15生物化学实验琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用
实验2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察
实验2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察（一）原理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在。
琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢，产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水。
在缺氧的情况下，若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用。
如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
琥珀酸+ 甲烯蓝琥珀酸脱氢酶延胡索酸+ 甲烯白无氧条件丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。
若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。
如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
（二）试剂1．1.5%琥珀酸钠溶液：称取琥珀酸钠1.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。
如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后，以氢氧化钠溶液中和至pH7~8。
2．1%丙二酸钠溶液：称取丙二酸钠1g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。
3．0.02%甲烯蓝溶液。
4．1/15mol/LNa2HPO4溶液：取Na2HPO4 · 2H2O 11.8g，用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml。
5．液体石蜡。
（三）操作1．猪心脏制备液：称取新鲜猪心1.5~2.0g放组织捣碎机中，加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml，捣碎成浆，再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液，放置1小时，不时摇动，离心取上清液备用。
2．取4支试管，编号并按下表操作：试管心脏制备液 1.5%琥珀酸钠溶液1%丙二酸钠溶液蒸馏水0.02%甲烯蓝溶液（滴）（滴）（滴）（滴）（滴）1 5 5 －10 22 5 5 －10 2（先煮沸）3 5 5 5 5 24 5 10 5 5 23．各管溶液混匀后，每管各加液体石蜡一薄层（约5~10滴）。
实验三：琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 南京医科大学
3、丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FAD
FADH2
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎＋海沙（研磨成糜状）
＋12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) （两次，研成糊状）；纱布过滤
２、酶促反应及竞争抑制作用
试剂（滴） １ ２ ３ ４ ５
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4--
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀，加石蜡5滴隔绝空气， 37℃水浴
保温，观察褪色情况。（斜执试管，沿壁缓慢加， 不要产生气泡）
四、结果、讨论： 阴性对照
编号 １
２
３
４
５
时间
10min
20min
30min 40min 50min 60min
褪色快
不褪色 褪色缓慢 不褪色 不褪色
五、注意事项：
1 、充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清 洗，注意回收。
2 、滴加液体石蜡。(实验结束,试管用洗衣粉刷净) 3 、观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制[原理]肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。
反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。
丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。
丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。
抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。
本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。
