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共
聚焦显微镜观察)
1．一步双染色法先将两种荧光标{己抗体按适当比例混合(A+B)，按直接法进行染色。
2．二步双染色法先用TRITC标记的A抗体进行免疫荧光染色，再用FITC标记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果A抗原呈现橘红色荧光，而B抗原呈现黄绿色荧光。
在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。
例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化—抗兔IgG。
进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。
孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化—抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC—抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。
其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。
此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。
换言之，混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。
若两种一抗种属来源相同，必须分两次进行双重染色，即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对B抗原进行染色，否则会出现交叉反应而使染色无特异性。
双重免疫荧光标记法
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗
B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。