CH2COOHCH2 COOH FAD MB•2H（甲烯白）琥珀酸琥珀酸脱氢酶CHCOOHHOOCCH FADH2MB（甲烯蓝）延胡索酸[试剂]1．0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。
2．0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。
3．0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。
4．0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。
5．1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。
（1）1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O （MW：358.14）23.876 克, 加水至1000ml。
（2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml.6．0.02％甲烯蓝溶液7．液体石蜡[主要器材]1．新鲜猪心2．玻璃研钵3．漏斗4．手术剪5．棉花6．恒温水浴箱[操作步骤]1．心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g，用蒸馏水清洗后剪成碎块，置于研钵中，加入适量净沙，研磨成糜状。
再加1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液12ml，研成糊状，用棉花过滤，滤液即为猪心提取液。
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用按抑制类新艺术语
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用按抑制类新艺术语
酯酶的抑制作用：二乙酰丙二酸的作用机制
琥珀酸脱氢酶(EC 1.1.1.35)是酯酶系列中一种重要的蛋白酶，其主要作用是将脂肪酸酯(如甘油酯)和羧酸酯(如肌酸酯)脱氢，以合成其对应的醇和酸。
而二乙酰丙二酸(Ki)是一种具有重要抑制作用的有机酸，它能够有效抑制琥珀酸脱氢酶活力，从而减缓或阻止脂肪酸的脱氢作用。
二乙酰丙二酸的功效机理主要是因为它能够和蛋白质酶特异性结合，抑制酶的活性。
它能够和蛋白质酶中的硫氨基酸残基特异性结合，形成二酰丙二酸硫酰亚铁羧酸复合体，其大小与聚醚聚丙烯酰胺第1聚类似，这样就造成蛋白质酶活性位点的变化，达到抑制作用。
另外，由于二乙酰丙二酸具有很高的抑制效果，因此它也可以用于控制药物的渗透、吸收和分解，从而提高药物的疗效。
综上所述，可以得出结论，二乙酰丙二酸是一种可抑制琥珀酸脱氢酶的有效机制。
它可以通过特异性结合蛋白质酶中的硫氨基，形成二酰丙二酸硫酰亚铁羧酸复合体，从而抑制脂肪酸脱氢作用，有效提高药物的疗效，从而达到降低脂肪含量的目的。
生化实验课 琥珀酸脱氢酶
五．实验结果记录
试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 试管6 [I]/[S] 0 0.1 1 10 0 0 褪色时间（分钟）
六．注意事项
1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降 低。 2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气 中的氧气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要 倾斜，注意不要产生气泡。 3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空 气中的氧气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重 新氧化成蓝色。 4、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管 的褪色情况。 5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体 石蜡。
二、实验原理
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀 酸竞争，而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶 已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种 现象称为竞争性抑制。如相对地增加琥珀酸的浓度， 则可减轻丙二酸的抑制作用。
三．器材与试剂
1. 器材 大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、 量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、 恒温水箱、电热水浴锅 2. 试剂 0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶 液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L丙二 酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）、 0.02％甲烯蓝、液体石蜡
四.操作步骤
2.取试管6支，编号，再按下表步骤操作：
0.2mol/L 0.02mol/ 0.2mol/L 0.02mol/L 蒸馏水 甲烯蓝 琥珀酸溶 L琥珀酸 丙二酸溶 丙二酸溶液 （滴） （滴） 液（滴） 溶液（滴） 液（滴） （滴） 8 8 4 8 8 3
酶提 磷酸缓 取液 冲液 (ml) (ml) 试管1 2 试管2 2 -
实验5 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
生物化学实验之－－
实验五 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 作用。
【实验原理】
由于丙二酸与琥珀酸结构相似，可以竞争性 地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。 在生物体内，肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶， 能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸，同时放出大 量能量供肌体利用。
【思考题】
1. 为什么酶液的提取要在冰浴中进行？ 2. 各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？
氧化型（蓝色）
【器材与试剂】
（一）器材 1. 恒温水浴锅 3. 研钵 5. 试管架 7. 漏斗 9. 脱脂棉 2. 手术剪 4. 试管 6. 刻度吸管 8. 小白鼠的肌肉 10. 吸水纸
（二）试剂 1. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 2. 0.02mol/L丙二酸钠溶液 3. 0.02mol/L琥珀酸钠溶液 4. 0.01%美蓝溶液 5. 生理盐水 6. 液体石蜡
—
1 2 5
1
— 2 5
—
1 2 5
3. 将各试管摇匀，倾斜试管，沿管壁滴加 液体石蜡5滴，盖在液面，以隔绝空气。置于 370C水浴中保温，随时观察各管中美蓝的褪色 情况，并记录时间，解释结果。
【要点提示】
1. 提取酶液需在冰浴中进行，以防酶失活。 2. 实验过程中，需快速加入试剂，摇匀后迅 速加入液体石蜡。 3. 加液体石蜡的目的是为了使反应液与空气 隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管，沿管壁 加入，不要产生气泡。 4. 加完液体石蜡后，在观察结果的过程中， 不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使美蓝 重新氧化变蓝。
琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察
1.琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察2.紫外分光法测定核酸含量本实验分组为15组，如果为16组，相应材料要增加。
需要的试剂配制方法注意事项1.5%琥珀酸钠溶液7.5g琥珀酸钠→500ml→15小瓶没有琥珀酸钠则用琥珀酸代替后用NaOH调和至PH7.01%丙二酸钠5g丙二酸钠→500ml→15小瓶没有丙二酸钠则用丙二酸代替后用NaOH调和至PH7.00.02%甲稀蓝0.1g甲稀蓝→500ml→15小瓶（棕色瓶）甲稀蓝别名亚甲酰蓝1/15mol/L Na2HPO4 23.6g Na2HPO4 →2000ml→15大瓶石蜡油可以不用分装每个房间在水浴锅前放1个核酸称一定量的小牛胸腺DNA融入0.1%的NaOH5-50ug/mL浓度羊的心脏切碎成小块大约2g左右提前购买，将皮、脂肪处理掉分割后放在冰箱里石英砂均匀的撒在上面注：每三个人一组，分为15组。
如果人数多可以适当多分几瓶试剂。
所需仪器所需数量40ml试剂瓶4560ml试剂瓶15试管4x152x15 共90个移液管（优先10ml的本次用5ml移液管）15研钵15种类数量心脏提取液151.5%琥珀酸钠151%丙二酸钠150.02%甲稀蓝15蒸馏水15液体石蜡 2胶头滴管共77个紫外吸收法测定核酸含量1、实验目的：1.掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理2.掌握利用紫外线分光度计测定核酸含量二、实验原理：DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处紫外线吸收是嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C 一），能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。
等书上112页三、实验试剂与器材DNA样品紫外分光光度计四、实验步骤1.取DNA样品5ml，于紫外分光光度计上测定260nm与280nm处的OD值按下式按下式计算核酸浓度计算核酸浓度 DNA的质量浓度(mg/l)=OD260nm/0.020xL x稀释倍数计算核酸纯度=OD260nm/OD280nm2.取DNA样品5ml，沸水浴中加热5min于紫外分光光度计上，测260nm处的OD值比较DNA前后吸光度OD的差异。
关于实验“丙二酸对琥珀酸脱氢酶竞争性抑制作用”的思考
丙二 酸对琥 珀 酸脱 氢酶 活性 的 抑制 程 度闭 。该实 验 的具 体操
作 见表 １
表 １ 经 典丙 二 酸 对 琥 珀 酸 脱 氢 酶 的 竞 争 性 抑 制 作 用（ 滴 “ ，， ４ 表 示 试 管 号 １２ ３，”
加好 后 摇匀 ，滴 加 石 蜡 隔绝 氧 气 ，７ ３ ℃水 浴 随 时 比较各 管 颜色 退色 顺序 。 果 同前 ， 释 同前 ， 这样 的改 进 可让 学 结 解 但
２经典竞 争 性抑 制验 证 实验 的缺 陷及 改进
通 过 加 入大 量 底物 ， 高 底物 的 竞争 力 ， 除 竞 争 性 抑制 剂 提 消
的抑制 作用 。
１传 统 的 竞 争 性 抑 制 作 用 的 验 证 实 验
经典 实 验 中 ２号 管 加入 的正 常 底 物琥 珀 酸 钠 的 滴数 和 加入 的抑 制 剂丙 二 酸钠 的滴 数相 同 。 管 溶 液丙 二 酸钠 的百 尽 分 比浓度 比琥珀 酸钠 的 百分 比浓 度 低 ， 这 种等 滴数 加 入 的 但
了抑 制剂 的抑制 作用 ， 以退 色速 度 比 ２号 管快 。 见 ， 个 所 可 这
实 验确 实 验证 了竞 争 性抑 制 作 用 的 部 分性 质 ， ： 争性 抑 即 竞 制作 用 的抑 制程 度取 决 于抑 制剂 与 底物 浓 度 的相 对 比例 ， 当 抑 制 剂浓 度 不 变时 ， 加底 物 浓 度 。 减 弱抑 制 剂 的 抑 制程 增 可 度。
情况 下 ， ４号管 底 物 浓度 比 ２号管 增 大 一倍 。因此 部 分 减弱
以通过 透析 、 滤 等物 理方 法 除去 抑制 剂 而恢 复 酶 的活 性 的 超 现象 ： 争性 抑制 作用 是在化学 结构 上 与底 物类 似 ， 与底 物 分子 竞争 性 与酶 分 子 的 能 活性 中 心非 共 价结 合 ， 占据 酶 的活 性 中心 ， 底 物 分 子 无法 使 与酶 的活性 中心 结合 ． 从而 抑制 酶 的活性 『 竞 争性 抑制 剂 的 Ｉ 】 。 抑制程 度取 决 于抑制 剂 与底 物 浓度 的相 对 比例 闭 。当抑 制剂 浓度 不 变时 ， 制程 度 随底 物 浓 度 的增 加 而 减 弱 。 终 可 以 抑 最
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琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用
【目的】
1 ．掌握琥珀酸脱氢酶作用及丙二酸抑制作用的实验技术与原理。
2 ．深化理解酶的竞争性抑制作用的特点。
【原理】
肌肉组织含有的琥珀酸脱氢酶是一种结合蛋白酶，以 FAD 为辅基。
它能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸， FAD 接受氢生成FAD·2H 。
体外实验以美蓝 ( 甲烯蓝 ) 为受氢体，使美蓝还原生成美白 ( 甲烯白 ) 。
其反应如下：
琥珀酸脱氢酶活性越高，美蓝脱色所需的时间越短，由于美白易被空气中的氧氧化成美蓝。
故实验需在无氧条件下进行，可加一层液体石蜡以隔绝空气。
丙二酸与琥珀酸的化学结构很相似，能和琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合，从而抑制琥珀酸的脱氢作用。
其抑制程度与抑制剂和底物二者的浓度有关。
本实验通过不同浓度的琥珀酸和丙二酸来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。
【器材】
1 ．研钵与剪刀
2 ．漏斗
3 ．纱布
4 ．恒温水浴
【试剂】
1 ． 0.2mol/L 琥珀酸溶液
2 ． 0.02mol/L 琥珀酸溶液
3 ． 0.2mol/L 丙二酸溶液
4 ． 0.02mol/L 丙二酸溶液
以上四种溶液均先用 5mol/L NaOH 溶液调至 pH7.0 ，再用 0.01mol/L NaOH 溶液调至 pH7.4 。
直接用琥珀酸钠或丙二酸钠配制亦可。
5 ． 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.4 ）
1/15mol/L Na 2 HPO 4 80.8ml 与 1/15mol/L KH 2 PO 4 19.2ml 混匀即可。
6 ． 0.02% 美蓝溶液
7 ．液体石蜡
【操作】
1 ．肌肉提取液的制备
取用蒸馏水清洗过的新鲜动物肌肉组织约 10g ，置于研钵（或匀浆器）中，研磨成糜状，然后每克肌肉组织加 4 倍体积的冰冷的 pH7.4 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液，混匀，用双层纱布过滤，取滤液备用。
2 ．酶促反应
取试管 5 支，编号，按下表操作。
将上述各试管液混匀后，沿各管壁加入液体石蜡 5 ～ 10 滴，使其在液面形成一薄层以隔绝空气。
置于37 ℃ 水浴中保温，记录各管保温开始时间及美蓝开始脱色的时间。
3 ．计算并解释各管美蓝颜色变化原因。
美蓝开始脱色时间－保温开始时间＝美蓝脱色所用时间。
【注意事项】
1 ．加液体石蜡时宜斜执试管，沿管内壁缓缓加入，不要产生气泡。
2 ．加完液体石蜡后，观察结果过程中，不要振摇试管，以免溶液与空气接触而使美白重新氧化变蓝。
3 ．实验完毕，一定要将试管内的液体石蜡洗净。
【思考题】
1 ．试根据实验现象，说明竞争性抑制作用的特点。
2 ．本实验的设计原则是什么？
3 ．做好本实验的关键环节有哪些？。